Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ

Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cốt toái bổ

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC D Ư Ợ CHÀ N Ộ I

NGUYỄN THANH BÁCH

PHẦN HÓA HỌC CỦA CỐT TOÁI B ổ

(D bontí Christ., và D fo rtu n ei (O.Ktze) J.Sm )

Người hướng dẫn:

PGS.TS Phạm X uân Sinh

DS Đào Thị H ằngNơi thực hiện :

Bộ môn dược cổ truyền- Trường đại học Dược Hà Nội

Phòng hóa lý I -V iện kiểm nghiệm Thời gian thực hiện: Tháng 2 -5 /2 0 0 4 /^ '" ' ~

/ < 2 3 - 8 ^ '

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn :

PGS.TS Phạm X uân Sinh.

Người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và dành nhiều thời gian giúp

đỡ tôi hoàn thành khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn :

Đã giúp đỡ tôi hoãn thành bản khoá luận này

Tôi cũng rất biết ơn các thầy cổ giáo, các cán bộ công nhân viên tại bộ môn Dược học cổ truyền và các phòng ban khác trong và ngoài trường đã giúp

đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu khi tôi thực hiện luận văn này

Cuối cùng tôi muốn cảm ơn tất cả bạn bè người thân đã động viên, khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua

DS Đào Thị Hằng, Phó khoa Dược, Phụ trách Đông Dược Bệnh

viện Hữu Nghị

GS^ ẹ S VD V ăn Chuyên.

Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2004

Sinh viên

ở từng địa phương , bên cạnh đó do sự sử dụng không có kế hoạch và khai thác quá mức dẫn dến sự cạn kiệt của nguồn dược liệu.

Vị thuốc cốt toái bổ là thân rễ của cây Cốt toái bổ (Drynaria fortunei, và Drynaria bonii ,họ Dương xỉ - Polypodiaceae) phân bố ở nhiều nơi ở Việt Nam như Lạng Sơn, Hoà Bình, Hà Nội, Sơn La .Nhân dân ta làm thuốc chữa đau lưng mỏi gối, bong gân, tụ máu

Để góp phần vào việc tìm hiểu và nâng cao giá trị sử dụng của vị thuốc

cốt toái bổ, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và

thành phần hoá học cốt toái b ổ Với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, vi phẫu và soi bột thân rễ của hai loài Cốt toái bổ Thông qua đó kiểm định lại tên khoa học

- Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu

- Định lượng flavonoid toàn phần trong hai loài Cốt toái bổ

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT:

1.1.1 Vị trí phân loại chi Drynaria [5], [7]

Theo hệ thống phân loại Takhtazan 1987, chi Drynaria thuộc:

Họ Dương xỉ : Polypodiaceae

Bộ Dương xỉ : Polypodiales Phân lớp Dương xỉ: Polypodiidae Lớp Dương xỉ: Polypodiopsida Ngành Dương xỉ : Polypodiophyta

Dương xỉ thân rễ mọc bò, phủ vẩy nâu hay hung, thường bám trên đá và trên cây gỗ lớn Có hai loại lá: lá gốc có tác dụng thu mùn thường hình trái xoan, xẻ thuỳ hay khía tai bèo; lá sinh dưỡng có cuống Có gân hình mạng lưới, tạo thành nhiều hàng quầng, bao gân nhỏ ở trong

Túi bào tử ở mặt dưới phiến lá, xen kẽ với tơ bên, thường tạo thành ổ túi, không có áo túi

1.1.3 Đặc điểm thực vật của một số loài thuộc chi Drynaria, họ Ráng đa

túc Polypodiaceae [11]

Mô tả: Phụ sinh có căn hành có vảy hoe Lá hứng mùn gần như nguyên, xoan rộng 10 (cm) Lá thường có phiến dài 25-45 (cm), chẻ sâu thành 3-7 cặp khía, sóng có cánh, cuống 10-20 (cm) Nang quần nhỏ, rải rác không đều khắp

Phân bố: Cao Lạng, Quảng Trị.

