Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật

Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc bài thuốc chữa bệnh gan mật

B ộ Y Tê TRƯỜNG ĐẠI 'HỌC Dược HÀ NỘI

= = = o O o = = =

TRẦN XUÂN TRUNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN c ú u XÂY DỤNG TIÊU CHUAN

KIỂM NGHIỆM CAO ĐẶC BÀI THUỐC CHỮA BỆNH GAN MẬT

( KHOA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 1999-2004)

-Người hướng dẫn: TS Vũ Văn Điền

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

Dược điển Việt Nam III DĐVNIII.Phản ứng dương tính (+)

Sắc ký lớp mỏng SKLMTrang Tr

LỜJ cám ƠHTrong suốt quá trình tiến hành làm khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình và chu đáo của:

TS VŨ VĂN ĐIỂN Ths PHẠM THỊ GIẢNG

Cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của Bộ môn Dược học cổ truyền, phòng Đông

dược-Viện kiểm nghiệm; đặc biệt là PGS.TS Phạm Xuân Sinh, TS Nguyễn Thị Thái An, những người đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá

trình thực hiện đề tài Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công nhân viên bộ môn Dược học cổ truyền, phòng Đông dược-VKN

Với lòng biết ơn chân thành, tôi xin cảm ơn DS Phạm Văn Kiên, người đã

hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Hà nội, ngày 30 tháng 5 năm 2004

Sinh viên:

Trần Xuân Trung

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể 3

Phần 1: TỔNG Q U A N 4

1.1.Tóm tắt đặc điểm các vị thuốc của bài thuốc chữa bệnh gan m ật 4

1.2 Cao th u ố c 11

Phần 2: THựC NGHIỆM YÀ KẾT Q UẢ 13

2.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung mối, phương tiện và phương pháp thực nghiệm 13

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi, phương tiện 13

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 13

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 14

2.2.1 Điều chế c a o 14

2.2.2 Xác định các tiêu chuẩn 16

Hình ảnh sác k ý 31

Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 32

3.1 Kết luận 32

3.2 Đề xuất 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

- Xác định các chỉ tiêu của cao đặc (tính chất cảm quan, độ tan, hàm lượng nước ).

- Định tính

- Dự kiến tiêu chuẩn kiểm nghiệm của cao

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Tóm tắt đặc điểm các vị thuốc của bài thuốc chữa bệnh gan mật.

Bài thuốc chữa bệnh gan mật có công thức như sau:

1.1.1 Bạch thược 0Radix Paeonia lactiflorae)

Rễ đã bỏ vỏ và phơi hay sấy khô của cây Thược dược (Paeonia lactiflorae

Pall ), họ Mao lương (Ranunculaceae)[6],

- Thư cân, chỉ thống: dùng chữa đau bụng, đau ngực, chân tay co quắp, tả lỵ.

- Bình can: dùng chữa đau đầu, hoa mắt, chóng mặt [1]

1.1.2 Chi tử:(Semen Gardeniae)

Quả chín đã phơi khô, bóc bỏ vỏ của cây Dành dành (Gardenia jasminodes

Fllis hoặc Gardenia florida L ), họ Cà phê (Rubiaceae)[6].

+ Thành phần hoá học:

- Các Iridoid glycosid: gardosid, scandosid methyl ester, scanzhisid, desaacetyl asperulosid acid methyl ester, gardesid

- Acid picrocinic là một monoterpenoid glycosid khác

- a-crocin (a-crocetin digenti biosid) [2]

- Chỉ huyết: dùng chữa thổ huyết, đại tiểu tiện ra huyết

- Giải độc: dùng chữa mụn nhọt, cơ bị sưng đau [1]

1.1.3 Đương quy-{Radix Angeỉicae sinensis)

Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Đương quy (Angelìcae sinensis (Oliv )

Diels), họ Hoa tán (Apiaceae)[6].

