Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng bacterial cellulose của vi khuẩn gluconacetobacter

Do sự đa dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được tìm hiểu thêm về vi khuẩn Gluconacetobacter, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều ứng dụng hữu ích của nó, tôi quyết định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2014

Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Ngọc Mai

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Luận văn này không có sự trùng lặp với các đề tài khác

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Ngọc Mai

khuẩn acetic

Bảng 3.2 Khả năng sinh acid acetic của 18 mẫu vi khuẩn acetic

Bảng 3.3 Khảo sát khả năng tạo màng BC của các mẫu vi khuẩn acetic

Bảng 3.4 Khảo sát khả năng tạo màng BC của một số chủng vi khuẩn

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng tạo màng BC Bảng 3.13 Đặc tính của màng BC lên men sau 5 ngày ở 2 lô thí nghiệm Bảng 3.14 Các bước xử lý màng sau lên men

vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa của đề tài 2

5 Điểm mới của đề tài 2

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter 4

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Gluconacetobacter 9

1.2.1 Đặc điểm hình thái, tế bào học 9

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 10

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10

1.2.4 Đặc điểm về sinh trưởng 11

1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 12

1.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 12

1.3.2 Nhu cầu Nitơ của sinh vật 13

1.3.3 Nhu cầu nguồn photpho 14

1.4 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC 17

1.4.1 Đặc điểm cấu trúc của cellulose 17

1.4.2 Đặc điểm cấu trúc của màng BC 18

1.5 Các đặc điểm của quá trình lên men 19

1.5.1 Ảnh hưởng của oxy 19

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 21

vii CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 23

2.1.4 Môi trường nghiên cứu 24

2.1.4.1 Môi trường giữ giống (MT1) 24

2.1.4.2 Môi trường nhân giống (MT2)……… 24

2.1.4.3 Môi trường lên men (MT3)……… 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu………24

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 24

2.2.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc……… 24

2.2.1.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn gluconacetobacter thuần khiết……… 25

2.2.1.3 Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram……… ………… …25

2.2.1.4 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng…….26

2.2.1.5 Phương pháp hoạt hoá giống………26

2.2.1.6 Phương pháp lên men tạo màng……… ………27

2.2.2 Phương pháp xử lý và bảo quản màng BC……….…27

2.2.3 Phương pháp ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm………… 28

2.2.4 Phương pháp toán học……… ……28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… ….31

3.1 Phân lập vi khuẩn Acetic từ màng bia, dịch hoa quả, tuyển chọn các mẫu vi khuẩn Gluconacetobacter 31

3.2 Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Gluconacetobacter 40

viii 3.2.1 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trên kính hiển vi quang học……… 40

3.2.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa……….40

3.2.3 Hoạt tính catalase……….41

3.2.4 Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường Blue bromphenol……….41

3.3 Quá trình lên men tạo màng ……… 42

3.4 Nghiên cứu ảnh hường của một số môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter 45

3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Glucose đến hình thành màng BC 45

3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng BC 50

3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến hình thành màng BC 53

3.5 Xử lý màng sau lên men……… 55

3.6 Ứng dụng màng trong bảo quản thực phẩm………60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………67

1 Kết luận 67

2 Đề nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Màng sinh học (Bacterial cellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất

giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose và sáp nến

do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc Ngoài ra, màng BC còn chứa nhiều dưỡng chất, acid hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác và ngăn cản tác động của tia UV…[2]

Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng BC được coi là nguồn polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau của thế kỷ XIX và hiện được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

như: dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng trong y học làm da tạm thời thay thế da trong quá trình trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da cho con người Đặc biệt trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, màng BC đã được ứng dụng để bảo quản thực phẩm trong thời gian dài ở nhiệt độ phòng [5], [9]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu Do sự đa dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được tìm hiểu thêm về

vi khuẩn Gluconacetobacter, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều ứng dụng hữu ích của nó, tôi quyết định chọn đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của

môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng Baterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter ”

