Sử dụng lectin chiết tách từ mít dại ( artocarpus masticata moraceae ) để tinh chế và xác định hàm lượng iga trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung

Mặc dù lectin không có nguồn gốc miễn dịch nhưng nổ vẫn có khả năng kết hợp nhiều loại tế bào theo kiểu đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể, liên kết với đường hoặc những hợp chất chứa đườ

B ộ Y TẾ TRƯỜNÍ Ỉ ĐẠI HỌC Dược H À NỘI

áti hàij, lú Lồttg hiỀÍ o'tt iãtL ằắe têưJ)^ Ẵ ^ à ũ CKim & t i im

OTírĩ QtgMitỊhí <ĩ)ăn Mọi, nhữtiạ tiqư ĩỉi ¿tã tậtt Íìttíi itướttg, dẫtt, kíuiỊỊỀii idtíeii ĩtơnợ, íùỀti ettt Irtìttợ ằtiối q u ả Ịrìtilt ihư& itÀỀtt đễ t à i nàtj^,

<5/11 ae/it ehâtt títà ttii êtn o'fi CTtỹ ^ 0 Q lạạe MÌỀỉt trưỜỊtạ ^ ạ ỉ họe 3Cỉttía hoa ÍTh’ ttiùỀti Ịhuơe ^rùịttiỊ ^ ạ i “ 700e, Q «tfé g iíi '3C>à Qỉộl, nạưị'í đ ã quan tồtn ohỉ ĩmo ồ cỉto ettt tthiềtt tị kiỂMi qutị htỉti.

ị m eiittíỊ x itt eh íìĩì ỉh à ttỉt etittt o'tt íTrV Q íg ttụ ễư (Xjuătt ^ h ắ n g

éttạ Ufàtt i i t ỉ ếe th ầíị eơ giát), eơ ^ Ị tạ tn ^ íta ttit ^Mtùơttq ồ ũáe ê kụ

ỉh u ậ t ơiỀtt trong, hơ tttơtt '3ỗtìá sinỉt ^rưỉutíị ^ a i íw e ^u'tì'e 3iCrt Qĩ.ơíf íỹcí

QtạuụễMt '3õạnh - ^ riiị n q Ịỉỉiồiĩq, £a'Tio Sin ít itơ d - <Ĩ)ÌỀMI <ĩ)ị sinit íỉịeh

íễ, CKhtìíỉL ^ I tụ S ả tt - ^ ệ ttií oJệjt ^pitụ S à ti Qlội đ ă tậ n ỉín ii ạ iá ụ đ è tạú đỉềií kiện th u ận lợi eito £ỉti trtìitạ iu ố i litị t g ỉm t húũ iập, o ă kỡàti Ihàttít kltoả lu ậ tt íố t ttạiùỀp,.

'Tơà Qtồif iháttạ. 5 năttt 2002

S in h oiỂit

7ơà ^ h ị M ình & tâ n

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ƠÍI

Các chữ viết tất trong khoá luận

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

PHẦN 1 : TỔNG Q U A N 3

1.1 Sơ lược về lecitin 3

1.1.1 Lịch sử của lectin 3

1.1.2 Các tính chất của lectin 6

1 1.1.3 Các phưtĩng pháp tinh chế ỉectin 10

1.1.4 ứ ig dụng của lectin 11

1.2 Cấu trúc, chức năng và vai trò của các globulin miễn địch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể 12

1.2.1 Một số khái niệm chung 12

1.2.2 Chức năng của các globulin miễn dịch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể 13

1.2.3 IgA- Đặc điểm, cấu trúc và mối liên quan với các bệnh lý 14 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ k Ế T QUẢ 17 2.1 Nguyên ỉiệu và phưcíng pháp thực nghiệm 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Hoá chất và thuốc thử 18

2.1.3 Thiết bị và máy m óc 18

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 25

2.2.1 Nghiên cứu khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin trong dịch chiết thô 1 (D 1 ) 25

2.2.2 Giai đoạn chiết lectin từ hạt mít dại 25

2.2.3 Giai đoạn kết tủa Protein- lectin 26

2.2.4 Giai đoạn tinh chế leclin mít d ạ i 28

2.2.5 Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin 31

2.2.6 Kết quả điện di lectin mít dại tinh chế trên gel polyacrylamid 32

2.2.7 Kết quả tinh chê IgA bằng cột sắc ký ái lực Sepharose-Jacalin 32

2.2.8 Kiểm tra khả nãng kết hợp của IgA tinh chế và lectin mít dại tinh chế bằng phưcfng pháp ELLA 34

2.2.9 Sử dụng lectin mít tinh chế xác định sự thay đổi hàm lượng IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung 35

