Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid

Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một vài hợp chất bê ta aminoceton dẫn xuất của sulfamid

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1997-2002)

Đ ồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn cấc thầy cô giáo trong toàn trường đã giăo dục, dạy dỗ và đào tạo em trong suốt những năm học qua.

Sinh viên: Đ ỗ Thu Hường

MỤC LỤC

Đặt vấn đề

P H Ầ N 1: T Ổ N G Q U A N

1.1- Sơ lược về tình hình nghiên cứu Ị3-aminoceton

1.2- Tác dụng sinh học của P-aminoceton

1.3- Tác dụng kháng khuẩn của sulíamid

1.4- Các phưcfng pháp tổng hợp Ị5-aminoceton

1.4.1- Căc phương phăp chung

1.4.2- Tổng hợp p-aminoceton từ base azomethin và ceton thơm có Ha linh động.

ĐẶT VẤN ĐỂ

Thuốc dùng để phòng bệnh, chữa bệnh và phục hồi điều chỉnh chức năng có rất nhiều nguồn gốc khác nhau như dược liệu, hoá dược, trong đó các chất tổng hợp hay bán tổng hợp giữ một vai trò quan trọng

Hợp chất ß-aminoceton là một dãy chất được tổng hợp bằng các phương pháp khác nhau đồng thời có nhiều nghiên cứu về các chuyển hóa có hoạt tính sinh học trong cơ thể sinh vật cho thấy nhiều chất có cấu trúc ß-aminoceton [17]

Hợp chất ß-aminoceton lần đầu tiên được tổng hợp vào năm 1868, từ đó đến nay

có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về phưcmg pháp tổng hợp cũng như tác dụng sinh học cho thấy chúng có nhiều tác dụng sinh học Đặc biệt, một số chất đã được dùng trong lâm sàng Các ß-aminoceton còn được dùng trong một số lĩnh vực khác như dùng làm chất chống lão hoá, chống oxy hoá cao su, chống ăn mòn bề mặt kim loại, phân tích nguyên tố chuyển tiếp [9,17] Việc nghiên cứu về ß-aminoceton là vấn đề đang được quan tâm do sự phong phú về tác dụng và đa dạng về cấu trúc Cho đến nay, nhiều hợp chất ß-aminoceton đã được sử dụng làm thuốc [4,15] Trên cơ sở

đó, trong công trình này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của một sô ß-aminoceton dẫn xuất của sulfamid với mục đích thu được một số dãy chất mới có tác dụng sinh học hy vọng có thể có tác dụng hiệp đồng giữa cấu trúc azomethin ,ß-aminoceton và sulfamid để có thể ứng dụng trong ngành Dược Đồng thòi tìm hiểu sự liên quan giữa cấu trúc hoá học và tác dụng sinh học của các chất tổng hợp nhằm định hướng tổng hợp các ß- aminoceton dự đoán có tác dụng sinh học

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1- Sơ lược về tình hình nghiên cứu /ĩ-aminoceton

Nãm 1868, tác giả Cloer người pháp lần đầu tiên đã được tổng hợp một chất P- aminoceton Những năm tiếp theo đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về phưoỉng pháp tổng hợp cũng như tác dụng sinh học của chúng [16]

Nhiều công trình nghiên cứu cho biết các P-aminoceton có rất nhiều tác dụng sinh học như gây tê, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế khối u, tác dụng lên thần kinh trung ương, quá trình tạo máu, quá trình trao đổi chất, chống loạn nhịp tim, chống tăng huyết áp [12,17] Ngoài ra, các P-aminoceton còn được dùng trong một số lĩnh vực khác [1 1]

Ban đầu, Ị3-aminoceton được tổng hợp chủ yếu bằng phương pháp ngưng tụ giữa base azomethin và ceton có Ha, đặc biệt giữa azomethin thơm và ceton thơm Các công trình của Kozlov và các cộng sự đã làm sáng tỏ cơ chế của phản ứng ngưng tụ và đưa ra được những lý luận về điều kiện thích hợp của phản ứng như dung môi phân cực, xúc tác acid, nhiệt độ [11] Ngoài ra, các phương pháp khác cũng đươc đề cặp đến nhưng còn nhiều hạn chế và mang lại hiệu quả không đáng kể