+ Thành phần hoá học:

+ Tinh dầu (0 2-0 4%) gồm các thành phần chính sau:

Ligustilide 50 29%; n-butylidenphtalid 7 35%; n-butylphtalid 1,81, trans- Ị3-farnesen 2 16%; P" bisabolen 2 02%; allo-ocimen 8 98%; [3- ocimen 4,99-

Ỵ-elemen, a-cedren, Bergapten, anhydric dihydrophtalic, isoeugenol, 2- methyldecan-5-on

+ Coumarin: Scopoletin, umberiferon, xanthotoxin

+ Vitamin: B12, Bị, E

+ Acid amin[7]

+ Các thành phần khác: acid ferulic; acid vanilic;acid nicotinic, ị3- sitosterol; cholin; alcarindiol, falcarinolon, brefeldin Polysacchride: arabinogalactam dạng acid và dạng trung tính trọng lượng phân tử khoảng 3000, cấu tạo gồm: protein 4,73%, carbohydrate 85,85%, acid uronic 5,2% Trong nhóm hydratcarbon gồm các đường: L-arabinose, D-galactose, D-glucose, L-ramnose .[7]

- Các nguyên tố vô cơ: K, Na, Ca, Mg, Al, Cr, Zn [7]

- Hoạt tràng thông tiện: chữa chứng huyết hư, huyết táo gây táo bón

- Giải độc dùng chữa mụn nhọt, đinh độc [1]

1.1.4 Hoa hòe(Fỉos Styphnoỉobii japonici)

Nụ hoa đã phơi hay sấy nhẹ đến khô của cây hòe (Sophora japonica L ),

họ Đậu (Fabaceae)[6],

+ Thành phần hoá học:

Hoa hoè có rutin (rutosid) Hàm lượng rutin có thể đạt tới 28% DĐVNIII qui định hàm lượng rutin không dưới 20% Ngoài ra còn có quercetin (phần aglycol của rutin), betulin, sophoradiol [2]

- Hạ huyết áp: dùng trong trường hợp huyết áp cao.

- Thanh phế, chống viêm: dùng chữa viêm thanh đới, nói không ra tiếng [3]

+ Tác dụng dược lý của rutin:

- Rutin có hoạt tính vitamin p, có tác dụng làm bền và giảm tính thấm của mao mạch, làm tăng sự bền vũng của hồng cầu, chống co thắt[5] Hạ huyết áp, chống phóng xạ tia X, chống viêm thận cấp, làm tăng đường huyết của thỏ [1]

1.1.5 Hoàng bá (Cortex Pheỉlodendri)

Vỏ thân hoặc vỏ cành đã bỏ lớp bần và phơi hoặc sấy khô của cây Hoàng

bá (Phellodendron chỉnense Scheid ), họ Cam (Rutaceae).[6]

- Thanh nhiệt táo thấp: dùng khi hạ tiêu thấp nhiệt, tiểu tiện ngắn đỏ hoặc buốt

dắt, phối hợp với sa tiền tử, bạch mao căn, viêm gan, viêm mật, thấp nhiệt ở vị

tràng gây tiết tả lỵ, đại tiện ra máu mủ, thấp nhiệt ngưng đọng ở chân gây sưng đau, sưng gối, sưng khớp, chân mỏi, đau nhức thì phối hợp với khương truật, ngưu tất

- Giải độc tiêu viêm: Dùng khi cơ thể bị thấp chẩn, lở ngứa, mụn nhọt, phối hợp với huyền sâm, sâm đại hành, chi tử [1]

1.1.6 N hân trần (Alerba Adennosmatis caeruíei)

Thân cành mang lá và hoa đã phơi hoặc sấy khô của cây Nhân trần

(Adenosma caeruleum R Br.), họ Hoa mõm chó ( Scrophulahaceae)[6].

1.1.7 Sinh địa (Radix Rehmanniae)

Thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Địa hoàng hay cây Sinh địa

(Rehmannia gluíinosa (Gaertn.)Libosch.), họ Hoa mõm chó

('Scrophulariaceae) [6]

+ Thành phần hoá học:

- Iridoid glycoid: Catalpol; Rehmaniosid A,B,C,D

-1 5 acid amin; D- Glucosamin; acid photphoric

- Các carbohydrat: D-glycose, D- glaccose, D- Fluccose, Sucrose, Rafinose, Mannotriose; Stachyose; Verbascose và D-manitol Stachyose là chính với hàm lượng 48,3% ( so với dược liệu khô)