2.3 Bàn luân 37

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X U Ấ l 39

Tài liệu iham khảo

CÁC CHỬ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN

D2 : Dịch chiết hoà tan sau tủa

D3 : Dịch thu hồi lectin

DEAE: Dimethyl aminoethyl

E U S A : Enzyme “ Linked Immuno Sorbent Assay

E L L A : Enzyme - Linked Lectino Sorbent Assay

H Đ R : Hoạt độ riêng

H Đ T S ; Hoạt độ tổng số

HAA : Heamatoagglutinating activity

H IV : Human Immunodeficient Virus

kD a ; Kilo Dalton

PBS : Phosphate buffered saline

SDS : Sodium dodecyl sulphate

ĐẶT VẤN ĐỂ

Nếu như Hormon, enzym, vitam in là những chất có đặc tính sinh học

có vai trò quan trọng đối với cơ thể thí lectin cũng là chất có đặc tính sinh học đặc biệt Mặc dù lectin không có nguồn gốc miễn dịch nhưng nổ vẫn có khả năng kết hợp nhiều loại tế bào theo kiểu đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể, liên kết với đường hoặc những hợp chất chứa đường

Hơn một thế kỷ qua kể từ lần đầu tiên được phát hiện (1888), lectin đã thu hút sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới bởi mức đô phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng ứng dụng đa dạng của nó trong các lĩnh vực của đời sống

Lectin được phân bố nhiều nhất trong giới thực vật, đặc biệt tập trung ở hai họ Fabaceae và Moraceae Trong số những lectin được phát hiện thì lectin được tinh chế từ chi Artocapus của họ Moraceae có những đặc tính đặc biệt và

đã được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực miễn dịch học như; khả năng kết hợp đặc hiệu IgA, được sử dụng để tinh chế IgA và Iheo dõi hàm lượng IgA trong một số bệnh, khả năng kích thích phan chia tế bào lympho, khả năng tưcfng tác với glycoprotein ở bề mặt tế bào lyinpho T của người là phân tử kết hợp đặc hiệu với virus HIV trong pha nhiễm khuẩn đẩu tiên của AIDS Như vậy, lectin tinh chế từ các loài mít đã thực sự trở thành công cụ hữu ích cho việc chẩn đoán một số căn bệnh hiện nay trên thế giới

ở Việt Nam đã có nhiều cồng trình nghiên cứu về lectin tinh chế từ các loài mít và cũng cho một số ứng dụng khả quan K ế thừa những thành quả của các công trình trên, chúng tôi thực hiện đề tài này với các mục tiêu và nội dung sau:

Chiết tách và tinh chế lectin từ cây Artocơrpus masticata G Morơceae

có hiệu suât và độ tinh sạch cao

Tinh chế IgA từ dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung

Sử dụng lectin tinh chế ứng dụng để xác định hàm lượng IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung và người bình thường bằng phương pháp ELLA

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về ỉectin:

1.1.1 Lịch sử của lectỉn:

Năm 1888, Stillmark đã tìm ra một chất độc được chiết từ cây thẩu dẩu,

có hoạt tính ngưng kết hồng cầu, ông gọi chúng là ricin Công bố của Stillmark đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Sau ricin , các nhà khoa học khác cũng tách chiết được các chất độc khác có đặc tính tương tự ricin như abrin, crotÌn và còn phát hiện thấy các chất này được phân bố rộng rãi trong

cả giới thực vật và động vật Đầu tiên, các nhà khoa học nhận thấy sự ngưng kết tế bào hồng cầu của các độc tố nói trên mang tính chọn lọc nhóm máu [24, 25] Vì vậy Boyd (1954) gọi chúng là lectin Thuật ngữ này xuất phát từ tiếng Latinh là “ lectus”, là thì quá khứ của động từ Legere có nghĩa là chọn lọc.Sau đó, vào những năm cuối thập kỷ 60, khi nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của lectin cho thấy: có khoảng 25% lectin tìm thấy là có khả năng gây ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [25] Ngoài ra người ta còn phát hiện thấy một đặc tính quan trọng nữa của lectin, đó là khả năng tưcmg tác với các loại đường Vì vậy khái niệm của lectin được bổ xung và định nghĩa như sau:

“Lectin là những chất có bản chất là protein hay glycoprotein có khả nãng Wcfng tác vói đường và có đặc tính cơ bản là khả nâng gây ngưng kết tế bào" [25]

Mặc dù các khái niệm của lectin thay đổi nhưng ‘lectin” vẫn được sử dụng như một thuật ngữ khoa học

* Tình hình nghiên cứu trên thế giới:

Sau hơn 100 năm kể từ khi Stillmark tìm ra ricin - lectin đầu tiên, quá trình nghiên cứu lectin tiếp theo được chia làm 3 giai đoạn:

Cuối tliế kỷ XIX đầu thể kỷ XX: Các nhà khoa học tập trung vào nghiên

cứu, điều tra sự phân bố của lectin trong giới sinh vật, rất nhiều công trình nghiên cứu được công bô như của: Stillmark (1888), Helin (1891), Lansteiner (1902), Lansteiner và Raubischeck (1903), Melden (Ỉ909), Korbert(1913), Ludwingvaf Kraus(1902), Kayser(1903), Guyot (1908) đã xác định lectin được phân bố rộng rãi trong thực vật, động vật và cả các vi sinh vật như virus, vi nấm [25J