1.1.3.2 Drynaria forhinei (Mett.) J.Sm., - cốt toái Ráng đuôi Phụng Fortune

Đặc điểm: căn hành bè có vảy thon nâu sét Lá hứng mùn xoan, đáy hình tim, bìa có răng nhọn, dài 3-5 (cm) Lá thường có cuống ngắn 4-7 (cm), mảnh, phiến dài 10-30 (cm), thứ diệp 7-13 cặp, dày, dai, không lông

Nang quần không bao mô, hai hàng giữa gân phụ, bào tử vàng lợt, xoan.Phân bố: Cao Lạng, Hà Nội, Sơn La

1.1.3.3 Drynaria delavayi Christ., - Ráng đuôi phụng Delavay

Mô tả: Ráng có căn hành bò, to 6-10mm, đầy vảy hoe Cuống dài đến

10 (cm); có cánh cho đến tận gốc, rộng hay hẹp; phiến dài 8-20 (cm), tròn dài; thứ diệp thon, đến 6-7 X 1,5 (cm), dai, không lông Nang quần hai hàng hai bên gân của thứ diệp

Đặc điểm là không có lá hứng mùn, mọc trên đá

1.13.4 Drynarỉa parishii Chr., Ráng đuôi phụng Parish

Mô tả: Phụ sinh có căn hành có vảy hoe, lá thừa; cuống có đốt ở đáy dài 7-10 (cm); phiến do 5-7 cặp thuỳ rộng 1-1,5 (cm), trần Không có lá hứng mùn

Nang quần một hàng hai bên gân, không bao mô

Phân bố: Phan Rang, Đà Lạt

1.1.3.5 Drynaría rìgỉdula (SV.) Bedd., - Ráng đuôi phụng cứng

Mô tả: Phụ sinh có căn hành, có vảy nâu hoe, hẹp Lá hứng mùn có thuỳ cạn, nhỏ, nhiều,tròn dài Lá thường cao 80-120 (cm); thứ diệp lộng thon

Phân bố: Núi cao Phú Khánh, Đà Lạt, Bảo Lộc.

1.1.3.6 Drynaria quercifolia (L.) J Smith.,- Ráng đuôi Phụng lá sồi Oak-leaved Fern

Đặc điểm: Phụ sinh có căn hành bò, to, có vảy vàng đỏ Lá hứng mùn

dài đến 30 (cm); có thuỳ cạn, thưa Lá thường chẻ sâu, cao đến 1,4 (m), phiến

không lông Nang quần trần, tròn Rụi vào mùa khô

Thông thường trên cây to, bình nguyên: từ Phú Khánh trở vào Sài Gòn,

Cần Thơ

1.1.3.7 Drynaria propinqua (Mett.) J Sm.,~ Ráng đuôi Phụng gần

Đặc điểm: Phụ sinh có căn hành to, bè dài, có vảy thon, đáy hình lọng

Lá cách nhau: lá hứng mùn không cuống, hình lông chim, dài 10-20 (cm) Lá

thường cuống dài 6-20 (cm), có cánh hẹp ở 1/2 trên, phiến dến 50(cm), thon,

thứ diệp dưới dài nhất 7-15 X 1-2 (cm)

Nang quần hai hàng dọc theo gân giữa của thứ diệp, không bao mô Bào

tử xoan, vàng lợt

+ Tuy có nhiều loài CTB, song hiện nay ở Việt Nam chủ yếu sử dụng

làm thuốc hai loài D bonii và D fortunei Polypodiaceae(Họ Dương xỉ)

1.2 BỘ PHẬN DÙNG:

Thân rễ - Rhizoma Drynariae [6],[8],[12]

1.3 PHÂN BỐ, THU HÁI:

Mọc phụ sinh ở khắp núi đá, trên cây hay dọc suối vùng rừng núi nước ta

Trung Quốc có nhiều ở đất Thanh Viễn, Tam Thanh[12],[14] Hiện nay chủ

yếu vẫn thu hái thân rễ cốt toái bổ mọc hoang Việc thu hái có thể tiến hành

quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa đông, xuân (từ tháng 4 đến tháng 8)

Thân rễ cốt toái bổ hái về cắt bỏ rễ con và phần lá còn sót lại, rửa sạch đất cát, chọn lấy củ già, to mập, thịt màu hồng (không dùng loại thịt màu trắng), cắt thành từng đoạn hoặc thái lát theo kích thước qui định rồi phơi hoặc sấy khô Thường người ta đốt nhẹ cho chúng hết lông nhỏ phủ trên thân rễ Cũng

có khi dùng tươi để đắp lên vùng chấn thương, bong gân, tụ máu [12]