- 1 8 dẫn chất: Phenethyl alcohol glycosid: 2 ’- O- acetyl- acetosid; jionosidC; Jionosid D, isoacenosid [2]

Thân cành mang lá và hoa đã phơi hay sấy khô của cây c ỏ thiên thảo

cAnisomeles ovata R Br hoặc Anisomeỉes indica (L ) o ktze), họ Hoa môi (Lamiaceae) [7],[10]

+ Thành phần hoá học:

- Các chất terpen: Ovatodiolid; 4,5-epioxyovatodiolid; Acid anisomelic; isovatodiolid; Acid 4,7-oxycycloanisomelic; 4-methylen-5-hydroxy ovatodiolid; acid4-methylen-5-oxoanixomelic ; btulin; glution; friedlin; glutiol; Ị3-amyrin

- Các flavonoid: cosmosin; terniflorin; anisofloin A; prunin-S^ó”- di-p- coumarat; apiginin- O-p-D (4” , 6”-đitrihydroxyflavol;5-hydroxy-6,7,3’,4’- tetramethoxyũavon; prunin 6-p-coumarat; 4,5-đihydroxy-6,7,3’- trimethoxyflavon; 5,7,4’-trihydroxyflavon

- Các thành phần khác: Methyl-p-hydroxycinamat; P-sitosterol-3-O-Glucosid; n-hexacosanol [7],[ 10]

+ Công dụng:

- Vị cay, đắng tính hơi ấm

Công năng chủ trị:

- Giải biểu; tiêu sưng, chỉ thống; tiêu tích trệ; khu phong

- Dùng chữa đau bụng, đầy hơi bụng trướng nôn mửa, viêm dạ dày ruột, rối loạn tiết niệu, thấp khớp, chữa viêm gan

- Rễ cây chữa rắn độc cắn [7],[10]

1.1.9 Uất kim (Radix Curcumae longae)

Rễ củ đã phơi hay sấy khô của cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberac.eae)[6].

- Hành khí hành huyết: Dùng trị các bệnh huyết ứ trệ, ngực bụng đầy chướng,

đau bụng, kinh nguyệt không đều

- Chỉ huyết: Dùng chữa chảy máu cam, thổ huyết hoặc các bệnh vừa ứ huyết vừa xuất huyết

- Thanh can đởm thấp nhiệt: Dùng chữa viêm gan vàng da, cứng gan, viêm túi mật, sỏi mật, đau liên sườn

Ngoài ra, uất kim con dùng chữa viêm loét dạ dày, dùng ngoài bôi trị mụn nhọt, làm lên da non các vết thương [1]

1.2 Cao thuốc

1.2.1 Đ ịnh nghĩa: Cao thuốc là chế phẩm điều chế bằng cách cô hoặc sấy

đến thể chất qui định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [6]

1.2.2 Phân loại:

- Cao lỏng: Có thể chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu dùng

để điều chế cao Nếu không có chỉ dẫn khác, thường qui ước 1 ml cao lỏng tương ứng với lg dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

- Cao đặc: là một khối đặc quánh Hàm lượng dung môi dùng để chiết xuất còn lại trong cao không quá 20%

- Cao khô: Là một khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5% [6]

Giai đoạn II:

- Cao lỏng: sau khi thu được dịch chiết tiến hành điều chế bằng phương pháp

thích hợp để được cao lỏng đạt tiêu chuẩn

- Cao đặc: Dịch chiết được cô đặc độ ẩm còn lại không quá 20%

- Cao khô: Cao đặc tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5%

1.2.4 Yêu cầu chất lượng[6]:

+ Cao lỏng:

- Độ tan: Tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Độ trong, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đồng nhất, không cóváng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ

+ Cao đặc, cao khô: Mất khối lượng do làm khô:

- Cao đặc không quá 20%

- Cao khô không quá 5%

- Cồn Ethylic, dung môi hữu cơ: đạt tiêu chuẩn phân tích.

- Các thuốc thử: đạt tiêu chuẩn phân tích

- Máy xay dược liệu do Việt Nam sản xuất

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Bộ dụng cụ xác định hàm lượng nước theo DĐVNIII

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm:

• Điều c h ế cao đặc:

- Chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh phân đoạn với cồn 80°.

- Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, tiếp tục cô cách thuỷ đến thể chất quy định [6]

• Xác định hàm lượng nước: theo DĐVNIII.

2.2.1 Điều chê cao:

2 2 /./ Chuan bi nguỵên Ueu±

Căn cứ vào từng vị để xử lý theo phương pháp thích hợp trước khi chiết:

- Bạch thược: nguyên liệu đã thái phiến mỏng, đem rửa qua bằng nước máy,

để ráo nước, sấy khô ở nhiệt độ 60°C; xay thành bột bằng máy xay dược liệu,

- Hoa hoè: nguyên liệu là nụ hoa, đem sàng sẩy loại bỏ tạp, sấy khô ở 60°c,

dùng thuyền tán tán thành bột (tỷ lệ bột qua rây lmm là 87.5%)

- Hoàng bá: nguyên liệu dạng que, đem rửa qua bằng nước máy, để ráo nước, sấy khô ở nhiệt độ 60°C; xay thành bột bằng máy xay dược liệu, cỡ rây: 0.5mm

- Nhân trần: nguyên liệu đem sàng sẩy loại bỏ tạp, rửa qua bằng nước máy, để ráo nước, sấy khô ở 60°c, dùng thuyền tán tán thành bột (tỷ lệ bột qua rây

lm m là 78.7%)

- Sinh địa: nguyên liệu còn nguyên củ đã sơ chế, đem rửa sạch,thái lát mỏng 0.5-1.0mm, sấy khô ở 60°c, xay thành bột bằng máy xay dược liệu, cỡ rây: 0,5mm.

- Thiên thảo: thu hái cây tươi (phần trên mặt đất), đang có hoa(tháng 10/2003), cắt đoạn 4-5cm bằng dao cẩu, phơi và sấy khô ở 60°c, dùng thuyền tán tán thành bột (tỷ lệ bột qua rây lmm là 82.3%)

- Uất kim: rễ củ còn tươi, rửa sạch, thái lát mỏng l-1.5mm, phơi và sấy khô ở 60°c, xay thành bột bằng máy xay dược liệu, cỡ rây: 0.5 mm

2.2.I.2 Xác định đô ẩm nguyên liêu:

- Tiến hành: dùng cân phân tích độ ẩm PREƠSA HA60 (Thuỵ Sĩ)

Đặt chế độ: nhiệt độ sấy 105°c, thời gian sấy khô tối đa 30 phút

- Kết quả: kết quả thu được theo bảng 2 1

Bảng 2.1: Kết quả đo độ ẩm của nguyên liệu

Nguyên

liệu

Bạchthược Chi tử

Đươngquy

Hoahoè

Hoàngbá

Nhântrần

Sinhđịa

Thiênthảo

Uấtkim

Độ ẩm

(%)

10.47 12.03 12.97 11.11 11.02 12.42 6.61 12.73 11.76Yêu cầu

2.2J.3 Điều che_cag±

- Cân nguyên liệu theo đúng tỉ lệ của bài thuốc, trộn đều, làm ẩm bằng cồn 90°, cho vào bình chiết nguội, thêm cồn 80° ngập dược liệu, ngâm ở nhiệt độ phòng, cách 6-8 giờ (hoặc để qua đêm) lại rút dịch chiết một lần và thay dung môi mới, cho đến khi dịch chiết màu xanh nhạt Dịch chiết đem cất thu hồi

dung môi dưới áp suất giảm đến dịch đặc, dịch đặc đem cô cách thuỷ, khuấy liên tục đến cao đặc.

- Tiến hành điều chế độc lập 3 lô cao để so sánh: kết quả được tổng kết theo bảng 2.2 (trong phần xác định hàm lượng nước)

2.2.2 Xác định các tiêu chuẩn:

2.2.2.Ì Hàm lương nước:

+ Tiến hành: [6]

- Chuẩn bị dụng cụ: rửa sạch, làm khô, lắp đúng quy định

- Thêm Toluen, nước cất, cất 2 giờ, để nguội 30 p h ú t, đọc thể tích nước V ị

- Cho mẫu thử vào, cất tiếp đến khi mực nước cất được không còn tăng nữa, rửa ống hứng bằng Toluen Để nguội, đọc thể tích nước v 2

