Bài giảng chương 4 ứng dụng enzyme trong bảo quản và chế biến thực phẩm

Công nghệ sinh học protein và enzyme Các protein và enzyme đã được con người sử dụng từ lâu, nhưng việc thu nhận chúng dễ dàng với số lượng lớn và nhiều chủng loại từng là ước mơ của cá

CHƯƠNG IV:

ỨNG DỤNG ENZYME TRONG

BẢO QUẢN

VÀ CHẾ BIẾN THỰC PHẨM

MỤC LỤC

1 Công nghệ sinh học protein và enzyme

2 Ứng dụng enzyme trong bảo quản và chế biến thực phẩm

3 Ứng dụng enzyme trong kiểm tra chất lượng thực phẩm



1 Công nghệ sinh học protein và enzyme

Các protein và enzyme đã được con người sử dụng

từ lâu, nhưng việc thu nhận chúng dễ dàng với số lượng lớn và nhiều chủng loại từng là ước mơ của các nhà khoa học Trước đây, công nghệ protein và

enzyme là phần chủ yếu của kĩ thuật hoá sinh

(biochemical engineering) Ngày nay, nó phát triển

mạnh, nhất là với sự ra đời của Genomics và

Proteomics, với các đặc điểm :

– Các phân tử protein có cấu trúc phức tạp nhất, nên để thu các chế phẩm có đầy đủ hoạt tính sinh học đòi hỏi không những các kĩ thuật chiết tách, tinh sạch tốt, mà còn bảo quản được lâu dài

– Nhiều ứng dụng trong trị liệu cho người và các lĩnh vực khác nhau – Nhiều protein truyền thống được thay thế dần bằng các r-protein

1.1 PROTEIN

1.1.1 Các bậc cấu trúc

Protein là polymer gồm các amino acid

nối với nhau bằng cầu nối peptide và hình

thành cấu trúc không gian 3 chiều khi ở

dạng tự nhiên

Tham gia thành phần cấu tạo protein có

20 loại L-amino acid với các chữ viết tắt

gồm ba chữ hoặc với chỉ một chữ Ví dụ : Lysine (Lys - K), Arginine (Arg - R),

Histidine (His - H),

Phân tử protein có thể có 4 bậc cấu trúc như sau :

– Cấu trúc bậc một: Chuỗi polypeptide mạch

thẳng

– Cấu trúc bậc hai : Chuỗi polypeptide mạch

thẳng xoắn theo kiểu lò xo (xoắn alpha và beta)

– Cấu trúc bậc ba : Chuỗi polypeptide cấu trúc

bậc hai cuộn xếp theo kiểu đặc trưng tạo cấu trúc không gian ba chiều phức tạp (dạng sợi, cuộn hay khối cầu)

– Cấu trúc bậc bốn : 2 hay nhiều chuỗi

polypeptide cấu trúc bậc ba liên kết với nhau

1.1.2 Sự ổn định và gấp cuộn

Khi protein vừa đƣợc tổng hợp xong, nó gấp cuộn

thành cấu trúc không gian ba chiều xác định chức năng sinh học, đồng thời ổn định cấu trúc Trong

nhiều năm, các nhà hoá sinh học cho rằng sự cuộn

gấp của phân tử protein được xác định tự động bởi cấu trúc bậc một Nhƣng thực tế cho thấy, trình tự

này không đủ đảm bảo cho polypeptide tạo dạng hình có tính đặc hiệu cao để đáp ứng đúng chức

năng của nó Nhóm các protein chaperone giúp các polypeptide gấp cuộn đúng dạng hình không gian

ba chiều có đủ hoạt tính sinh học và một số enzyme nhƣ disulfide isomerase giúp tạo cầu nối disulfide

1.1.3 Các biến đổi sau dịch mã

Nhiều polypeptide chịu những biến đổi hoá

trị trong hoặc sau dịch mã trên ribosome Các

biến đổi này ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học hoặc ổn định cấu trúc của polypeptide

– Sự cắt xén bởi protease : Cắt bớt một đoạn

peptide của protein làm hoạt hoá chức năng

protein hay enzyme Biến đổi có tính đặc hiệu

và không thuận nghịch Thường gặp ở các

tiền enzyme và các protein đích được đưa

vào các bào quan hoặc xuất ra khỏi tế bào Ví

dụ, các enzyme tiêu hoá như trypsin,

chymotrypsin và pepsin.