1.4 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC:

Thân rễ cốt toái bổ có chứa:

- Flavonoid: Hesperidin, Naringin, Naringenin [6],[12]

- Tinh bột, glucose, L-arabinose [6],[12]

Công thức cấu tạo:

R = RutinoseHesperidin

OH

R = Neohesperidose

Naringin

1.5 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ:

- Có tác dụng gây động dục ở mức độ cao khi tiến hành thử nghiệm trên chuột nhắt cái thiến một bài thuốc bổ thận gồm cốt toái bể và 4 dược liệu khác[18]

Có thể cho rằng một trong những đặc điểm của tác dụng bổ thận theo đông y của bài thuốc là tác dụng tăng cường chức năng nội tiết sinh dục

- Cốt toái bổ có tác dụng chống viêm trên các mô hình gây viêm thực nghiệm, gây phù chân chuột bằng dextran và kaolin, gây rỉ dịch màng phổi bằng tinh dầu thông, gây u hạt dưới da bằng amian, gây viêm dị ứng và viêm

đa khớp bằng vacxin B.C.G Liều gây giảm mức độ viêm trên mô hình phù kaolin của cốt toái bổ là 65g/kg thể trọng chuột [17]

- Dùng nước sắc của cốt toái bổ 1/2, 14% có tác dụng ổn định màng hổng cầu.[18]

1.6 CHẾ BIẾN VỊ THUỐC CỐT TOÁI Bổ:

Cốt toái bổ có thể dùng giã tươi để đắp lên vết thương [12],[19]

Cốt toái bổ có thể được chế biến theo hai cách sau:

- Dược liệu thu hái về, bỏ cuống lá, loại bỏ lông, rửa sạch, thái phiến dày 2-4mm, phơi khô Có thể sau khi loại bỏ cuống lá, thái phiến, phơi khô, cho vào bao cùng cát khô, chà sát cho rụng hết lông, sàng sảy bỏ lông, rửa sạch [15],[19]

- Cốt toái bổ sau khi thu hái, để nguyên củ phơi khồ Trước khi thái phải rửa sạch, ủ 12 tiếng cho mềm, thái phiến dày l-2mm, phơi khô [15],[19]

Cốt toái bổ có thể dùng dạng sống hoặc có thể được chế biến theo các phương pháp sau:

Sao cốt toái bổ trong chảo nóng ở nhiệt độ 150°c đến khi mặt phiến hơi phổng lên, có màu vàng hơi đen [15],[19].

- Sao cách cát:

Rang cát nóng già ở nhiệt độ 200-220°C, cho cốt toái bổ phiến vào đảo đều cho đến khi mặt phiến bắt đầu phổng lên ngả màu vàng hơi sém, sàng bé cát [15],[19],

- Chữa bong gân, sai khớp, tụ máu: cốt toái bổ tươi giã nhỏ, gói vào lá, nướng cho mềm rồi đắp vào vết thương [14]

- Chữa đau xương, dập xương (gãy xương kín) dùng cốt toái bổ tươi giã nhỏ nấu kỹ với cháo gạo nếp đắp vào chỗ đau [14]

- Cốt toái bổ phối hợp với nhũ hương lượng bằng nhau, nghiền nhỏ, hồ viên nhét vào lỗ răng sâu để chữa chứng sâu răng [18]

- Cốt toái bổ tước nhỏ nướng cho nóng nhét vào tai để chữa chứng ù tai

- Xuất huyết ở ruột dùng cốt toái bổ 20 (g) đốt tồn tính uống với rượu hoặc nước cơm [14]

- Chữa ngứa: lấy rễ tươi của cốt toái bổ cắt lát mỏng xát vào chỗ ngứa[2]

- Ngoài ra còn dùng cốt toái bổ để chữa viêm ruột thừa[14]

ọ

Chú ý: Những người âm hư, huyết hư đều không dùng được [2ị[6],[12].