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng BC

từ bia, dịch hoa quả lên men giấm

3.2 Nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 3.3 So sánh khả năng tạo màng BC được tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 với vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC

3.5 Lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 trên môi trường thay thế

3.6 Xử lý và bảo quản màng BC sau lên men

3.7 Ứng dụng màng BC trong bảo quản thực phẩm, thay thế túi nilon

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của

vi khuẩn Gluconacetobacter Nguồn dinh dưỡng quyết định tới khả năng hình

thành màng BC

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu tìm ra chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng tạo

màng BC có chất lượng tốt với chi phí thấp, ứng dụng bảo quản thực phẩm thay thế túi nilon

5 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter được phân lập từ bia, dịch hoa quả lên men giấm, vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên phòng thí nghiệm vi

Vi khuẩn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể

phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép)

Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong các ống thạch

nghiêng, làm vết bôi lên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửu đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram [12]

Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần

5.2.2 Phương pháp hóa sinh

Phương pháp xác định hoạt tính catalase

Phát hiện khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic

5.2.3 Phương pháp toán học

6 Đóng góp của đề tài

Tìm ra môi trường lên men thích hợp tạo màng BC của chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter B2: Glucose 4‰(w/v); pepton 0,4‰(w/v); (NH4)2SO4 0,6‰(w/v); KH2PO4 0,5‰(w/v) và môi trường nước gạo thay thế cho quá trình lên men

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Gluconacetobacter

1.1.1 Vị trí phân loại

Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như Rothenback

1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur

1950 Thuật ngữ “Gluconacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận

thấy các thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn sinh acetic khác nhau [27] Các chủng có Q – 10 là thành phần uniquinone

chính được phân loại trong giống phụ Gluconacetobacter, trong khi Q- 9 là thành phần uniquinone chính trong màng tế bào vi khuẩn Acetobacter Sau đó giống phụ Gluconacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ

Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh khi phân tích một phần trình

tự gen mã hóa 16S rARN Do cách đặt tên Gluconacetobacter chưa đúng quy cách nên Yamada (1998) đã sửa lại tên giống thành Gluconacetobacter nom

corrig, theo khoản luật Rule 61 trong Bacteriological code Ban đầu giống Gluconacetobacter chưa được chấp nhận rộng rãi do được công bố dựa vào

một phần trình tự mà không phải toàn bộ gen 16S rARN Tuy nhiên Frankel

et al (1999) đã xác nhận việc phân loại và đặt tên giống Gluconacetobacter và

đề nghị phân tích trình tự 16S rADN để chuyển các loài đã biết, định danh

nhầm giống Acetobacter vào đúng giống Gluconacetobacter Cuối cùng Yamada (1997) đã kết luận sự hiện diện của giống Gluconacetobacter dựa

vào các đặc điểm phát triển được trên môi trường thạch có nguồn cacbon duy nhất là D- mantose, sở hữu Q – 10 là thành phần uniquinone chính và kết quả phân tích toàn bộ trình tự gen mã hóa rARN Các loài thuộc giống

Gluconacetobacter có đặc điểm hình thái học tế bào khác nhau nhưng không

5

rõ rệt lắm và được phân loại chủ yếu dựa trên mối quan hệ phát sinh loài trên

cơ sở phân tích vùng trình tự 16S rADN và mức độ tương đồng ADN [27]

Theo Bergey (2005) [21], G.intermedius được xếp vào chi

Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae Họ này gồm 6 chi: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Kozakia

Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn

Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau Vì vậy,

đòi hỏi cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này

1.1.2 Đặc điểm hình thái, tế bào học

Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước

khoảng 2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), bắt màu hồng khi nhuộm fucshin chúng có thể tích luỹ 3,5% acid acetic trong môi trường Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá giới hạn cho phép nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn, chúng có thể sống chung với nấm men trong một loại nước giải khát dân gian làm bằng nước chè và đường loãng, pH thích hợp là 4,5 – 6; nhiệt độ thích hợp từ 25 - 300C [18]