Vào những năm 20 của thế kỷ này, C.Mannich - nhà hoá học người Đức đã tổng hợp được P-aminoceton theo phương pháp khác Xuất phát từ các ceton (có thể là các ceton mạch hở, vòng no hoặc vòng thơm) vói muối của các amin bậc 1 hoặc bậc 2 và foraialdehyd Các amin đó cũng có thể là mạch thẳng, vòng no hoặc amin thơm Phản ứng này lúc đầu ít gây được sự chú ý, song về sau nhiều tác giả tổng hợp các P- aminoceton theo phương pháp này và phản ứng được ứng dụng nhiều trong tổng hợp các chất hữu cơ

1 2 - Tác dụng sinh học của ¡5-aminoceton

Nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy Ị3-aminoceton có nhiều tác dụng sinh học phong phú và đa dạng Sau đây là một số tác dụng sinh học chính của P-aminocetpn

1.2.1 - Tác dụng gáy tê, giảm đau

- Các ß-aminoceton có tác dụng gây tê tại chỗ, lần đầu tiên được tổng hợp vào những

năm 20 do nhà hoá học người Đức C.Mannich thực hiện bằng phản ứng ngưng tụ giữa ceton với formaldehyd và amin bậc 1 hoặc bậc 2

-Năm 1992, Mannich và Lammering đã tổng hợp được chất gây tê có công thức sau:

R—C—CH2—CH2—N )

Trong đó, R = - CgHs hoặc gốc Naphthyl

Tác dụng của thuốc này không cao song nó có ý nghĩa là đã tạo ra được một dạng thuốc gây tê mới mà từ trước tới nay chưa gặp, nó mở đường cho việc tổng hợp các chất gây tê

-Năm 1949, Profit đã tổng hợp chất một chất gây tê mới là Phalicain có công thức sau:

C3H7 0- \ ( , c - c h2- c h 2- n ^

-Chất này có tác dụng gây tê bề mặt mạnh gấp 10 lần cocain Phalicain được dùng với mục đích gây tê tại chỗ với các dạng khác nhau song vẫn còn hạn chế do có độc tính cao Có rất nhiều công trình nghiên cứu tác dụng và cấu trúc của Phalicain nhằm tạo được một loại thuốc mới có tác dụng mạnh và giảm độc Các công trình đó cho biết tác dụng của Phalicain là do sự tổ hợp của cấu trúc amino- ceton

1.2.2 - Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

-Năm 1956, Nardor và cộng sự đã tổng hợp được chất có công thức cấu tạo:

0

và nghiên cứu tác dụng sinh học cho thấy chúng có tác dụng an dịu thần kinh trung ương

-Tiếp theo đó, hàng loạt dẫn chất có cấu trúc ị5-aminoceton được tổng hợp và chúng

có tác dụng lên iiệ thần kinh trung ương như dẫn chất của 1-tetralon:

1.2.4 - Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u

-Năm 1953, khi nghiên cứu về Phalicain Profit đã phát hiện ngoài tác dụng gây tê, Phalicain còn có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt vód tụ cầu vàng và trực khuẩn đường ruột [14]

-Các công trình tiếp theo cho biết các diclonin cũng có tác dụng kháng khuẩn Etamin ngoài tác dụng kháng khuẩn còn có tác dụng chống nấm

-P.N.Gordon vă cộng sự phát hiện thấy tác dụng kháng khuẩn của một số (3- aminoceton kiểu R- CO.CH2-CH2 N (R’R ” ) với R=aliphatic, vòng thơm hoặc dị vòng Đặc biệt có tác dụng trên vi khuẩn Gram(-) của các nhiễm khuẩn đường niệu

-Một số Ị3-aminoceton được thử trên các vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium smeiimatis đều thấy có tác dụng [5,6].