Từ năm 1950- 1970: Ngoài các công trình về điều tra cơ bản, người ta bắt đầu tập trung vào chiết tách tinh chế để xác định cấu tạo phân tù (cấu tạo bâc ỉ và cấu trúc không gian) của lectin Phương pháp tinh chế lectin đã trải qua nhiều giai đoạn nghiên cứu từ sắc kỹ cột, đến sắc ký trao đổi ion và cuối cùng dựa trên khả năng tưưiig tác đặc hiệu với đường của lectin, các nhà khoa học đã tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký ái lực Kỹ thuật này đã được Agrwal và Golsteiner nghiên cứu và sử dụng đầu tiên vào năm

1965 [24J Đây ỉà phương pháp tinh chế lectin hiệu quả nhất, cho chế phẩm lectin có độ tinh sạch cao và hiện đang được sử dụng tại nhiều nơi trên thế giới

T ừ năm 1970 đến nay: Nhờ sự hoàn thiện về kỹ thuật tinh chế lectin, các

nghiên cứu tiếp Iheo về lectin được phát triển mạnh sang hướng ứng dụng trong các lĩnh vực của đời sống và đả đạt được những kết quả khả quan; Lectin chiết tách từ các cá thể họ hàng gần gũi có những đặc tính sinh học

và có cấu tạo khá giống nhau (Soni-1982), (Wully-1984) được sử dụng làm

cơ sở để gián tiếp phân loại thực vật ở mức độ phân tử

Lectin được chiết tách từ đậu thận đỏ {Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) có

khả năng kích thích sự phân chia bạch cầu người

Lectin được chiết suất từ sam biển châu Mỹ {Lỉmulus polyphemus) có khả

năng phân tách bạch cầu và tế bào ung thư máu

- Con A được sử dụng trong chẩn đoán một số bệnh ung thư có liên quan đến sự biến đổi hàm lượng AFP dựa trên tương tác đặc hiệu giữa Con A và AFP [23 j.

- Lectin của một số loài inít có khả năng kích thích phan chia tế bào lympho

T_CD4^ ở người, Lectin từ loài mít mật {ArỉocarỊ?us heteropbyỉỉus

Moraceae) còn có khả nâng tương tác với glycoprotein trên bế mặt tế bào

T_CD% , đem iại nhiều hy vọng cho một loại thuốc mới hữu hiệu trong chẩn đoán và điều trị căn bệnh thế kỷ AIDS [31J

* Nghiên cứu Lectin ở Việt Nam:

Nghiên cứu lectin mới được triển khai ở Việt Nam trong khoảng 20 năm nay (kể từ năm 1983) theo 3 hướng cơ bản:

• Điều tra sự phân bố lectin trong giới sinh vật ở Việt Nam

• Tách chiết tinh chế và bước đáu nghiên cứu tính chất và cấu trúc của lectin

• Nghiên cứu ứng dụng của lectin

Mặc dù thời gian nghiên cứu chưa nhiều nhưng cũng đã thu được nhiều kết quả khả quan:

• Nhiều công trình điều tra đã khẳng định lectin có sự phân bố rông rãi trong giới sinh vật của Việt Nam [2, 6 , 15J Nhiều công trình đã tách chiết thành công một số lectiii, từ đó tiếp tục nghiên cứu tính chấl và cấu trúc phân tử của chúng 12 |

• Bước đầu nghiên cứu ứng đụng: Đưa lectin vào chẩn đoán thai sớm [2J, tinh chế lgA| và nghiên cứu biểu hiện bệnh lý của chúng ở người [8], sử dụng lectin để chẩn đoán bệnh nhiễm sán máng [9J

Các nghiên cứu trên đây cho thấy một triển vọng tốt đẹp về nghiên cứu lectin ở Việt Nam Sô' lượng lectin tinh chế ngày càng nhiều và chắc chắn sẽ

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh học, dược học, y h ọ c và đáp ứng với nhu cẩu thực tiễn Việt Nam.

1.1.2 Các tính chất của lectin:

Tính chất vật lý và hoá học:

Khới lượng phân tỉc Khối lượng phân tử của ỉectin rất khác nhau,

chúng có khoảng dao động rất lớn từ vài nghìn Da (Lectin rễ cây gai-

ưì ticaceơe 8500 Da), đến vài trăm ngiiìn Da (Lectin của loài sam biển châu Á Tachyĩeus trideníus 700 000 Da) Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khối

lượng phân tử của lectin khôtig liên quan đến hoạt tính của lectin và cũng không mang tính đặc trưng hay mức độ tiến hoá của loài hoặc cá thể [24],

Tính tan: Lee tin có bản chất là protein nên có khả năng hoà tan trong

nước, đặc biệt đễ hoà tan trong dung dịch muối loãng Vì vậy, nước muối sinh

lý thường được dùng để làm dung môi chiết, tách và tinh chế ỉectin Ngược lại lectin dễ bị kết tủa bởi aceton, alcol ở nhiệt độ thấp cũng như một số muối

trung tính ở nồng độ cao và kim loại nặng.