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí

bắt buộc, hoá dị dưỡng Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch

rượu, nước ép hoa quả, trong đất

Theo Nguyễn Lân Dũng [10] vi khuẩn Gluconacetobacter có bao nhầy

cấu tạo bởi cellulose Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là các polysacarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có các polypeptit, protein Bao nhầy có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể

6

Theo Sokolniki và cs độ dai và chắc của màng cellulose do vi khuẩn sinh ra có liên quan đến hình dạng của tế bào vi khuẩn [28] Nếu độ dài (chiều dài của tế bào) càng cao thì tính bền vững của màng cellulose do vi khuẩn đó tổng hợp càng lớn Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về mối liên hệ giữa hình dáng kích thước

tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng những vi khuẩn có

tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước tốt hơn và có

độ dai chắc hơn, còn những dòng Gluconacetobacter có hình dạng tròn dài thì

màng BC có khả năng chịu lực thấp hơn [13]

1.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Trên môi trường thạch đĩa vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành

khuẩn lạc nhẵn hoặc sù sì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi

trường Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở

điều kiện tĩnh chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng, đó

là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [18]

Ngược lại, trong điều kiện nuôi lắc cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo

ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

+ Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 300C, pH :4,5 -

6 Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống Nếu nhiệt độ vượt quá 370C thì

tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu

7

Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ

sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều

kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng

và tạo màng

+ Đặc điểm sinh hoá

Năm 1950 Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [29] …Theo quan điểm

này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi chi Acetobacter, họ

Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes Đặc điểm phân

biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1 dưới đây:

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

theo Frateur (1950)

1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic

Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh lục sang màu vàng

+

3 Sinh trưởng trên môi trường

4 Chuyển hoá Glycerol thành

dihydroxyacetone

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch

5 Chuyển hoá glucose thành acid

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO 3

+

6 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu Không hình thành sắc tố nâu _

7 Kiểm tra khả năng tổng hợp

cellulose

Váng vi khuẩn xuất hiện màu

8

1.1.5 Đặc điểm về sinh trưởng

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển tốt trên môi trường nước bia, các

môi trường có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay mannitol,… trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25 - 300C, pH: 5,4 - 6,8

Tính chất đặc trưng nhất của vi khuẩn Gluconacetobacter là khả năng oxy

hóa rượu etylic thành acid acetic ở pH > 4,6 Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá trình oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeto hay các acid hữu cơ tương ứng

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter đối với nguồn

cacbon, nguồn nitơ và chất sinh trưởng rất đa dạng, chúng có thể đồng hóa nhiều loại thức ăn cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccaride, disaccaride, polysaccaride) rượu etylic, acid hữu cơ, nhưng không sử dụng được tinh bột và lactose

9

1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter

1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô

cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật

Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật

dị dưỡng, đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất

có màu tối khó hấp thụ Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ

bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường Để tránh hiện tượng này khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở

1100 trong 30 phút Từ các loại đường đơn, tốt nhất nên sử dụng phương pháp

hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal) Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác

người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,2- 0,5% đường Hầu hết vi khuẩn chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D [8]

Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, ) có thể vừa sử dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật

10

1.2.2 Nhu cầu nitơ của sinh vật

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là môi trường do Hestrin và Schramm thiết lập, có chứa cao nấm men và pepton là nguồn nitơ hữu cơ, (NH4)2SO4 là nguồn nitơ vô cơ [30]

Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường, muối amoni của các acid hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn

Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,

xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết

NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường

Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu

cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân

tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật

1.2.3 Nhu cầu nguồn photpho

Photpho chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào

vi sinh vật Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta dùng các loại photpho vô cơ như KH2PO4, K2HPO4, KNO3 Bổ sung photphat các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường

Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến

sinh trưởng của chủng Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng BC

như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi

lượng thì chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và phát triển không

bình thường

11

1.2.4 Ảnh hưởng của oxi

Theo cơ chế của quá trình lên men để oxi hóa 1mol rượu cần 1mol O2 Thực tế càng thoáng khí thì năng suất càng cao Ở phương pháp lên men chậm do bề mặt tiếp xúc giữa tế bào và không khí bị hạn chế bởi sự bao phủ

bề mặt dịch lên men của lớp váng giấm, độ dày của lớp dung dịch Vì vậy quá trình lên men kéo dài 3-5 tuần, nồng độ giấm thu được 3-7% acid acetic Ở phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3-4 ngày, hệ số chuyển hóa đạt 98%, nồng độ giấm đạt 7-14% acid acetic [3], [4]

1.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ hoạt động

thích hợp là từ 25-300C, nhiệt độ quá thấp làm chậm quá trình lên men, nhiệt

độ cao sẽ làm ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nhiệt độ tăng quá cao thì quá trình sinh sản của vi khuẩn sẽ bị dừng lại làm giảm hiệu suất của quá trình lên men [3], [6]

1.2.6 Ảnh hưởng của pH

pH được đo bằng nồng độ ion H+ trong dung dịch, pH ảnh hưởng đến tính thấm hút của màng tế bào, vì thế nó ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của vi khuẩn Sự tổng hợp ATP, đặc biệt là hoạt tính của enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH Độ pH ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp cellulose vì pH kích thích quá trình trao đổi chất của tế bào, độ pH quá cao hay quá thấp cũng gây ức chế cho vi khuẩn Người ta dựa vào độ pH đã chia vi khuẩn ra thành các loại:

vi khuẩn acid, vi khuẩn trung tính, vi khuẩn bazơ Đã có rất nhiều nghiên cứu

về ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn Gluconacetobacter và hầu hết đều chỉ ra rằng chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và

phát triển trong môi trường hơi có tính acid (pH: 4,5 - 6) [6]

1.2.7 Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic và rượu etylic

12

Acid acetic có tác dụng ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nồng độ acid 8% thì vi khuẩn hoạt động kém, khi nồng độ acid từ 12-14% thì hoàn toàn đình chỉ hoạt động Vì vậy, nồng độ acid acetic cần dùng hoạt hóa vào khoảng 2-2,5% (Nodes, 1986) và 2% (Ebner, 1985) Hàm lượng rượu etylic trong dung dịch lên men cũng giống như acid acetic là một chất sát khuẩn với

vi khuẩn Gluconacetobacter, nó được sử dụng như một cơ chất Hàm lượng

rượu có thể thay đổi từ 2-10% thể tích, hàm lượng rượu cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men Khi không có rượu etylic trong môi trường vi khuẩn sẽ chuyển hóa acid acetic thành CO2 và H2O [8]

1.3 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của cellulose

Cellulose là một polisaccarit có phân tử lượng: 8.105 – 22,68.105 đvC

Có công thức chung của tinh bột (C6H10O5)n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000 – 14000, mỗi phân tử cellulose gồm những đường đa được cấu tạo từ các liên kết glucose Các phân tử glucose nối với nhau ở vị trí β-1,4 bằng cầu nối oxi, có thể được cấu tạo từ 200 đến 1000 phân tử glucose Cellulose có hình dạng sợi dài, nhiều sợi liên kết song song với nhau thành chùm nhờ các liên kết hydro giữa các nhóm (- OH) Mạch cellulose xếp song song tạo thành các sợi có đường kính 3,5 nm, mỗi phân tử cellulose chứa khoảng 8000 gốc momosaccharide Cellulose có tính chất của 1 tinh thể Crystal và có tính khúc xạ kép vì do cấu tạo mà phân tử cellulose có tính định hướng không gian 3 chiều sắp xếp song song với nhau [15]

Cellulose là chất rắn dạng sợi, có màu trắng, không mùi, không vị, tính bền vững cơ học cao, chịu được nhiệt độ đến 200oC mà không bị phân hủy