– Glycosyl hoá : Gắn thêm các gốc hoặc chuỗi

đường Thường gặp ở các protein màng hoặc

các protein ngoại bào ở Eukaryotae Glycosyl

hoá có nhiều năng lượng: trực tiếp làm trung gian cho các hiệu ứng sinh học của một số protein (hCG và erythropoetin), định hướng mục tiêu (các enzyme của lysosome), nhận biết (các thụ thể), ổn định cấu trúc, thay đổi độ hoà tan, tăng bán chu kì tồn tại của phân tử

– Phosphoryl hoá : Gắn thêm nhóm phosphate

vào protein, mà chất cho chủ yếu là ATP

Quá trình có thể thuận nghịch nhờ hệ thống

2 enzyme : kinase và phosphatase Nó thay đổi hoạt tính sinh học hoặc tính chất hoá lí của polypeptide

Ngoài ra, còn có nhiều kiểu biến đổi sau

dịch mã khác như acetyl hoá (acetylation),

acyl hoá (acylation), amid hoá (amidation), sulfate hoá (sulfation), hydroxyl hoá

(hydroxylation), tạo nối SS,

1.2.1 Khái quát về enzyme

Từ hàng ngàn năm trước đây, loài người đã

sử dụng các enzyme trong chế biến thực phẩm và nước giải khát Năm 1897, E.Buchner thu dịch nấm men nghiền nát và thấy hoạt tính lên men rượu của nó Ông gọi chúng là enzyme (tiếng Hi Lạp : en = trong, zyme = nấm men và enzyme có nghĩa trong nấm men)

1.2 ENZYME

Nhờ có enzyme các phản ứng hoá học được thực hiện trong tế bào sống với sự hoàn hảo trong điều kiện đẳng nhiệt (nhiệt độ không đổi), đẳng áp (áp suất không đổi) và

có các đặc điểm sau: phản ứng có hiệu quả cao, nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo dây chuyền, không phải tinh sạch sản phẩm

ở từng công đoạn, các phản ứng chịu sự điều hòa hợp lí và tiết kiệm nhất, lại ít tiêu tốn năng lượng Chúng có tính đặc hiệu cao

và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ

Về cấu tạo, tất cả enzyme đều là protein

Ở nhiều enzyme, phần protein cần gắn

một phân tử thứ hai như với cofactor

(các ion kim lọai như Mg++, Zn++,…)

hoặc coenzyme (phân tử không phải

peptid như coenzyme A) hay nhóm prosthetic (như các heme) mới có họat tính Điều này cần tính đến khi chiết tách và tinh sạch enzyme và thường phải có biện pháp bổ sung các nhóm tương ứng để nhận enzyme có hoạt tính Một biện pháp khác là sử dụng enzyme trong tế bào nguyên vẹn

Tính đặc hiệu của enzyme gồm 2 dạng : – Đặc hiệu phản ứng chỉ biểu hiện với một loại liên kết hóa học nhất định như

lipase chỉ cắt liên kết ester nối glycerol

và acid béo của nhiều loại lipid khác nhau

– Đặc hiệu cơ chất thể hiện chuyên biệt

cho những cơ chất nhất định như urease chỉ phân hủy urea thành ammonia và CO2, nhưng không tác dụng đối với các chất khác

Các enzyme có thể phân biệt được

những cơ chất thậm chí rất giống nhau,

như các đồng phân (isomer) Ví dụ :

enzyme sucrase chỉ phân huỷ saccharose (sucrose) thành glucose và fructose, nhưng không tác dụng đối với 2 đồng

phân khác là maltose và lactose

Các enzyme có bản chất protein, nên chúng nhạy cảm với các tác động của

môi trường như nồng độ cơ chất, nồng

độ enzyme, nhiệt độ, pH và các chất ức chế (kìm hãm)

Cĩ khoảng 3000 enzyme đã được biết và được phân loại

thành 6 nhĩm dựa vào loại phản ứng mà chúng xúc tác :

1) Oxi hĩa - khử (Oxido-reductase); 2) Transferase

(chuyển các nhĩm chức năng cĩ chứa C, N, hay S) ; 3)

Hydrolase (tách các liên kết CC, CO, CN, CS,

Chalogen) ; 4) Lyase (thêm vào các nối đơi) ; 5)

Isomerase ; 6) Ligase

Rõ ràng các enzyme cĩ khả năng xúc tác rất nhiều

loại phản ứng hố học khác nhau Sự đa dạng này cịn tăng

lên đáng kể khi nĩ kết hợp với các nhĩm chất bổ sung như coenzyme Do vậy, một xu hướng quan trọng trong phát

triển cơng nghệ hố học hiện nay là sử dụng chúng trong

tổng hợp hố học để vừa giảm ơ nhiễm mơi trường, lại vừa

ít tiêu tốn năng lượng hơn

1.2.2 Các enzyme và protein cực đoan

Việc phát hiện nhiều VSV cực đoan (extremophlies) đã mở ra khả năng thu nhận các enzyme để ứng dụng vào thực tiễn Phần lớn các VSV cực đoan chƣa nuôi đƣợc, nhƣng sử dụng KTDT hứa hẹn sẽ chinh phục đƣợc các enzyme và protein từ các VSV