1.8 CÁC BÀI THUỐC LIÊN QUAN ĐẾN CỐT Bổ TOÁI: [18]

+ Chữa ù tai, đau lưng, thận hư, răng đau:

Cốt toái bổ tán nhỏ 4-8 g cho vào bầu dục lợn, nướng chín ăn

+ Chữa thấp khớp mãn tính (thể nhiệt):

sắc uống

+Chữa đau lưng, mỏi gối do thận hư, yếu:

+ Chữa phong thấp đau nhức thuộc huyết (Hải Thượng Lãn ông)

* Phương thuốc ngâm rượu

Vỏ chân chim 100 g Quy bần (quy nam hay tiền hồ) 40 g

Tất cả thái nhỏ, cho vào túi vải, bỏ vào trong hũ đã có rượu, lấy đất đậykín miệng hũ, cho hũ vào nồi nước và nấu cách thuỷ trong khoảng thời gian cháy hết một nén hương, rồi chôn xuống dưới đất 5 ngày đêm, uống dần ít một vào lúc đói

+ Thuốc chữa bong gân tụ máu:

Cốt toái bổ tươi, bóc bỏ hết lông tơ và lá khô, rửa sạch, giã nhỏ, rắp nước gói vào lá chuối đã nướng cho mềm, đắp lên các chỗ đau, bó lại Thay thuốc bó nhiều lần trong ngày Thường sau 3-7 ngày thì khỏi.

+ Chữa thận khí suy kém, nặng đầu, mỏi lưng, khô miệng, nóng

nhiều toàn thân mỏi mệt, chân tay bủn rủn, sức yếu:

Sắc uống

1.9 VÀI NÉT LIÊN QUAN ĐẾN PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC.

1.9.1 Khái quát phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [6], [13]

Thời gian gần đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) được ứng dụng rất nhiều vào việc phân tích thành phần hoá học của duợc liệu Sau đây là một vài nét về phương pháp này:

❖ Khái niệm:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hoá lý dùng để phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không hoà tan nhau Đó là pha tĩnh và pha động Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ Trong quá trình sắc ký luôn xảy ra quá

trình cân bằng động về sự phân bố của chất tan vào pha tĩnh và pha động khi pha động luôn chảy qua cột với một tốc độ nhất định.

❖ Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử Cùng với pha tĩnh,

để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động được bơm vào cột sắc ký dưới áp suất cao.Như vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, c vào cột tách, kết quả là các chất A, B, c sẽ được tách khỏi nhau khi đi qua cột

Sau khi ra khỏi cột các chất sẽ được phát hiện bằng detector và được chuyển qua bộ phận sử lý kết quả Kết quả sau khi được sử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình

Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, còn tín hiệu phân tích định lượng là diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được, phụ thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC

1.9.2 Các đại lượng đặc trưng:

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ

signal Component 1 Component 2

Hình 2: Các đại lượng đặc trưng trên sắc ký đồ

trong phép định lượng bằng HPLC

Đại lượng có ảnh hưởng đến việc phân tích bằng HPLC:

Thời gian lưu tp(Retention time)

+ Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

+ Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện mà HPLC đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 NGUYÊN LIỆU

Thân rễ của hai loài Cốt toái bổ được thu hái tại hai tỉnh Lạng Sơn (9/2003)

và tỉnh Hoà Bình (8/2003) Cạo bỏ hết lông bên ngoài, rửa sạch đất c á t, thái phiến, phơi và sấy khô để làm thực nghiệm

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.2.1 Phương tiện nghiên cứu:

+ Dụng cụ , máy móc:

- Cân phân tích Presica của Thụy Sĩ ở Bộ môn dược liệu

- Máy phân tích độ ẩm Prescica của Thuỵ Sĩ ở Bộ môn dược học cổ truyền

- Máy khuấy từ điều nhiệt Labinco 532 của Đức ở Phòng hoá lý I của Viện

+ Dung m ô i, hoá chất(đạt tiêu chuẩn phân tích)

Vi phẫu sau khi nhuộm kép được quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh

+ Soi bột, quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh

2.2.2.về mặt hoá học

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

+ Định tính các thành phần hoá học theo phương pháp hoá học[3], [10].+ Định tính flavonoid bằng SKLM với bản mỏng Silicagel GF254 (Merck)[3], [ 10] và phương pháp HPLC

+ Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân [3]

2.22.2 Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC.[6],[13].

+ Phương pháp định tính dựa vào vào HPLC.