Tỷ trọng khô là 1,45; khi khô cellulose dai và khi tẩm nước nó mềm đi Cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu cơ nhưng tan trong dung môi như: HCl, HNO3…và một số dung dịch muối: ZnCl2, PbCl2…

[C6H7O2(OH)3]n + 3n HNO3 (đặc) -> [C6H7O2(ONO2)3]n + 3nH2O

1.3.2 Đặc điểm cấu trúc của màng BC

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mạch thẳng, nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau

Chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau

tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm; những sợi nhỏ kết tinh tạo

sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải lớn

Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hydro hoặc Van Der Waals tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước của màng tăng lên khi quần thể

vi khuẩn sinh trưởng Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính

vì thế mà màng BC được mở rộng [7]

Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:

- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao

- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp

- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy

- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose (kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose

- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vì vậy cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai

Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin hay những thành phần phụ khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibril tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose Do đó màng BC có độ bền cơ học cao, độ tinh

khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn… hơn hẳn cellulose của thực vật

15

1.3.4 Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều

loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà

Theo tác giả Alina Krystyna Vicz và cs cho rằng có 4 enzym tham gia

xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter gồm Glucokinase

(GK), Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - và Hromatka (1949-1953) cho rằng: tế bào vi khuẩn có khả năng sản sinh phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS) Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [33]

Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn:

Giai đoạn polymer hóa:

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển sang glucose thành glucose-6-phosphate Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose-6- phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isome hóa Glucose-1-phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-glucose Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được hóa thành cellulose và celluose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là

16

cellulose synthase, enzyme này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP

Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucal được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan Trong đó các chuỗi glucal kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals, lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucal Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi

Hình 1.2 Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài

Ý nghĩa của quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Gluconacetobacter

Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter không di

động do chúng nằm bên trong lớp màng cellulose Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá trình chuyển hóa, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy đến

tế bào

Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung

quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này

17

ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận

lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter Màng

cellulose có khả năng giữ nước nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử ngoại) Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm ẩm độ, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại

Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter

luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí Chính mạng lưới này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose Trong môi trường tự nhiên, đa số

vi khuẩn tổng hợp các polisaccarit ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điển hình

1.4 Tổng quan về nguyên liệu

1.4.1 Môi trường lên men nước gạo

Gạo là loại thực phẩm carbohydrate hỗn tạp, chứa tinh bột (80%), một thành phần chủ yếu cung cấp nhiều năng lượng, protein (7,5%), nước (12%), vitamin Chất tinh bột chứa trong hạt gạo dưới hình thức carbohydrate (carb) gồm đường glucose, fructuose, lactose và sucrose Có chứa các vitamin B-1, vitamin B-

2, niacin, vitamin E, ít chất sắt và kẽm và nhiều chất khoáng Mg, P, K, Ca Thành phần dinh dưỡng có trong gạo thích hợp để vi sinh vật phát triển tốt

18

1.4.2 Hệ vi sinh vật

1.4.2.1 Vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc) Chúng

phát triển tốt trên bề mặt môi trường, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong phú trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại thực phẩm, hoa trái, nước trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa ethanol như rượu, bia, giấm tự nhiên…

Các phương pháp truyền thống trong phân loại và định danh họ

định danh vi khuẩn acetic

1.4.2.1.2 Đặc điểm sinh thái

Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thường gắn liền với các nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các nơi sản xuất giấm Tuy nhiên trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài Cụ thể như

Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol; Granulibacter được tìm thấy trong cơ thể người bị u hạch

1.4.2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như: Oxy hóa acetate tạo CO2 và H2O; phát

19

triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát triển sinh khối trong các môi trường chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35% [3]

1.4.2.2 Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Nhiệt

độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn

lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [3]