K hả năng tưong tác vói đường: Khả năng tưomg tác với đường là một

trong những đặc tính quan trọng của lectin Lectin có khả năng tương tác với đường đơn và cả các đường nằm trên bề mặt tế bào Bản chất hoá học của tưoíig tác này có nhiểu giả thuyết nhưng các nhà khoa học đều thống nhất: Sự bển vững của liên kết giữa đường và lectin được duy trì bởi liên kết phân cực ( liên kết hydro giữa - OH của đường và với đầu phân cực của gốc aminoaciđ của phân tử lectin) và liên kết không phân cực (Lực Vanderwall) [24j Khả năng tưcmg tác đặc hiệu của lectin với đường đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về tế bào học, miễn dịch học và huyết học Đặc biệt dựa trên khả năng tương tác đặc hiệu của leclin với đườiig đã cho phép sử dụng phương

pháp sắc ký ái lực để tinh chế nhiều sản phẩm lectin cũng như nhiểu loại glycoprotein cho hiệu suấi và độ linh khiết cao.

Đặc tính sinh học của lectin:

K hả năng ngưng kết tế bào:

Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của ỉectin Đặc tính này là

cơ sở để phát hiện ra lectin và phân biệt lectin với các chất sinh học khác cũng

có ái lực với đường như glucosidase, glycotransferase

Khả năng ngưng kết tế bào của lectin phụ thuộc vào bản chất của lectin (số trung tâm Hên kết đường, cấu trúc không gian ) và còn phụ thuộc vào bản chất của tế bào cần ngưng kết (receptor màng tế bào, thể chất m àng ) Bên cạnh đó những điều kiện gây ngưng kết như: nhiệt độ, pH, nồng độ tế bào, nồng độ lecíin, chất gây ức chế ngưng kết cũng có ảnh hưởng đến khả năng ngưng kết tế bào của lectin [22J

Đối tượng tế bào mà lectin có thể gây ngưng kết rất rộng, lectin không chỉ có khả năng ngưng kết trên những tế bào động vật mà còn có khả năng ngưng kết cả những tế bào vi khuẩn, nấm, vi sinh vật đơn bào Đ iều này đã

mở ra những khả năng nghiên cứu và ứng dụng lớn của lectin trong nhiều lĩnh vực sinh y dược học, miễn dịch học

K hả năng kích thích và kìm hãm $ựphân bào:

Ngoài khả năng gây ngưng kết tế bào, khả năng kích thích phíln bào hay kìm hãm sự phân bào cũng là đặc tính của lectin được ứng dụng nhiều trong y học

và miễn dịch học

Lectin có khả năng kích thích phân bào nhiều loại tế bào khác nhau trong đó kích thích mạnh nhất sự phân bào của tế bào lympho Lectin xâm nhập vào cơ thể có tác dụng như những kháng nguyên kích thích sự phân chia các tế bào lympho, do đó chúng tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể

Trái với khả năng kích thích phân bào, lectin còn có khả năng kìm hãm

sự phân bào Điển hình ỉà với những lế bào ung thư, lectin kìm hãm sự pháttriển của tế bào khối u và ngăn ngừa sự di chuyển cửa chúng Brucke đã giải

thích cơ chế như sau: khi leclin xầm nhập vào tế bào chủ sẽ tác động lên AND

và khởi động sự tổng hợp interferon Interferon từ tế bào chủ được tiết ra xâm nhập vào tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của khối u[2, 10J

- ITiúc đẩy quá trình thực bào của đại thực bào đối với nấm và vi khuẩn

“ Tác dụng tương tự Insulin trên tế bào mỡ

- Tham gia phản ứng giải phóng tiểu cầu

- ức chế sự thụ tinh của trứng

- Tương tác với hormon rau thai

- Úc chế sự giải phóng Histamin từ tế bào Mast và tế bào ưa kiềm

ở pH đẳng điện, lectin dễ bị tủa và có hoạt tính thấp nhất

ở pH tối thích, hoạt tính của lectin được thể hiện tối đa

Các nghiên cứu cho thấy ờ môi trường acid mạnh hoặc kiềm mạnh, hoạt tính

của lectin bị giảm hoặc mất hoàn toàn

Ả n h hư ỏnẹ của nhỉèt đô:

Lectin có bản chất là protein vì vậy rất dễ bị biến tính bởi nhiệt độ ở nhiệt

độ quá thấp hoạt tính của lectin giảm, còn ở nhiệt độ cao hoạt tính của lectin giảm đần rồi mất hẳn

Ả n h hư ở ns của dườns đơn:

Các loại đườiig đơn có anh hưởng lớn tới hoạt tính ngưiig kết tế bào của lectin, vì khi có mặt của đường đơn, trung tâm liên kết hydrocacbon của lectin

bị phong toả làm lectiii không liên kết được với các receptor trên bề mặt tế bào, do đó tế bào không bị nguiig kết [2J

Ả n h hưởne của enzvm:

Những enzym có khả năng biến đổi tính chất của màng tế bào cũng gây ảnh hưởng lớn đến khả năng ngưng kết tế bào của lectin

Một số enzym có khả năng thuỷ phân một số protein trên màng ỉàm bộc lộ ra các receptor có bản chất là glycoprotein tạo điều kiện thuận ỉợi cho các phân

tử lectin gắn vào màng dễ đàng, do đó làm tăng hoạt tính của lectin Nhưng ngược lại, có những enzym như galactosiđase làm giảm hoặc mất hoạt tính của lectin một cách rõ rệt [22J,

Ả n h hưởìie của các ion kim loai:

Hoạt tính của lectin cũng chịu ảnh hưởng của một số kim loại Tuy nhiên, ảnh hưởng của kim loại tớí hoạt tính của lectin là rất phức tạp và không tuân theo một quy luật nào nhất định Kim loại có thể hoạt hoá hay ức chế hoạt tính

của từng lectin ở một nồng độ nhất định Thậm chí trên cùng một loại lectin,

một kim loại có thể gây tăng hoạt tính ở nồng độ này nhưng lại gây giảm hoạt tính ở nồng độ khác [10J

1.1.3 Các phương pháp tinh chế lectin:

* Sắc ký trao đổi ion:

Lectin có bản chất là protein nên phân tử của nó có mang điện tích Tuỳ thuộc vào pH môi trường mà lectin mang điện tích âm hay dương Dựa ứên tính chất này người ta sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tình chế lectin Các chất nhựa gắn ion như DEAE- Sephadex, DEAE- Cellulose thường được sử dụng làm chất trao đổi ỉectin- ion [16]

* Sẩc ký ái lực: [16, 19J

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên khả năng kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand) Chất kết hợp này được gắn trên một chất rắn tạo nên pha tình của cột sắc ký Chất giá được sử dụng

là một số loại gel như Sephadex, Sepharose, Sepharyl., Quá trình sắc ký được chia làm 3 giai đoạn:

- Gắn lectin lên cột: ở giai đoạn này lectin kết hợp đặc hiệu với chất kết hợp và được giữ ỉại cột

- Rửa cột: ở giai đoạn này những protein nào không có ái lực với lectin và các protein thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột

- Phản hấp phụ lectin khỏi cột: Dùng một dung dịch có ái lực hoá học phù hợp để đẩy lectin ra khỏi cột

Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tinh chế lectin lần đầu tiên

vào năm Ĩ 9 6 5 [24], cho đến nay nó vãn được sử dụng rộng rãi VI kỹ thuật đơn

giản, cho hiệu suất cao và chất lượng chế phẩm rất tinh sạch

1.1.4 ứng dụng của lectin:

Lectin đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống:

Trong huyết học: ỉectin được sử đụng để phân loại nhóm máu Phương

pháp xác định này cho kết quả nhanh chóng và chính xác nhưng lại đòi hỏi phải có loại lectin có tính đặc hiệu và độ tinh sạch cao

- Trong tê bào học: Lectin được sử dụng để nghiên cứu một số cấu trúc

màng tế bào.Phương pháp sắc ký đã được sử dụng để xác định bản chất glycoprotein của receptor màng tế bào

- M iễn dịch học: lectin được sử dụng để phát hiện và tinh chế các hoạt chất

sinh học cớ ái lực với lectin như các globuỉin miễn dịch Từ đó các nhà khoa học có thể nghiên cứu cấu trúc, bản chất và chức năng của chúng trong cơ thể Lectin còn được ứng dụng làm chất kích thích miễn địch để tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch cho cơ thể (lectin được chiết, tách

và tinh chế từ đậu thân đỏ Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) [23J

- Trong y học: lectin được sử dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh mang lại

hiệu quả cao và độ chính xác Dựa vào khả năng phân biệt một số vi sinhvật, lectin được sử dụng cùng với các xét nghiệm thông thường khác đểnâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh Hiện nay trên thế giới, người ta ứng dụng phương pháp ELLA (là phương pháp ELISA cải tiến) để xác định virus gây bệnh [20j hoặc xác định hàm lượng một số chất mang hoạt tính sinh học có ái lực cao với lectin Dựa vào khả năng phân biệt tế bào bình thường và tế bào ung thư, lectin được sử dụng để chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư Ngoài ra lectin còn nhận biết được sự khác biệt của glycoprotein giữa tế bào ung thư có khả năng di căn thấp và tế bào ung thư

có khả năng di căn cao Do đó leclin có giá trị theo dõi và tiên lượng bệnh [23J

- Trong lĩnh vực dược học: lectin dùng làm thuốc tuy còn mới mẻ nhưng đã

mở ra nhiều triển vọng trong tương lai Con A được sử dụng làm chất dẫn

đưa thuốc đến tế bào đích Lectin đâu tưomg có khả năng ngăn cản thải loại mảnh ghép, do đó tế bào luỷ xương ghép phát huy được chức năng tăng sinh dòng bạch cầu và hồng cẩu, kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân

Lectin được chiết suất từ hạt cây mít mật {Artocarpus heterophyỉỉus

Moraceae) có khả năng tương tác đặc hiệu với glycoprotein ở bề mặt tế

bào T CD/ là phân tử kết hợp đặc hiệu đầu tiên trong quá trình nhiễm HIV, do đó có thể hạn chế nguy cơ mắc bệnh Trong tương lai lectin có thể

sẽ được sử dụng ỉàm thuốc điều trị A!DS [31J

- Trong kể hoạch hoá gia đinh: lectin được sử dụng để ngăn ngừa sự thụ

tinh của trứng, ngưng kết tinh trùng, chẩn đoán thai sớm và tưcfng tác với hoiTnon rau thai [2J

1.2 Cấu trúc, chức năng và vai trò của các globulin miễn dịch

trong hệ thống miễn dịch của cơ thể:

1.2.1 Một sô khái niệm chung;

Kháng thể cổ bản chất là các globulin hoà tan trong dịch sinh vật được gọi là các globulin miễn địch (Ig) Đó miễn dịch là sản phẩm tổng hợp của tế bào lympho B, là công cụ cơ bản để thực hiện phản ứng đáp ứng miễn dịch bằng cách kết hợp dặc hiệu và vô hiệu hoá các chất lạ khi chúng xâm nhập vào cơ thể

*Cấu trúc chung củơ các globulin miễn dịch:

Phân tử globulin miẻn dịch được chia làm 5 lớp (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) gồm một hay nhiều tiểu đơn vị có cấu trúc giống nhau [11, 16, 18, 21J

Mỗi tiểu đcfn vị gồm 4 chuỗi polypeptid: Hai chuỗi nặng (Heavy chain) và hai chuỗi nhẹ (Light chain) được nối với nhau bằng các cầu disulfua

- Các chuỗi polypeptid này bao giờ cũng đi với nhau từng đôi một và giống nhau hoàn toàn trong các phân tử Ig

- Tất cả các globulin đều có chuôi nhẹ L thuộc kiểu K hoặc X, trong khi

chuỗi nặng H của các globulin có nhiều lớp khác nhau

1.2.2 Chức năng của các globulín miễn dịch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể [7,11,18]:

* Chức năng nhận biết kháng nguyên:

Chức năng nhân biết kháng nguyên là chức năng rất quan trọng của các giobưlin miễn địch, nó quyết định phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên- kháng thể Nhờ đó, các globulin miễn dịch trưng hoà được các kháng nguyên như độc tố, vi khuẩn

Phân tử globulin miễn dịch kết hợp với quyết định kháng nguyên ở vị trí gần hay chính vị trí hoạt động của kháng nguyên đo đó phong bế được phản ứng của độc tố Nếu điểm quyết định kháng nguyên nằm xa trung tâm hoạt động của độc tố thì sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ ỉàm biến đổi cấu trúc không gian của độc tố dãn đến kết quả độc tố không thể bám vào các tế bào đích và hạn chế khả năng gây bệnh của kháng nguyên, ví dụ IgA tiết ở niêm mạc đường tiêu hoá có vai trò ngăn vi khuẩn bám vào màng nhầy

* Chức năng gây ngưtịg kết kháng nguyền:

Chức năng gây ngưng kết kháng nguyên là một trong những chức năng sinh học khác của các globulin miễn dịch được coi như một chức năng thứ phát vì khả năng này chỉ xảy ra sau khi các globulin miễn dịch đã thực hiện xong chức năng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên

Các phân tử globulin miễn dịch của các lớp IgG, IgA, IgM, IgD, IgE có khả năng ngimg kết vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng đơn bào, nhờ đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thực bào

* Chức năng h ỗ trợ cho các quá trínk đại thực bào:

Các kháng nguyên khi đã được bao vây bởi các globuỉin miễn dịch thì chúng dễ bị các đại thực bào bắt giữ và thực hiện quá trình thực bào Đặc điểm

này đễ thực hiện vì các đại thực bào và bạch cầu trung tính có các receptor cảm thụ với mảnh Fc của IgG và IgM Hơn nữa, chúng còn có receptor cảm nhận các mảnh bổ thể, khi đó khả nàng thực bào sẽ được tăng cường hơn nếu các phân tử IgG và IgM có gắn bổ thể Hiện tượng này gọi là “ opsonin hóa”.