Nguyên tắc: Các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau ở cùng điều

kiện tiến hành và mỗi chất sẽ có thời gian lưu hằng định ở cùng điều kiện chạy

HPLC

+ Phương pháp định lượng dựa vào HPLC

Nguyên tắc: Dựa vào diện tích pic (hay chiều cao pic) thu được và phụ thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem chạy HPLC

+ Xây dựng phương pháp định tính và định lượng thành phần hoá học của Cốt toái bổ dựa vào chất chuẩn

Trước khi xây dựng phương pháp chúng tôi đã tham khảo 1 số tài liệu có liên quan đến vấn đề này:

- Theo Dược điển Trung Quốc(1997) đã tiến hành định lượng hàm lượng Naringin trong Cốt toái bổ bằng phương pháp HPLC với chất chuẩn là

Naringin[20]

Tiến hành:

Pha tĩnh : Silicagel có gắn thêm chuỗi Polypeptid 18C

Pha động: Methanol:Acid Acetic:nước cất(35:4:61)

Detector: u v tại bước sóng Ằ=283nm

Số đĩa lý thuyết của cột không thấp dưới 3000

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg naringin chuẩn đã làm khô đến khối lượng không đổi ở 110°c , cho vào bình định mức 100 ml, cho methanol vào đến vạch và lắc cho hoà tan hoàn toàn Lấy chính xác 3ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10 m l, thêm methanol đến vạch và lắc đều.(60|ig naringin/ 1 ml dung dịch trên)

Chuẩn bị dung dịch thử : Cân chính xác 0,25 gam bột dược liệu cho vào bình nón có nũt mài, thêm 30 ml methanol và đun hồi lưu cách thuỷ trong 3

g iờ , làm lạnh và lọc Cho vào bình định mức 50 ml, rửa giấy lọc với một lượng nhỏ methanol vài lần và thêm methanol đến vạch và lắc đều

Yêu cầu : hàm lượng naringìn không thấp hơn 0,5% tính theo khối lượng bột khô.

-Theo tiêu chuẩn của hãng Servier của Pháp đưa ra với sản phẩm Daflon 500mg

Theo đó: Hesperidin(một thành phần íìavonoid trong Cốt toái bổ) được nhận biết và định lượng bằng phương pháp HPLC

Điều kiện chạy HPLC:

Pha động: Nước cất:Methanol: Acid acetic:Acetoniril(66:28:6:2)

Lọc qua màng có đường kính lỗ lọc là 0,45 |im

Tốc độ dòng : l,5ml/phút

Nhiệt độ c ộ t: 40°c

Detertor : u v tại bước sóng À,=275 nm

Chuẩn bị mẵu thử : Cho 5 viên thuốc(đã nghiền mịn) vào bình nón có nút mài, thêm 100,0ml dimethylsulfoxid(DMSO) và đậy nút lại Đun nóng ở 85°C- 95°c trong vòng ít nhất 45 phút với máy khuấy từ Để nguội và đem ly tâm Đem pha loãng ra 1/20 với DMSO Lọc qua màng có đường kính lỗ lọc 0,45|im.Sau đó tiến hành chạy sắc ký

Sau khi khảo sát hai phương pháp trên , chúng tôi đã tiến hành định tính và xây dựng phương pháp định lượng áp dụng với vị thuốc Cốt toái bổ của Việt Nam bằng phương pháp HPLC

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ* ■

3.1.KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VỀ THỰC VẬT.

3.1.1 Đặc điểm thực vật của hai loài cốt toái bổ

+ Đặc điểm thực vật mẫu cốt toái bổ thu hái ở Hoà Bình

- Quan sát mẫu cây cốt toái tử (hình 1) thu được tại tỉnh Hoà Bình chúng tôi thấy có các đặc điểm sau:

Thân rễ non tựa củ gừng, mọc bò dài, mọng nước có lông cứng màu vàng nâu Lá có hai loại: loại thứ nhất(lá hứng mùn) hình trái xoan, rộng 10 (cm), gần như nguyên ôm lấy thân, thường khô và có màu nâu;loại thứ hai (lá thường) có phiến màu xanh, dài 25-45 (cm), xẻ thường sâu thành 3-7 cặp thuỳ lông chim, trục lá có cánh, cuống lá dài 10-20 9cm).Các ổ tũi bào tử nhỏ, rải rác không đều khắp mặt dưới lá

Mẫu Cốt toái bổ này đã được Giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học là: Drynaria bonii Christ., Polypodiaceae.(Phụ lục 1)