-Năm 1990, khi nghiên cứu các (3-aminoceton dẫn chất của imidazol, A.F.Popove và cộng sự cũng thấy có tác dụng kháng 5 chủng vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) được thử -Các công trình nghiên cứu của V.Dauksas và cộng sự cho thấy một số P-aminoceton dãy benzo - 1,3 dioxol và các dẫn chất amino alcol tương ứng có tác dụng chống viêm [10]

-Năm 1984, K.R.Mavelyan và cộng sự phát hiện thấy một số (3-aminoceton có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u [1 2]

-Ngoài ra, p-aminoceton còn có tác dụng khác: chống amip, chống cao huyết áp, kháng histamin và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như: dùng trong sơn bảo

vệ kim loại, chống lão hoá hoặc lưu hoá cao su, phân tích kim loại chuyển tiếp [10,17] -ở Việt Nam, những năm gần đây cũng có một số công trình nghiên cứu tổng hợp và tác dụng sinh học của ị3-aminoceton [5,17], song còn rất ít các P-aminoceton tổng hợp được dùng trong lâm sàng mà chủ yếu làm chất trung gian để tổng hợp dị vòng [6], Một số nghiên cứu khác về tác dụng sinh học của P-aminoceton cho thấy dãy chất này có tác dụng phong phú [16]

Qua khảo sát, chúng tôi thấy các P-aminoceton có tác dụng rất phong phú và đa dạng trong cấu trúc Do vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu P-aminoceton nhằm mục đích tạo được các chất P-aminoceton mới dự đoán có tác dụng sinh học và tiến hành sàng lọc, hy vọng chọn lọc được chất có thể ứng dụng trong điều tậ

1.3 - Tác dụng kháng khuẩn của suựamid [3]:

- sulfamid có hoạt phổ rộng, tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gram(+) (liên cầu, tụ cầu,

phế cầu), Gram(-) (lậu cầu, màng não cầu), trực khuẩn than, vi khuẩn tả, shigella, E.coli ít hoặc không có tác dụng trên một số vi khuẩn : liên cầu yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia không có tác dụng đối với viruts trừ viruts to như sulfacylum, có tác dụng trên viruts^ây đau mắt, và một số ký sinh trùng như ký sinh trùng sốt rét

- ở ỉiều điều tậ sulfamid không giết vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không phát triển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt

- Từ tác dụng sinh học của (3-aminoceton và của sulfamid chúng tôi mong muốn có

sự hiệp đồng tác dụng của 2 cấu trúc này đặc biệt là về tác dụng kháng khuẩn

> Giai đoạn 1: Tổng hợp base azomethin

> Giai đoạn 2: Từ base azomethin tổng hợp ra P-aminoceton

Ri, R2: gốc alkyl, aryl, vòng no, dị vòng

Các azomethin điều chế từ aldehyd và amin mạch hở thường không bền, khi cả 2 gốc đều thơm thì azomethin bền hơn và dễ tạo thành hơn

Trong các phương pháp trên, phương pháp tổng hợp azomethin bằng cách ngưng tụ aldehyd với amin bậc 1 xảy ra tưofng đối thuận lợi và cho hiệu suất cao, vì thế chúng tôi

chọn phương pháp này để điều chế azomethin Phản ứng ngưng tụ giữa aldehyd và amin bậc 1 xảy qua 2 giai đoạn, mỗi giai đoạn là một cơ chế khác nhau

* Giai đoạn 1: Tác nhân ái nhân tấn công vào phân tử aldehyd theo cơ chế cộng hợp ái nhân (An)

* Giai đoạn 2: Phản ứng tách loại nước theo cơ chế tách loại Eị Cơ chế này có thể được biểu diễn như sau;

-Nếu R là gốc alkyl, nói chung các azomethin không bền

-Khi R là gốc thơm, do ảnh hưcmg của hiệu ứng liên hợp nên các azomethin bền hơn.Đây là phản ứng cộng hợp ái nhân nên mọi yếu tố làm tăng điện tích dưoìig củacarbon-carbonyl sẽ làm tăng khả năng và tốc độ phản ứng, cụ thể là;

+ Khi nhân thơm của aldehyd có nhóm thế loại I: alkyl, -OH, - O C H 3 , -NH, -NHR

