TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN ACETOBECTER XYLINUM VÀ ỨNG DỤNG

Sự phát triển của khoa học nói chung và khoa học ứng dụng trong thực phẩm nói riêng đã cho chúng ta có những hiểu biết sâu sắc về hợp phần, cấu trúc, biến đổi trong quá trình chế biến và

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Nguyễn Huỳnh Diễm Châu 2005100030

Nguyễn Mai Ngọc Hân

Nguyễn Mai Huyền Trân

TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN

ACETOBECTER XYLINUM VÀ ỨNG DỤNG

Tháng 3/2012

LỜI MỞ ĐẦU

T ừ lâu thực phẩm đã là phần không thể thiếu trong đời sống con người Cùng với tính thiết yếu đó ngành công nghiệp thực phẩm đã ra đời và phát triển với mục đích là tạo nên nhưng sản phẩm thực phẩm dinh dưỡng, an toàn để phục vụ con người Sự phát triển của khoa học nói chung và khoa học ứng dụng trong thực phẩm nói riêng đã cho chúng ta có những hiểu biết sâu sắc về hợp phần, cấu trúc, biến đổi trong quá trình chế biến và sử dụng thực phẩm đặc biệt là của các chủng

vi khuẩn tưởng chừng là có hại, nhưng ở các nghiên cứu khoa học cho thấy rằng vi khuẩn có các ứng dụng đặc biệt cho các quá trình lên men, chất phụ gia và các lĩnh vực công nghệ khác nhau.

Acetobecter xylinum là một chủng vi khuẩn điển hình được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống như sản xuất thạch dừa, ứng dụng của màng BC trong

y học, mĩ phẩm…nhờ có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose

vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến…của màng BC Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc.

Để hiểu rõ hơn về những đặc tính cấu trúc cũng như là ứng dụng của Acetobecter xylinum Mời các bạn theo dõi theo đề tài tiểu luận này của chúng tôi Nếu có gì sai sót mong được sự góp ý chân thành từ các bạn.

TPHCM, tháng 3 năm 2012

Mục lục

I ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO CỦA GIỐNG VI KHUẨN ACETOBECTER………

1.1 Đặc điểm cấu tạo chung ………

1.2 Phân loại vi khuẩn acetobecter………

II ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG VI KHUẨN ACETOBECTER XYLINUM…………

2.1Phân loại và đặc điểm hình thái của Acetobecter xylinum………

2.2Đặc điểm sinh lí, sinh hóa………

2.3Màng BC của Acetobecter xylinum………

2.3.1 Cấu trúc của màng Bacterial cellulose

2.3.2 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới…………

2.4 Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến khả năng tạo màng BC của vi khuẩn…

2.4.1 Hàm lượng các chất………

2.4.1.1.1 Hàm lượng glucose………

2.4.1.1.2 Hàm lượng (NH4)SO4………

2.4.1.1.3 Hàm lượng MgSO4.7H2O………

2.4.1.1.4 Hàm lượng K2SO4………

2.4.2 Yếu tố môi trường………

2.4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống………

2.4.2.2 Độ thoáng khí………

2.4.2.3 Nhiệt độ………

2.4.2.4 Độ pH………

III ỨNG DỤNG……….

3.1 Trong công nghệ sản xuất thạch dừa………

3.1.1 Giới thiệu về nguyên liệu trái dừa………

3.1.1.1 Thành phần của trái dừa………

3.1.1.2 Cấu trúc của thạch dừa………

3.1.1.3 Một số biến động trong quá trình lên men………

3.1.2 Quy trình sản xuất thạch dừa………

3.1.2.1 Giải thích quy trình………

3.1.2.2 Cơ chế tạo thành sản phẩm………

3.1.2.3 Kiểm tra sản phẩm chế biến………

3.2 Ứng dụng trị bỏng ở vi khuẩn Axetobecter xylinum……….

3.2.1 Giới thiệu chung về bỏng………

3.2.2 Thực nghiệm của Acetobecter xylinum về trị bỏng ở thỏ………

3.3 Nước thải và vi sinh vật xử lí nước thải……….

3.3.1 Nước thải………

3.3.2 Acetobecter xylinum trong xử lí rác thải………

3.4 Các ứng dụng khác………

I. ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO CỦA GIỐNG VI KHUẨN ACETOBECTER

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế

1.1 Đặc điểm cấu tạo chung

Dạng hình que, tuỳ điều kiện nuôi cấy (to, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình

to ra

Kích thước thay đổi tuỳ loài (0.3-0.6 x

1.0-8.0μm)

Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc

chu mao), hoặc không di động (không có

tiên mao)

Không sinh nha bào tử

Hiếu khí bắt buộc

Chịu được độ acid cao

Vi khuẩn acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột

Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi

Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:

• Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.

• Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc.

• Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.

• Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành

váng không chắc chắn

Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+ và phân giải pepton Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe,

P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn actobacter

Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài acetobacter còn tổng hợp được vit B1, vit B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vit C)…

1.2 Phân loại vi khuẩn acetobecter

Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trông giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J-Frateur-1950 Sau đây là một số loài quan trọng nhất:

- Acetobacter schutzenbachii: trực khuẩn khá dài, tạo thành ván dày, và không bền

vững, có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11.5%acid acetic do đó thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp nhanh (phương pháp của Đức)

- Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển

hoá glucose thành acid gluconic hay sorbic thành sorbose Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như acid para aminopenzoic, acid panthoteric, acid nicotinic

- Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động Gặp điều kiện

nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra Tạo ra váng rất dày trên môi trường dịch thể Có thể phát triển được có nồng độ rượu cao (10%-12%) và làm tích luỹ đến 9.5% acid acetic Thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm (phương pháp của Pháp) Phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-30oC

- Acetobater xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và

khá dày.Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu xanh.Có thể tích luỹ 4.5% acid acetic trong môi trường Thường gặp loài vi khuẩn này cùng với nấm men trong “nấm chè”, còn gọilà

“thuỷ hoài sâm”, một loại sản phẩm giải khát

bổ dưỡng theo cách làm của nghười Trung Hoa Đó là một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nuớc giải khát trong các gia đình người Trung Hoa, trên mặt nước có một váng

vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè và đường

- Acetobacter aceti: Trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng chuỗi

dài Váng cùa vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iod, chúng có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu khá cao 11% và có thể

tích luỹ đến 6% acid acetic trong môi

trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ

34oC

- Acetobacter pasteurianum: hình dạng

tương tự như loại trên nhưng váng vi khuẩn

có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu

xanh khi nhuộm với thuốc Iod

Để ức chế sự phát triển của các loại nấm men

Mycoderma (thường phát triển đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter), người ta bổ sung vào môi trường phân lập 1-1.5% acid acetic

Do những ưu điểm vượt trội của chủng Acetobacter xylinum đã được nêu ở trên nên Acetobacter xylinum đựoc ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, ứnh dụng của màng BC

để trị bỏng, và nhiều ứng dụng khác trong các lĩnh vực y học, mĩ phẩm, v…v

II. ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG VI KHUẨN ACETOBECTER XYLINUM

II.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của Acetobecter xylinum.

Chủng Acetobecter xylinum này có nguồn từ Philippin Acetobecter xylinum thuộc nhóm vi khuần acetic Theo hệ thống phân loại cùa nhà khao hoc Bergey thì Acetobecter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, bộ Pseutomonadales, họ Pseudomonadieae

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường

A.xylinum là loại vi khuẩn dài khoảng 2µm, đứng riêng lẽ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H2SO4

Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A xylinum BHN2

Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5mm), tròn,

bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn

A.xylinum sinh trưởng ở pH < 5, nhiệt độ từ 28-320C và có thể tích lũy 4,5% acid acetic Acid acetic là sản phảm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động của vi khuẩn

II.2 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa.

Vi khuẩn A xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH = 4-6 Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

A.xylinum hấp thụ đường glucoso từ mội trường nuôi cấy trong tế bào vi khuẩn , glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào Kế đó

nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme Enzyme này có thể polyme hóa glucose thành celluose

A.xylinum tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy nước dừa có bổ sung các chất dinh dưỡng cấn thiết Cellulose là những polysaccharide không tan trong nước

mà tan trong môi trường kiềm Đó cũng là thành phần chính của màng tế bào thực vật.Polysaccharide của vi sinh vật thường được tích tụ đáng kể trong các môi trường lỏng

vì vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide Lượng các oligo và các polysaccharide nội bào có thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào

Tất cả các oligo và các polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosacharide Đơn vị monosacharide được thêm vào tham gia phản ứng ở dạng nucleotide, monosaccharide được hoạt hóa thường là dẫn xuất của các uridin diphosphat ( UDP-X) nhưng đôi khi cũng với các nucleotide, purin và pirimidin khác

Sự tổng hợp diễn ra theo các phản ứng sau:

…X-X-X-X- + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP

Cơ chế quá trình sinh tổng hợp diễn ra theo sự tổng hợp các loại polysaccharide phân nhánh chưa hiện rõ.

Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào các enzyme transferase

Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A xylinum bao gồm: Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính; Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose

II.3 Màng BC của Acetobecter xylinum.

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A xylinum hình

thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC

2.3.1 Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi

nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô

( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000) Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của

tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy

Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn

Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A xylinum được nghiên cứu đầu tiên bởi

Brown năm 1886 Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose

2.3.2 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới.

Trên thế giới màng Bacterial cellulose (BC) đã được ứng dụng rất nhiều trong các

lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm

da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các

nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển

chọn được chủng A xylinum BHN2 có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu

bước đầu cho thấy màng BC từ chủng A xylinum BHN2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người

II.4 Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến khả năng tạo màng BC của vi khuẩn.

II.4.1 Hàm lượng các chất.

II.4.1.1 Hàm lượng glucose

Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng hợp cellulose của Acetobacter xylinum Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là glucose Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A xylinum BHN2

II.4.1.2 Hàm lượng (NH4)SO4

Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất

II.4.1.3 Hàm lượng MgSO4.7H2O

MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC

II.4.1.4 Hàm lượng K2SO4

Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có vai trò

hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum ( Ross et.al,

1991) Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng BC cao nhất

II.4.2 Yếu tố môi trường.

II.4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.

Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn

Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào

Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich thể Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng

BC với năng suất cao nhất

Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giống và thời gian lên men

II.4.2.2 Độ thoáng khí

Vi khuẩn A xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí Trong cơ chế của quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn Trong thực tế độ thông khí quyết định năng suất BC Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao trong lên men chìm Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng

Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxy cao Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC

II.4.2.3 Nhiệt độ