1.5 Tình hình nghiên cứu màng BC Trên thế giới và ở Việt Nam

1.5.1 Trên thế giới

Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC của chúng đã thu hút được

sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học đã dùng màng phân tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng, dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm Đặc biệt trong công nghiệp dệt đã sử dụng chúng để sản xuất vải đặc biệt có giá trị kinh tế cao Trong công nghiệp giấy, màng BC

được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao Vi khuẩn

Gluconacetobacter và ứng dụng của nó đang được sự quan tâm của nhiều nhà

khoa học trên thế giới Tập trung theo hai hướng cơ bản:

20

 Hướng 1: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính sinh

học của Gluconacetobacter từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong

sinh giới

 Hướng 2: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng dụng

của BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng

Gluconacetobacter, ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi

cấy đến quá trình sinh tổng hợp cellulose Mở đầu là S.Hestrin, M.Schramm

và cs, sau là một loạt các nghiên cứu tương tự [30]

Tiếp đến là nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển

hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter Gần đây cơ chế sinh tổng hợp

cellulose, các hệ enzyme tham gia và con đường chuyển hóa cacbon trong vi

khuẩn Gluconacetobacter mới dần được sáng tỏ

Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết quả tốt

Năm 2005, Henrik Backdahl và cộng sự đã ghép thành công sợi cellulose trên động mạch cảnh của lợn, thấy chúng sinh sản chỉ sau 2 tuần cấy ghép Họ đã đi đến kết luận có sự tương đồng về cấu trúc giữa màng BC với collagen [34] Năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc màng BC sử dụng làm nanocomposit

Tuy nhiên những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan(Canada) đã

được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng [26]

Các tác giả Jonas và Farad, Czaja và cs đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ

tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển và tạo màng của A.xylinum Có thể kể

đến một số nghiên cứu điển hình như: năm 2003, tác giả Nguyễn Thúy Hương

và Phạm Thành Hổ (Bộ môn công nghệ sinh học, Trường ĐH Bách Khoa

TPHCM) đã nghiên cứu về chọn lọc các dòng A.xylinum cho sản xuất

cellulose Công trình nghiên cứu do Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ,

2007, sử dụng cellulose vi khuẩn làm tác nhân kết dính tạo các dạng ép từ phế phẩm phụ nông nghiệp Gần đây nhất nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Nguyệt đã nghiên cứu ứng dụng màng BC sản xuất từ vi khuẩn

A.xylinum làm mặt nạ dưỡng da [9]

Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cs đã

có một số công trình nghiên cứu về màng BC từ A.xylinum và bước đầu

nghiên cứu về đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong điều trị bỏng ở Việt Nam

Năm 2006, bộ môn vi sinh-ký sinh, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men

Năm 2010, nhóm nghiên cứu đề tài B.2010 – 18 – 69TĐ của Đinh Thị Kim Nhung và cs cũng đang bước đầu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng trên thỏ [5] Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc dùng một số màng trị bỏng như màng ối, da ếch, màng chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng

Theo tác giả Huỳnh Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên Vì thế nó

22

không chứa các yếu tố độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố lan mần gây bệnh không giải phóng chất lạ vào vết thương Màng có khả năng diệt khuẩn 100% vi khuẩn thường gây ra các nhiễm trùng vết thương hở da như vết bỏng…Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không cần sử dụng bất

cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng ngăn cản vi khuẩn, làm vết thương mau lành do thúc đẩy quá trình tái tạo mô hạt [7]

23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter được phân lập từ bia, dịch hoa quả

lên men giấm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Vi sinh - Khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2

2.1.2 Hóa chất

- Nguồn đường: glucose, saccarose, fructose, sorbitol (Nhật Quang Pharma

Co, Ltd)

- Nguồn nitơ

+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4

+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton

- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O

- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fucshin, dung dịch lugol

- Nước dừa, agar, …

Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức)

Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ) Micropipet (Gilson, Pháp)

Tủ lạnh (Tawasi, Nhật)

Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh

Bình tam giác, lam kính, la men, đèn cồn

24

2.1.4 Môi trường nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường giữ giống (MT1)

Trong đó: N là tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu

A i là số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải

CaCO 3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10 -n

V i là thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập

10 -n là là độ pha loãng của mẫu phân lập

2.2.1.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter thuần khiết

Sau khi đã có các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter cho màng trên

môi trường oxy hóa chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm

khuẩn lạc trên hai môi trường A và B [10]

Môi trường A: dịch nấm men 3%, agar 2%, rượu etylic 15%-1ml, xanh

lục bromocresol 2,2%-1ml Khi cấy giống vi khuẩn acetic nếu là vi khuẩn

Gluconacetobacter sẽ làm môi trường biến đổi màu vàng, nếu là Acetobacter

cũng làm môi trường biến màu vàng nhưng có 1 vành màu xanh lơ do quá trình oxy hóa các acid

Môi trường B: dịch nấm men 3%, agar 2%, CaCO3 2%, rượu etylic

15%-2ml Khi cấy giống vi khuẩn acetic nếu là vi khuẩn Gluconacetobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thì vòng sáng

rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vòng sáng

2.2.1.3 Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram

Vi khuẩn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể

phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép)

26

Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong các ống thạch

nghiêng, làm vết bôi lên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửu đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram [12]

Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần

Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram âm với vi khuẩn Gram dương Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm Ngược lại nếu tế bào bắt màu tím thì

đó là vi khuẩn Gram dương Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và Gram dương khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gram dương được cấu tạo từ một loại protein đặc biết chứa muối nuclear magie có khả năng tạo màu tím với gentian và lugol tạo ra một phức chất bền, khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn Gram dương bắt màu tím của gentian trong khi đó những vi khuẩn Gram âm không

có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng - màu của fucshin

2.2.1.4 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập được sơ bộ xác định là

Gluconacetobacter được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ

ấm ở 300C Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 2 tháng một lần để tránh thoái hóa giống [4]

2.2.1.5 Phương pháp hoạt hoá giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu

27

chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210 trong 20 phút Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào

và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [17]

2.2.1.6 Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh phân rã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong

15 phút Bổ sung vào môi trường 10% dịch giống đã được hoạt hoá Nuôi cấy

ở điều kiện tĩnh trong 5 ngày và tiến hành thu màng [12]

2.2.2 Phương pháp xử lý và bảo quản màng BC

* Phương pháp xử lý màng

Do màng BC khi được tạo thành có khá nhiều thành phần dư của môi trường bám vào nên mục đích của quá trình xử lý màng là loại bớt các sản phẩm dư, giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màng trắng trong, mỏng và dai [8], [12]

Phương pháp tiến hành:

- Rửa nước nhiều lần

- Ngâm trong dung dịch muối NaCl 0,7N trong 12h

- Ngâm trong dung dịch NaOH 0,5N cho đến khi màng chuyển sang màu trắng

- Trung hòa bằng acid nitric loãng

- Ngâm trong cồn 700

- Rửa nước nhiều lần

* Phương pháp bảo quản màng BC

Màng BC sau khi xử lý cần được bảo quản để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo và sử dụng để thực nghiệm bảo quản thực phẩm trong thời gian

dài ở nhiệt độ phòng [8]

* Khảo sát khả năng thấm hút nước

Màng BC sau khi được xử lý sẽ sấy khô trong điều kiện 400C trong 24 giờ, cân khối lượng màng (m1) Sau đó ngâm màng vào trong nước trong khoảng thời gian xác định là 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h Vớt màng và cân khối lượng màng trong các khoảng thời gian trên (m2) [16]

M = m2 – m1M: Khối lượng nước hút vào

2.2.3 Phương pháp ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm

Dùng màng BC sau xử lý bao kín một số loại quả: táo, cà chua, hồng xiêm,… để bảo quản ngoài môi trường ở nhiệt độ phòng so sánh với hoa quả bảo quản trong túi nilon và không bảo quản xem thời gian bảo quản được bao lâu [12]