Do hiệu ứng +1, +M làm mật độ điện tử của carbon-carbonyl tăng nên cản trở sự tấn công của tác nhân ái nhân, do đó khả năng và tốc độ của phản ứng cộng hợp ái nhân giảm

+ Ngược lại, khi trên nhân thỏm có nhóm thế loại II: -NO2, -SO2, -COOH Do hiệu ứng

-I,-M làm giảm mật độ điện tử trên nguyên tử carbon-carbonyl làm tăng điện tích dưcỉng, thuận lợi cho các tác nhân ái nhân tấn công, do đó sẽ làm tăng khầ năng và tốc

độ phản ứng

■ Gốc R của Amỉn

-Các azomethin với R là gốc alkyl không bền

-Khi R là gốc thơm thì các azomethin sẽ bền hơn

Vì amin đóng vai trò là tác nhân ái nhân, do đó khi nhân thơm của amin có các nhóm thế làm giàu mật độ điện tử tại nguyên tử Nitơ sẽ làm hoạt tính ái nhân mạnh lên, làm tăng khả năng và tốc độ phản ứng Khi nhân thơm của amin có nhóm thế loại

II, do làm giảm mật độ điện tử nên làm giảm khả năng và tốc độ phản ứng cộng hợp ái nhân

Vì phản ứng xảy ra qua 2 giai đoạn vód cơ chế khác nhau nên tốc độ phản ứng phụ thuộc vào tốc độ của 2 giai đoạn, hiệu suất của phản ứng phụ thuộc phức tạp vào bản chất và vị trí của nhóm thế trên các gốc hydrocarbon của aldehyd và amin

Ngoài ra, còn có hiệu ứng không gian gây ra bởi nhóm thế cũng có vai trò quan trọng

-Tuỳ trường hợp^cụ thể dùng xúc tác acid hoặc base nhưng nhìn chung, xúc tác acid hữu hiệu hơn Đặc biệt với phản ứng của aldehyd thcfm và amin bậc 1 có cấu tạo đơn giản không cần xúc tác [16]

Người ta nhận thấy rằng , tốc độ phản ứng đạt cực đại ở một trị số pH nhất định tuỳ theo cấu tạo gốc hydrocarbon của aldehyd và amin.

*> Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng và tốc độ phản ứng.

♦ Độ phân-cực của liên kết >C=N

Trong liên kết >C=N nitơ có độ âm điện lófn hơn carbon nên liên kết >C=N là phân cực Phản ứng tổng hợp hợp [3 - aminoceton là phản ứng cộng hợp ái nhân bắt đầu bằng sự tấn công của tác nhân ái nhân vào nguyên tử carbon -imin Nếu điện tích dưofng tại nguyên tử carbon càng lớn thì càng thuận lợi cho phản ứng xảy ra.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân cực của liên kết imin >C=N

■ Gốc R trong phân tử aldehyd

-Khi gốc R là alkyl ; do có hiệu ứng +1, cácgốc alkyl sẽ làm giàu mật độ điện tử trên fíguyèntử cacbon, cản trở sự tấn công ái nhân, do vậy cản trở phản ứng ái nhân Mặt khác, gốc alkyl sẽ tạo azomethin và p - aminoceton không bền Vì thế trong luận văn này chủ yếu là xét R gốc thơm

-Khi R là gốc thơm, do có sự giải tỏa điện tử nên đã góp phần vào sự bền hoá và tăng

độ phân cực của liên kết imin, do vậy tăng khả năng và tốc độ phản ứng hơn khi R là alkyl

Khi trên nhân thơm có nhóm thể loại I : alkyl, -OR, -OH, -NH2, - NHR Do có hiệu ứng +I hoặc +M làm tăng mật độ điện tử vòng thơm, làm giảm khả năng giải tỏa điện

tử của liên kết imin Mật độ điện tử trên nguyên tử carbon - imin sẽ cao hơn so với gốc thofm không có nhóm thế, nên làm giảm khả năng và tốc độ phản ứng

Ngược lại, khi trên nhân thơm có nhóm thế loại I I : -NO2, -SO2, - COOH Do hiệu ứng “I, "M, làm giảm mật độ điện tử của vòng thơm, tăng sự phân cực của liên kết imin làm tăng khả năng và tốc độ phản ứng