+ Đặc điểm thực vật của mẫu cốt toái bổ thu hái ở Lạng Sơn

- Quan sát mẫu cây cốt toái bổ (hình 2) thu hái tại Lạng Sơn, chúng tôi thấy

có đặc điểm sau:

Thân rễ cong queo, dẹp, mọng nước, phủ lông dạng vẩy màu nâu đất Lá có hai loại: loại thứ nhất(lá hứng mùn), phiến xoan, gốc hình tim, mép có răng nhọn, dài 3-5 (cm), không cuống, phủ kín thân rễ; loại thứ hai( lá thường) có cuống ngắn 4-7 (cm), phiến dài 10-30 (cm), xẻ thuỳ sâu thành 7-13 cặp thuỳ lông chim, dày, dai, không lông.Các túi bào tử xếp hai hàng giữa gân phụ mặt dưới lá, bào tử vàng lợt, hình trái xoan

Mẫu Cốt toái bổ này đã được Giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa

Hình 1

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu:

3.I.2.I Vi phẫu

+ Các bước tiến hành :

- Chuẩn bị dược liệu : dược liệu đã được làm mềm trước bằng cách nấu trong vòng 4 giờ và ngâm trong cồn : nước : glycerin(l:l:l) Chọn lấy phần dược liệu còn đầy đủ đặc điểm thực v ậ t, lấy một phần để cắt tiêu bản

- Cắt vi phẫu : thực hiện cắt bằng dao nhỏ , có lưỡi mỏng và sắc

- Xử lý lát cắt: các lát cắt được xử lý theo các bước sau :

Tẩy sáng :

Đun lát cắt trong dung dịch ơoramin B 5-10% , khoảng 15-20 phút tính từ lúc sôi

Rửa bằng nước cất nhiều lần

Ngâm trong cloralhydrat để tẩy tinh bột và rửa nhiều lần bằng nước Rửa bằng acid acetic

Rửa bằng nước cất

Nhuộm màu:

Nhuộm vi phẫu bằng xanh metylen 30 giây

Rửa nhiều lần bằng nước cất

Nhuộm đổ son phèn 30 phút

Rửa nhiều lần bằng nước cất

Loại nước và lên tiêu bản:

Lần lượt rửa vi phẫu bằng cồn 30°, 50°, 70°, 90° và cồn tuyệt đối

Hình 3: Vi phẫu thân rễ của D bonii

Đặt vi phẫu vào một giọt bôm Canada trên phiến kính , đậy lá kính ,

để chỗ thoáng 2-3 tuần

- Chụp vi phẫu :

Tiêu bản sau khi để ổn định 2-3 tuần thì quan sát trên kính hiển vi và tiến hành chụp ảnh

+ Mô tả đặc điểm vi phẫu: Cả hai loài đều có những đặc điểm sau: Mặt cắt

của thân hình tròn Ngoài cùng là lớp bần(l) gồm nhiều hàng tế bào xếp đều đặn Bên trong là các tế bào mô mềm vỏ(2) hình tròn có màng mỏng , trong

mô mềm có nhiều trụ giữa Trong trụ giữa là một bó gỗ(3) và xung quanh là libe(4)

K ết luận: Trên ảnh và quan sát trên kính hiển vi, chúng tôi nhận thấy đặc điểm vi phẫu của hai loài cốt toái bổ nghiên cứu là giống nhau và không thể phân biệt hai loài nếu dựa vào vi phẫu.

3.2.I.2 Đặc điểm bột dược liệu:

+ Bột của loài Drỵnaria bonii:

Bột không mùi, có màu vàng nhạt Quan sát dưới kính hiển vi (ở vật kính 40)

và chụp ảnh thấy: Mảnh mô mềm có các tế bào lớn(l), mảnh mô mềm có chứa tinh thể calci oxalat hình khối nhỏ(2) Các mảnh mạch(3) Mảnh biểu bì mang lông che chở(4) Tinh bột (5) có vân tăng trưởng rõ

+ Bột thân rễ của loài Drynarỉa fortunei:

Bột không mùi, màu nâu đỏ Khi quan sát dưói kính hiển vi (ở vật kính 40) và chụp ảnh thấy: Mảnh mô mềm có các tế bào lớn(l) Các mảnh mạch(2) Mảnh biểu bì mang lông che chở(3) Tinh bột (4) có vân tăng trưởng rõ