2.2.4 Phương pháp hóa sinh

* Phương pháp xác định hoạt tính catalase

Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc ta thấy có hiện tượng sủi bọt khí thì đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại chủng vi khuẩn không có hoạt tính catalase (cattalase -) [18]

Ngoài ra có thể nhỏ trực tiếp H2O2 lên sinh khối tế bào của chủng vi khuẩn nghiên cứu được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 5000 vòng/phút, quan sát hiện tượng như trên

29

* Phát hiện khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic

Nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường có thành phần (g/l)

Cao nấm men: 10g Rượu etylic 10% - 15%

pH: 6,8 – 7 Nước máy 1000 ml

Xanh bromophenol 0,04%: 20ml

Môi trường và ống nghiệm khử trùng ở 1210C trong 20 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm nuôi trong điều kiện thích hợp trong 7 ngày Quan sát nếu môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không chuyển màu là âm tính

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn

Để nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nấm men thu được, tiến hành nuôi cấy chúng trên môi trường dịch thể trong điều kiện tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy được lấy ra để xác định số lượng tế bào Đếm số lượng tế bào ở những thời điểm 0, 12, 24, 36, 48, 60,

72, 84,96 h, bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri

2.2.6 Phương pháp toán học

Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau [6]

+ Số trung bình cộng: dùng để tính các giá trị trung bình của các lần lặp lại

thí nghiệm X = 



n

i i

1

n i i

m là sai số đại diện của trung bình cộng lượng acid tạo thành

X là chỉ số acid tạo thành trong các lần thí nghiệm

31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetic

3.1.1 Phân lập vi khuẩn acetic từ nguồn nguyên liệu tự nhiên

Để tuyển chọn các chủng vi khuẩn acetic khác nhau chúng tôi tiến

hành phân lập từ bia hơi Vĩnh Tường và dịch dứa lên men giấm

Trước tiên chuẩn bị dịch hoa quả và bia cho vào bình tam giác có dung tích 200ml, đậy bằng nút bông cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 28-320C trong 3-5 ngày đến khi trên bề mặt dịch có màng màu trắng hình thành, đây chính là

màng Bacterial cellulose Kết quả thí nghiệm được dẫn ra ở hình 3.1 và 3.2

Hình 3.1 Dịch bia lên men giấm

Hình 3.2 Dịch dứa lên men giấm

Sau đó tiến hành lấy dịch phân lập ở các độ pha loãng khác nhau:

32

10-6, 10-7, 10-8… vào các đĩa petri cho vào tủ ấm nuôi ở nhiệt độ 300C sau

4-6 ngày thấy trên bề mặt thạch đĩa xuất hiện các khuẩn lạc to nhỏ màu trắng khác nhau có đường kính 0,8 - 2,5mm (đôi khi xuất hiện những khuẩn lạc có đường kính lớn 4 - 5mm) có bề mặt trơn bóng, phần giữa lồi lên dày hơn và sẫm hơn xung quanh, khô, mép khuẩn lạc nhăn nheo

Trên mỗi thạch đĩa có rất nhiều khuẩn lạc nhưng bằng cảm quan tôi chọn những khuẩn lạc có đặc điểm khác nhau về hình dáng và màu sắc Quan sát thấy khuẩn lạc có những đặc điểm sau:

+ Hình tròn, mép khuẩn lạc nhăn, màu trắng sữa

+ Hình cầu, mép khuẩn lạc nhẵn, màu vàng nhạt

+ Hình tròn, mép khuẩn lạc gợn sóng, màu trắng trong

Dùng que cấy đầu tròn đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn gợt lấy từng khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc được cấy trên một ống thạch nghiêng, mỗi ống là một mẫu vi khuẩn được mã hóa bằng các ký hiệu khác nhau Kết quả thí nghiệm dẫn ra ở hình 3.3 và hình 3.4

Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn acetic phân lập từ bia