– Các enzyme từ sinh vật chịu nhiệt cao là mục

tiêu cần hướng tới trong các quy trình chế biến công nghiệp, vì thực hiện ở nhiệt độ cao sẽ giảm nhiễm bởi nhiều VSV khác và có phản ứng nhanh hơn Hiện DNA polymerase chịu nhiệt được sử dụng rộng rãi Ngoài ra,

nhiều amylase, protease,… chịu nhiệt cao

(có thể đến 118 O C) đã được phát hiện

– Các glycoprotein "chống đông đá" ức chế sự

hình thành các tinh thể nước đá ở các sinh vật chịu lạnh như cá ở các cực của Trái đất chịu được nhiệt độ 1,8 O C liên tục mà dịch

cơ thể không đông đặc

– Các enzyme cực đoan trong dung môi hữu cơ : Mãi

đến gần đây có quan niệm phổ biến là khi cho enzyme

vào các dung môi hữu cơ (bezene, acetone, toluene,…), chúng sẽ mất hoạt tính Thực tế cho thấy, nhiều

enzyme khi bổ sung vào các dung môi hữu cơ khác

nhau, chúng vẫn có hoạt tính xúc tác dù trong hệ

thống có ít hoặc không có nước Việc sử dụng các enzyme trong những điều kiện như vậy hứa hẹn một

tiềm năng lớn, vì có nhiều lợi thế : tăng tính hoà tan

của các chất phản ứng (reactants) hoặc các sản

phẩm ; tăng tính chịu nhiệt của enzyme ; dễ thu hồi

sau sử dụng nhờ lọc và li tâm ; các dung môi hữu cơ ngăn chặn các VSV gây nhiễm

1.3 CỐ ĐỊNH ENZYME VÀ TẾ BÀO

Các enzyme thường sử dụng trong dung dịch và sau đó không thu hồi được, mà việc chiết tách chúng rất tốn kém làm giá thành cao

Để sử dụng enzyme nhiều lần và hiệu quả hơn,

kĩ thuật cố định enzyme hay giữ im (enzyme

immobilisation) ra đời mở rộng khả năng ứng dụng chúng

Các phương pháp cố định enzyme

Có 4 phương pháp cố định enzyme :

– Phương pháp gắn cơ học hay hấp phụ (Absortion) : Sử dụng các vật liệu chất nền (matrix

material) xốp có nhiều lỗ hỏng nhƣ chất trao đổi ion, nhựa resin, than hoạt tính, đất sét, oxide nhôm, sợi thủy tinh xốp, sành, sứ, có thể làm cho các enzyme hoặc tế bào gắn vào những khe và khi sử dụng enzyme không bị mất

Cơ chất gắn cơ học vào chất nền và chất

trao đổi ion

– Phương pháp liên kết chéo (Cross-linking) : Dùng các chất trung gian như glutaraldehyde, bisisocyanate, bisdiazobenzidine, BSA (bovine serum albumin) để

gắn enzyme vào chất nền Hoạt tính enzyme thường

mạnh và ổn định hơn nếu liên kết chéo với glutaraldehyde hay với BSA

– Liên kết cộng hoá trị (Covalent coupling) : agarose, cellulose, PVC (polyvinyl chloride), chất trao đổi ion, sợi thủy tinh xốp (porous glass) là các chất nền

Phương pháp này rất phức tạp, nhưng nó làm cho hoạt tính của enzyme được khôi phục và ổn định hơn

– Phương pháp nhốt (Entrapment): Sử dụng cho cả enzyme và tế bào Các chất nền có acid alginic (C6H8O6)n , carageenan, collagen, polyacrylamide, gelatin, silicon rubber, polyurethans Các chất nhốt

bao bên ngoài, nhưng vẫn cho các cơ chất cần biến

đổi có thể ra vào qua màng Alginat, carageenan chiết

tách từ tảo thường được sử dụng

Nhốt trong mạng gel và trong chất nền

Cĩ thể sử dụng các enzyme cố định nhiều lần, thậm chí trong nửa năm hoặc cả năm Hiện nay, phương pháp này được sử dụng nhiều hơn cả

Phương pháp nhốt được ứng dụng cho tế bào nguyên vẹn Khi cố định tế bào, phải tạo điều kiện

để tế bào chết được thay thế bằng tế bào mới Cĩ định tế bào nguyên vẹn cĩ nhiều ưu điểm :

– Đơn giản hơn, vì khơng phải tốn kém nhiều cho chiết tách tinh sạch enzyme, nên giá thành thấp

– Các enzyme hồn chỉnh được hình thành trong tế bào nên khơng cần bổ sung các cofactor hay coenzyme như enzyme tinh chế ngồi tế bào