■ Gốc R của amin :

-Khi R là gốc thơm, làm bền hoá azomethin và P-aminoceton Khi trên nhân thơm có các nhóm thế loại II làm tăng độ phân cực của liên kết >C=N do vậy thuận lợi cho phản ứng, ngược lại, khi trên nhân thơm có nhóm thế loại I sẽ làm cản trở phản ứng do làm giảm sự phân cực của liên kết imin

Xét chung lại với cả azomethin, khi trên nhân thơm có các nhóm thế loại II làm tăng

độ phân cực của liên kết >C=N Điện tích dương trên nguyên tử carbon-imin sẽ tăng lên làm thuận lợi cho phản ứng cộng hợp ái nhân Do vậy tốc độ của phản ứng tạo p- aminoceton tăng lên

- Ảnh hưỏng của hiệu ứng nhóm thế ở vị trí orthor và para mạnh hơn ở vị trí meta do sự

liên hợp của hiệu úìig Ngoài hiệu ứng điện tử, hiệu ứng không gian cũng rất có ý nghĩa đối với khả năng, tốc độ của sự tạo thành P-aminoceton

Ạ Tính linh động của Ha trong ceton[8].

Vì nhóm ceton >c=0 có sự chênh lệnh về độ âm điện giữa nguyên tử carbon và oxy,

do vậy liên kếtr^ậ^Q^^^luồn phân cực Nguỵên tử carbon của nhóm carbonyl nghèo điện tử có khuynh hướng hút điện tử của liên kết bên cạnh làm mật độ điện tử trên nguyên tử Ca giảm đi Kết quả tạo sự linh động của Ha là cho các nguyên tử hydro dễ tách ra tạo carbanion là tác nhân ái nhân mạnh, ớ đây chỉ xét các ceton thơm hỗn tạp.Cấu tạo của các ceton thơm hỗn tạp

* Ngược lại, khi Ri là các nhóm thế loại II: -NO2, -SO2, -COOH Hiệu ứng ~I hoặc "M làm nghèo mật độ điện tử của nhân, mật độ diện tử carbon-carbonyl giảm làm tăng độ

linh động của ìẢa, tăng khả năng và tốc độ phản ứng.

* Khi R2 là nhóm thế loại I: trực tiếp ảnh hưởng tới mật độ điện tử của Ca, mật độ điện

tử của nguyên tử này tăng lên do hiệu ứng +1, giảm độ linh động của Ha nên giảm khả

năng và tốc độ phản ứng Ngược lại, khi R2 có nhóm thế loại II, làm tăng độ linh động của Ha, do đó làm tăng khả năng và tốc độ phản ứng.

Tóm lại, khi R i , R2 là các nhóm thế loại II sẽ thuận lợi cho phản ứng tạo thành P- aminoceton Ngược lại, các nhóm thế loại I lại ngăn cản phản ứng Ngoài ra có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự linh động của H« Thực nghiệm cho thấy dụng môi phân cực (alcol ethylic tuyệt đối và các xúc tác như BF3, acid clohydric (HCl) đặc làm tăng độ linh động của Ha- Do vậy làm tăng tốc độ phản ứng tạo thành Ị3-aminoceton

1.5 - Tính chất của các p-aminoceton

* Các Ị5-aminoceton nói chung không bền, p-aminoceton thơm tưcfng đối bển hơn, chúng ít tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ ở mức độ khác nhau, có tính base

do phân tử có nguyên tố Nitơ

* Có tính khử mạnh do có nhóm >c=0, phần lớn bị khử bởi thuốc thử felling Trong môi trường kiềm cho phản ứng ngưng tụ nội phân tử tạo các hợp chất vòng

* Các P-aminoceton có thể đóng vòng tạo thành hợp chất ildol, scatol, các dị vòng có nitơ như: quinolin, pyrazol, thiazol

* Có thể bị phân huỷ bằng phản ứng Mannich tạo thành ceton ethylenic, ví dụ;

C H j-C O — ( O ) “ -CH3

- Các nguyên liệu khác

+ Acid acetic (CH3COOH) đặc + Acid clohydric (HCl) đặc + Dung môi:

- alcol ethylic (C2ĨỈ5OH) tuyệt đối -Cloroform (CHCI3)

-Methanol (CH3OH)

- Vi sinh vật kiểm định dùng trong thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

+ Vi khuẩn Gram (+)

NCTC 8241 ATCC 9946 ATCC 12228 ATCC9341

Bacillus pumilus Bacillus cereus Staphylococcus aureus Sarcina lutea

+ Vi khuẩn Gram ( - )

Escherichia coli Shigella flexeri Salmonella typhi Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis

ATCC 25922

DT 112

DT 220

VM 201 BV108

+ Vi nấím

Candida albicans ATCC 10231

* Dụng cụ:

- Bình cầu thủy tinh 3 cổ dung tích 100, 250 ml

- Sinh hàn, máy khuấy từ có bộ phận cung cấp nhiệt

- Các dụng cụ khác ; ống đong, cốc có mỏ, pipet

- Hộp lồng, ống nghiệm, pipet chính xác

ông ỉinli hán hói Imi

Phản ứng xảy ra qua hai giai đoạn:

* Giai đoạn 1: Tạo base azomethin bằng phản ứng ngưng tụ giữa aldehyd với amin thơm bậc

1:

A r— c = 0 + H2N-AT2 ► A r— C H = N -A t2

HTrong đó Ati Aĩ2 là gốc hydrocacbon thơm

* Giai đoạn 2: Tổng ị3raminoceton: bằng phản ứng ngưng tụ azomethin và ceton thơm có Ha

-Đo nhiệt độ nóng chảy

-Phân tích phổ UV,IR

2.1.2.3- Phươngphăp thử tác dụng sinh học

* Thử đinh tính theo phươns pháp khuvếch tăn trên thach Ĩ21

Nem ên tắc: Các khoanh giấy có chất thử được đặt trên mặt đĩa thạch dinh dưỡng đã

cấy vi sinh vật chỉ th ị Chất thử sẽ khuyếch tán yào môi trường tạo vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật Các khoanh giấy có đưcíng kính tỷ lệ thuận vói logarit nồng độ Khả năng ức chế vi sinh vật của chất thử được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn

* Xác đinh nồng đô ức chế tối thiểu (MIC)

Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ nhỏ nhất của chất thử có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của một vi sinh vật MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng theo kỹ thuật của Stephen Gillespie [13]

2.2 - Kết quả thực nghiệm và nhận xét

2.2.1 - Tổng hợp nguyên liệu

Bằng phản ưng ngưng tụ giữa aldehyd thơm vơi amin bậc 1, chúng tôi tiến hành phản ứng ngưng tụ giữa sulíanilamid với 4 aldehyd thơm là benzaldehyd, và 2-hydroxy benzaldehyd ( aldehyd salicylic), 4 hydroxy-3methoxy benzaldehyd (vanilin) và 4-nitro benzaldehyd để tạo 4 azomethin dùng làm nguyên liệu tổng hợp p-aminoceton

- Phản ứng được tiến hành trong dung môi là alcol ethyl ic ( C 2 H 5 O H ) tuyệt đối

- Xúc tác: acid acetic ( C H 3 G O O H ) đặc

- Thời gian phản ứng: 1 -1 ,5 giờ

- Tinh chế bằng alcol ethyli c tuyệt đối

2.2.1.1 - Tổng hợp bemỵliden sulĩanilamid (azomethin 1)

Trong bình cầu 3 cổ dung tích 250ml lần lượt cho 0,05mol sulfanilamid (8,ốlg) và lOOml alcol ethylic tuyệt đối.Lấp dụng cụ như hình vẽ Đun hồi lưu cách thuỷ cho tan hoàn toàn Cho tiếp 0,05mol benzaldehyd (5,3 ml) và Iml acid acetic đặc làm xúc tác Tiếp tục đun hồi lưu cách thuỷ trong 1 giờ, có khuấy từ liên tục, duy trì ở nhiệt độ sôi của alcol Theo dõi

phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Cloroforai: Methanol tỷ iệ 8,5 : 1,5 Làm

lạnh, khi bắt đầu xuất hiện kết tủa để ở nhệt độ phòng trong 30 phút cho kết tủa hoàn toàn