* Chức nâng dung giải vi khuẩn:

Một số kháng thể thuộc lớp IgG và IgM có khả năng hoạt hoá bổ thể góp phần làm tan một số vi khuẩn gram âm

* Chức năng thay dổi tính thám thành mạch:

Khả nâng này được thể hiện rõ nhất ở kháng thể thuộc lớp IgE IgE dễ dàng gắn lên màng tế bào Mast và bạch cầu ưa kiềm Sự tương tác này dẫn đến quá trình giải phóng các chất trung gian hoá học như histamin, serotonin, prostaglandin gây tăng tính thấm thành mạch, đo đó kháng thể trong máu

và đại thực bào dễ dàng Ịọt qua thành mạch đến tập trung ở vị trí có kháng nguyên và thực hiện thuận lợi chức năng kết hợp kháng nguyên- kháng thể và đại thực bào Tuy vậy, nếu quá trình đáp ứng miễn dịch này xảy ra quá mạnh

mẽ sẽ gây nên tình trạng bệnh ìý, gọi là hiện tượng quá mẫn (sốc phản vệ) gây nguy hiểm cho cơ thể

1.2.3 IgA- Đặc điểm, cấu trúc và mòi liên quan với các bệnh lý [7, 21 j:

160 OOOkDa, nó thường tồn tại ở dạng monomer (người ta ít gặp ở dạng dimer)

- IgA tiết có trong dịch nước bọt, nước mắt, mồ hôi, sữa, dịch tiết đưcmg sinh dục, dịch tiết đường tiêu hoá IgA tiết chủ yếu tồn tại ở dạng dimer, có hằng số lắng 7S, trọng lượng phân tử khoảng 400 OOOkDa Nó được tổng hợp tại chỗ từ tế bào plasma, gồm 2 monomer gắn với nhau bởi chuỗi J và hợp phẫn tiết Sc.

IgA có hai phân lớp là IgA| và IgAj Trong đó IgA| chiếm 80% Cấu trúc của IgAị và IgAj có sự khác biệt về chiều dài của chuỗi polypeptid và phần cấu trúc hydradcarbon ở phân tử IgAj không có cấu trúc có cấu trúc N- Acetyl- Galactosamin nhưng lại tìm thấy cấu trúc này ở phân tử của IgAị

• Đặc điểm m iễn dịch học:

+ ỉgA có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhập của các

virus, vi khuẩn và động vật nguyên sinh

+ IgA tiết có vai trò bảo vệ tại chỗ, ngăn cản sự xâm nhập của các kháng nguyên vào cơ thể qua hệ thống niêm mạc Đặc biệt, IgA tiết có khả năng tồn tại ở pH thấp của dạ dày vì vậy trẻ em được hưỏmg một lượng lớn IgA từ sữa

mẹ, giúp trẻ tăng cường khả năng miễn dịch trong 6 tháng đầu của trẻ sơ sinh

• IgA và m ối liên quan với các bệnh lý:

Các globulin miễn dịch được sinh ra nhằm bảo vệ cơ thể khi chất lạ xâm nhập vào cơ thể Vì vậy sự biến đổi hàm lượng các globulin miễn dịch có liên quan chặt chẽ với các tình trạng bệnh lý của cơ thể

IgA là một globulin miễn dịch có vai trò chính trong việc ngăn ngừa sự tấn công của các vi sinh vật qua biểu mô Bình thường, nồng độ IgA trong máu luôn ổn định nhưng khi có sự xâm nhập của các vi sinh vật qua biểu mô thì hàm lượng IgA sẽ tăng lên trong máu Đặc biệt đối với IgA tiết, cổ vai trò

quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại các vi khuẩn như E Coỉi,

Salmonella, Shigella quã hệ thống niêm mạc VI vậy sự tăng hay giảm hàm

lượng IgA thường có liên quan đến một số bệnh lý của cơ thể như:

- Bệnh chuỗi nặng (a) thuộc IgA thể hiện sự tăng sinh tế bào lympho xâm nhập vào tế bào non, các hạch mạc treo làm teo nhung mao ruột, giảm sự hấp thu dinh dưỡng và dẫn đến hậu quả suy dinh dưỡng đặc biệt ở trẻ nhỏ.

- Khi cơ thể thiếu hụt IgA thường đẽ bị nhiễm trùng hô hấp và đường ruột- Đặc biệt ở trẻ sơ sinh thường được cung cấp IgA từ nguồn sữa mẹ trong khi

hệ thống miễn dịch chưa hoàn chỉnh Vì vậy với những trẻ em không được

bú mẹ, thường bị mắc các bệnh nhiễm trùng hơn trẻ được bú đầy đủ sữa

mẹ Sự thiếu hụt IgA còn có thể gây ra hiện tượng sốc khi bị nhiễm trùng máu

- Sự thiếu hụt IgA và IgG kèm theo sự tăng hàm lượng IgM cũng là nguyên nhân tăng sản hạch bạch huyết và giảm mạnh số lượng bạch cầu trung tính.Chính do những mối liên quan chặt chẽ giữa hệ thống miễn dịch và trạng thái bệnh ỉý mà hướng nghiên cứu xác định sự thay đổi của các chỉ số globulin miẽn dịch trong bệnh lý vãn đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học nhằm phát hiện sớm cũng như dự phòng và điều trị các bệnh có liên quan