’ ĨJ r o / 10 0 (V 1 -F 2 )

- Tính kết qua: H (%) =

-m+ Kết quả: Bảng 2.2

Bảng 2.2: Kết quả điều chế cao và xác định hàm lượng nước

Lô Số lượng nguyên liệu

(tính theo thang)

Khối lượng cao (g)

Hàm lượng nước (%)

Khối lượng cao khô tuyệt đối (g)

+ Nhận xét:

- Cao điều chế được, cả ba lô đều là cao đặc ( đạt D Đ V N III)

- Trung bình một thang thuốc điều chế được: 49.4g cao (tính theo cao khô tuyệt đối)

- Tỷ lệ cao so với nguyên liệu tương đối ổn định (33,4%)

- Mùi: trên một mặt kính đồng hồ, đường kính từ 6-8cm, lấy 0.5- 2.0g cao trải

thành lớp mỏng, sau 15 phút, xác định mùi bằng cảm quan((thm^ giác) J

+ Tiến hành: Cân lg cao, cho vào cốc, sau đó thêm dung môi, để ở nhiệt độ

phòng, cứ cách 5 phút lại lắc 30 giây Nhận xét kết quả bằng cảm quan

Thử với các dung môi: cồn 80°, nước, acid acetic 2N, acid sulfuric IN, dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch NaOH 0.01N

+ Kết quả: Bảng 2.4

Bảng 2.4\ Kết quả thử độ hoà tan.

80°

acetic 2N

h 2s o 4IN

NaOH0.1N

NaOH0.01N

- Cao đặc tan trong các dung m ô i, cồn 80°, dung dịch kiềm loãng

- Không tan hoàn toàn trong nước, dung dịch acid acetic 2N, acid sulfuric IN

c, Cắn không tan trong nước:

+ Tiến hành: Cân khoảng lg cao, thêm 30ml nước cất, để ở nhiệt độ phòng 30phút, cách 5 phút lại lắc 30 giây, lọc lấy cắn, đem sấy khô đến khối lượngkhông đổi ở 100°c, cân

2.2.2.3 Đinh tintv

a, Alcaloiod:

Chiết x u ấ t: Lấy 2,0g cao, thêm 30 ml dung dịch H2SC)4 IN, đun cách thuỷ

30 phút, lọc, dịch lọc đem lắc với Cloroform 3 lần, mỗi lần 15ml, sau đó kiềm hoá bằng dung dịch NaOH 10%, lắc với Cloroform 3 lẩn, mỗi lần 10ml, dịch Cloroform chia đều vào 4 ống nghiệm, cách thuỷ đến cắn

+ Phản úng Liebermann-Boucharat:

Cho vào ống nghiêm thứ nhất lm l anhydrid acetic, lắc đều để cắn tan hết, nghiêng thành ống nghiệm 45°, thêm lml H2S 0 4 đặc theo thành ống nghiệm, để dịch lỏng trong ống được chia làm hai lớp

Kết quả: ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ (+).+ Phản ứng với dung dịch Kali iodid 16.5%:

Cho vào ống nghiêm thứ hai 10ml nước cất nóng, lắc cho tan hết, làm lạnh dưới vòi nước và thêm lm l dung dịch KI 16.5%, để yên 5 phút

Kết quả: có tủa màu vàng (+)

+ Phản ứng với Aceton:

Cho vào ống nghiệm thứ ba 10ml nước cất nóng, lắc cho tan hết, làm lạnh dưới vòi nước, thêm 3 giọt NaOH 10%, lắc đều, sau đó thêm 5 giọt aceton, để yên

Kết quả: có tủa màu vàng (+)

+ SKLM:

- Dịch đối chiếu: lấy 0.5g bột Hoàng bá, thêm 20ml dung dịch H2S 0 4 IN, đun cách thuỷ 30 phút, cách 5 phút lại lắc một lần, để nguội, lọc, dịch lọc lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần lOml Kiềm hoá dịch nước bằng dung dịch NaOH 10%, rồi lại lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần lOml Cô dịch cloroform đến cắn, hoà vào 2ml methanol

- Dịch thử: hoà phần cắn thứ tư vào 0.5 ml methanol