1.4 Bốn vai trò chính của enzyme

trong công nghiệp thực phẩm:

a) Enzyme khắc phục khiếm khuyết tự nhiên của nguyên

liệu:

Các sản phẩm nông sản có chất lượng về dinh dưỡng, thành phần hóa học, tính chất cảm quan phụ thuộc nhiều vào: giống, loại nông sản, điều kiện canh tác, điều kiện thu hái và vận chuyển, điều kiện bảo quản

Do vậy chất lượng sản phẩm được tạo ra từ nguyên liệu dao động rất lớn Trong thực tế nếu chất lượng nguyên liệu quá kém người ta phải điều khiển các phản ứng xúc tác bởi enzyme để tạo nên các thành phần thiếu hụt trong nguyên liệu đưa vào sản xuất

• Trong sản xuất bia, nguyên liệu chính là malt đại

mạch Để khắc phục malt đại mạch chát lượng kém ( không có khả năng chuyển hóa hết tinh bột thành dextrin, đường lên men ) thường dùng các chế phẩm enzyme thủy phân thuộc hệ amylase như Termamyl 120L hoặc SC , hệ enzyme protease như Neutrase 0,5L

• Dứa , cà chua khi đưa vào sản xuất có độ chín khác

nhau, phải qua giai đoạn ủ chín để chuyển hóa protopectin ( 1 hợp chất pectin có cấu tạo phức tạp, ngoài các chuỗi polygalacturonic còn có các thành phần khác như axit acetic, cellulose, galactose,rhamnose > tạo nên cấu trúc cứng của các loại quả) về dạng pectin hòa tan nhờ enzyme pectinase Hoặc sau khi chà sẽ đưa enzyme pectinase vào để phá vỡ màng tế bào thực vật giúp tạo ra các vết nứt trên quả tạo thành rãnh thoát dịch chiết ra ngoài > làm tăng hiệu suất chiết dịch quả

b) Enzyme nâng cao giá trị thương phẩm của nguyên liệu:

Trong thực tế có rất nhiều các nguyên liệu nông sản có giá trị thương phẩm thấp Sau khi được chuyển hóa bởi tác dụng của enzyme thì giá trị thương phẩm cao hơn rất nhiều, chúng có thể là các sản phẩm không những có giá trị dinh dưỡng cao mà còn phục vụ được cho các mục đích khác ngoài thực phẩm như y học

Ví dụ:trong công nghiệp chế biến tinh bột, mục đích của nhà máy chế biến tinh bột là chuyển hóa tinh bột từ một hợp chất có phân tử lượng cao, hệ số hấp thu kém, giá trị thương phẩm thấp thành các sản phẩm mới có

hệ số hấp thu cao hơn, đa dạng hơn , giá trị thương phẩm cao, ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến các sản phẩm khác

c) Enzyme là công cụ trong quá trình chuyển hóa công

nghệ:

trong các nhà máy chế biến thực phẩm thì enzyme được sử dụng như một công cụ của toàn bộ quá trình chuyển hóa hoặc là toàn bộ quá trình chuyển hóa trong dây chuyền chế biến Nếu thiếu sự có mặt của

nó thì quá trình chế biến không thành công

Ví dụ: trong sản xuất bia, quá trình chế biến dịch đường có mục tiêu là tìm điều kiện tối ưu chuyển nhiều nhất có thể các chất có trong nguyên liệu đi vào dịch trở thành chất chiết của dịch đường Để đạt được mục đích này thì ngoài quá trình khuếch tán đơn giản của các thành phần mà chủ yếu là quá trình chuyển hóa các hợp chất cao phân tử không hòa tan thành các chất thấp phân tử hoà tan dưới tác dụng của nhiều

hệ enzyme khác nhau

d) Enzyme tăng tính chất cảm quan của sản phẩm:

Trong chế biến thực phẩm sau khi xáy ra các giai đoạn chuyển hóa chính, thông thường các sản phảm thực phẩm chưa hẳn đã đạt chất lượng cảm quan tối

ưu Vì thế chúng có các giai đoạn hoàn thiện sản phẩm , trong giai đoạn này hoặc là tạo nên những điều kiên mới cho các enzyme bản thể có lợi phát huy tác dụng có lợi hoặc bổ sung các enzyme từ ngoài vào để làm tăng chất lượng cảm quan của sản phẩm như cải thiện mùi và vị của sản phẩm

Ví dụ: làm trong rượu vang nhờ chủ yếu là pectinase , đây là chỉ tiêu chất lượng quan trọng nhất của rượu vang Với mục đích làm trong rượu các chế phẩm enzyme sử dụng phải có khả năng chịu được nồng độ rượu rừ 10-12% và không chứa các enzyme oxi hóa làm ảnh hưởng đến màu sắc và mùi vị của sản phẩm