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ:

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm;

2.1.1 Nguyên liệu:

^Nguyên liệu tách, chiết và tình chếlectỉn:

Nsuyên ỉỉêu: Hạt già của cây mít dại (hay còn gọi là hạt chay nhung- Artocarpus masticatữ G Moraceaè) thu hái tại Hà Nội Tên khoa học của cây

được xác định theo phân loại của giáo sư Vũ Vãn Chuyên

■nwỉ cii(i •

Í-VỈ m c i i t c a l a Q ỊMc\ací a*.

milHliỊỈHI llll lllĩttnt

Hình 1 Ả nh hạt m ít dại A masticata G Moraceae

Xử lý nsuvên liêu: Thu hái quả đã già, lấy hạt rủa sạch và sấy khô ở 40° c Bóc

vỏ, nghiền thành bột mịn, cho qua rây cỡ 315 Bột nguyên liệu xử lý được bảo quản trong lọ thuỷ tinh nút kín

* M ầu bệnh phẩm :

Đối tượng lấy mẫu: Bệnh nhân đã được khám tại khoa phụ khoa, bệnh viện phụ sản Hà Nội và kết luận bị viêm cổ tử cung.

Cách lấy mãu:

- Dùng bông vô trùng thấm lấy dịch tiết ở cổ tử cung

- Cho bông đã lấy mẫu vào từng hộp riêng biệt

Các hộp này được bảo quản ở nhiệt độ - 20® c

Cách xử lý mẫu:

- Ngâm bông có thấm bệnh phẩm vào đệm PBS pH 7,4

- Chiết 3 lán bằng đệm PBS pH 7,4

- Thu lấy dịch chiết

- Kết tủa bằng amonisulphat 41% bão hoà, ổn định kết tủa trong 24 h

- Ly tâm iấy tủa ở 4° c , 10 000 vòng/phút, hoà tan tủa bằng đệm PBS

pH 7,4

2.1.2 Hoá chất và thuốc thử:

- Acrylamiđ, Bis Acrylamid, Broniuacỵanogen, Sodium azid,

D - (+) - Galactose, Amonisulphat (MERCK- Germany)

- Amonipersulphat (Kockligh - Japan)

- Commasie Brillant Blue R250 (Recinal - Hungary)

- Sepharose 4B (Pharmacia biotech AB - Sweden)

- Thuốc thử Folinciocalteur

- Thuốc thử đồng kiềm

“ Đệm Blocking pH 7,65

- Anti- IgA gắn OP (Sigma)

- Cơ chất OPD (Sigma)

- Hồng cầu người nhóm máu A, B, o lấy tại Viện huyết học và truyền máu trung ương được chống đông máu bằng dung dịch ACD, rửa 3 ỉần bằng nước muối sinh lý 0,9%

2.1.3 Thiết bị và máy móc:

- Máy ly tâm lạnh Biof'uge I5R (Gennany)

- Máy đo quang phổ UV-VIS

- Máy chạy điện di Hoffoe Small II (USA)

- Máy đo pH Jenway (England),

- Máy đông khô Jouan LP3 (France)

- Máy khuấy từ

- Cột sắc ký Sepharose 4B- Mucin (1,5 X 6cm)

- Bản nhựa làm phản ứng ELISA

- Máy đo ELISA LP 200

- Các dụng cụ thuỷ tinh khô sạch

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu:

* Phươtig pháp xác định hoạt tính lectin:

Hoạt tính của lectin được xác định bằng khả năng ngimg kết tế bào hồng cầu người theo phương pháp của Gebauer trên bản nhựa đáy nhọn microtitle [ 10]

■ Hoạt độ lectin (HAA) là giá trị nghịch đảo của độ pha ỉoãng ỉớn nhất mà ở

đó lectin còn có khả năng nguriig kết hồng cầu

■ Hoạt tính của lectin được xác định theo hai chỉ số:

+ Hoạt độ tổng số (HĐTS) được xác định theo công thức :

V 2"

HĐTS=

-50Trong đó : V : thể tích mẫu thí nghiệm (^lỉ)

n : số giếng còn hoạt tính lectin

50 : số lectin đem thử

2 : độ pha loãng liên tiếp HĐTS được lính bằng HAA

HĐTSHĐR =

mPr

Trong đó : mPr ; khối lượng protein trong mẫu

thí nghiêm tính bằng mg

Các bước tiến hành:

- Cho vào mỗi giếng 50 p,l dịch đêm PBS pH 7,4

- Thêm vào giếng đầu 50 |il dịch cần xác định hoạt độ, pha loãng 2 lần ở các

giếng tiếp sau

- Thêm 50 ^1 hồng cầu 2% pha trong nước muối sinh lý 0,9% vào mỗi