Lọc kết tủa qua phễu Bucher, tinh chế lại bằng cách kết tinh trong alcol ethylic tuyệt đối Lọc, sấy kết tủa ở nhiệt độ 50 - 60‘^c trong tủ sấy chân không 12 giờ Sản phẩm thu được dạng rắn , kết tinh tinh thể màu trắng

* Kết quả:

+ Khối lượng tủa sau khi sấy : 6,25g

+ Nhiệt độ nóng chảy : 175 - 176°c (Tài liệu : 175 -176°C)

* Kết quả:

+ Khối lượng tủa sau khi sấy : 6,7 Ig

+ Nhiệt độ nóng chảy : 208 -210°c (Tài liệu : 209-210°C)

2.2.1.3_ Tổng hợp - 4 Hydroxy 3-methoxy benzyliden sulfanilamid (Azomethin 3)

* Sơ đổ phản ứng :

* Tính chấLvậtiỵ:

□ Bằng phản ứng ngưng tụ giữa aldehyd và amin thơm bậc 1 chúng tôi thu được 4 azomethin là các chất rắn kết tinh dạng tinh thể có màu từ trắng đến vàng Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của các chất thu được trên máy đo nhiệt đô nóng chảy Galenkamp Kết quả được ghi theo bảng 1

□ Tiến hành thử độ tan của các azomethin trong các dung môi: nước, alcol ethylic tuyệt đối, dimethylformamid, aceton, ethylacetat Kết quả cho thấy các azomethin không tan trong nước, ít tan trong alcoi ethylic, ethylacetat lạnh và dễ tan hơn trong alcol ethylic, ethylacetat nóng, Tan trong dimethylformamid, aceton Kết quả được ghi trong bảng 4

* Sắc kv láp mỏng

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp bằng SKLM Dùng bản mỏng Silicagel (60

F 254 (Merck)) với hệ dung môi CHCI3: CH3OH với tỷ lệ khác nhau tuỳ từng chất^soi bằng

đèn tử ngoại ở bước sóng X = 365nm và chất hiện hình là hơi lod bão hoà.Kết quả thu được

các vết có màu vàng nhạt có Rf xác định.Kết quả đươc ghi trong bảng 1

* Phân tích phổ hổng ngoai, tử ngoai:

Các chất azomethin tổng hợp được tiến hành phân tích bằng phổ hồng ngoại (IR) và tử ngoại ( uv) tại phòng thí nghiệm trung tâm trường ĐH Dược Hà Nội vód sự giúp đỡ của TS Đỗ Ngọc Thanh

□ Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Spectrophometer Perkin-Elmer (USA), sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 600cm'* - 4000cm'‘

□ Phổ tử ngoại được đo trên máy Cary lE Varían Spectrophometer(Australia)

□ Hình ảnh phổ IR, u v được in trong phần phụ lục

Qua đó chúng tôi nhận thấy mỗi azomethin tổng hợp được đều có các dải hấp thụ đặc trưng tại vùng tương ứng với các nhóm chức của cấu trúc dự kiến tổng hợp

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại, tử ngoại được ghi chi tiết ở bảng 2.

* Nhân xét ;Qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phân tích phổ IR, u v chúng tôi nhận thấy các hợp chất azomethin thu được đều có cấu trúc phù hợp vói cấu trúc dự kiến

Ẽ Ç2Ơ

o (N

m •N

VỌ

o m

00 o

00 s

t - H

K

8

o m

o Ẽ

Ơ

(N

= i ß

u 5P

p Q,

Óco

>

ÇJĨ

Ù

c s

Ò0

cñ

s CN

r-o

vn

en cñ

00

ỈO

CN

oo

en

2.2.2 - Tổng hợp P-aminoceton.

Xuất phát từ 4 azomethin đã tổng hợp được ở phần 2.2.1, chúng tôi tiến hành tổng hợp P- aminoceton bằng phản ứng ngưng tụ giữa các azomethin vói 2 ceton thơm có H(X linh động

là acetophenon và p- methyl acetophenon

-Phản ứng được tiến hành trong dung môi là acol ethylic tuyệt đối

-Xúc tác : acid clohydric (HCl) đặc

-Thời gian phản ứng: 3 -3 ,5 giờ

-Tinh chế bằng acol ethylic tuyệt đối

2.2.2.1 Tổng hợp P-aminoceton từ azomethin 1 (Bezyliden sulfanilamid) với acetophenon.

2.2.2.S - Tổng hợp P-aminoceton từ azomethin 2 (2-Hydroxy benzyliden sulfanilamid) với acetophenon.

2.2.2.4 Tổng hợp P-aminoceton từ azomethin 2 (2- Hydroxy benzyliden) với p -methylaetophenon

Tỷ lệ các chất tham gia phản ứng: 0,01mol azomethin 3 (3,06g) + 0,5 ml acid clohydric đặc và 0,01 mol acetophenon (l,2ml) + 30ml alcol ethylic tuyệt đối Sản phẩm thu được dạng rắn, kết tinh tinh thể màu đỏ.

* Tiến hành : Theo I.2.2.2.

Tỷ lệ các chất tham gia phản ứng: 0,01mol azomethin 3 (3,06 g) + 0.5 mi acid clohydric đặc + 0,01mol p - methyl acetophenon (l,34ml) + 30 ml alcol ethylic tuyệt đối Sản phẩm thu được dạng rắn, kết tinh tinh thể màu vàng sáng

* Kết quả : + Khối lượng tủa sau khi sấy : l,24g

Tỷ lệ các chất tham gia phản ứng: 0,01mola^omethin 4 (3,05 g) + 0,5 ml acid clohydric đặc + 0,01mol acetophenon (l,2ml) + 30 ml alcol ethylic tuyệt đối Sản phẩm thu được dạng rắn, kết tinh tinh thể màu vàng sáng.

2.2.2.8 Tổng hợp ¡5-aminoceton từ azomethin 4 (4-nitro benzyliden sulĩanilamid) với p - methyl acetophenon.

Tỷ lộ các chất tham gia phản ứng; 0,01mol azomethin 4 (3,05g) + 0.5 ml acid

\clohydric đặc + 0,01mol p - methyl acetophenon(l,34ml) + 25 ml alcol ethylic tuyệt đối Sản phẩm thu được dạng rắn, kết tinh tinh thể màu vàng sáng

* Kết quả:

l,63g

127 -129°c (Tài liệu: 128 -129°C) 31,7%

+ Khối lượng tủa sau khi sấy

+ Nhiệt độ nóng chảy

+ Hiệu suất

2.2.3 Kiểm tra cấu trúc các chất p-aminoceton tổng hợp được

2.2.3.1 - Tính chất vật lý

* Trạng thái màu sắc, nhiệt độ nóng chảy:

Bằng phản ứqg ngưng tụ giữa bazơ azomethin và ceton thơm có Ha linh động chúng tôi thu dược 8 sản phẩm là các chất rắn, kết tinh tinh thể hình kim hoặc dạng bột mịn có màu từ trắng đến vàng nhạt, vàng đậm, đỏ

Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy Galenkamp Kết quả thu được ghi theo bảng 3.

* Độ tan:

Tiến hành thử độ tan các chất tổng hợp được trong các dung môi: nước, alcol ethylic tuyệt đối, dimethyformamid, aceton, ethylacetat, diethylether, cloroform, n.hexan kết quả cho thấy các ß-aminoceton không tan trong nước, ít tan trong ethanol tuyệt đối lạnh và dễ tan hơn trong ethanol nóng, tan tốt trong dimethyformamid Kết quả được ghi chi tiết trong bảng 4

2.2.3.2 - Sắc k ý lớp mỏng

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng sắc ký lớp mỏng:

- Bản mỏng Silicagel với hệ dung môi CHCljiCHjOH với tỷ lệ khác nhau tuỳ từngchất

- Soi đèn tử ngoại vói bước sóng \ - 365nm

- Chất hiện hình là hơi lod bão hoà

Kết quả thu được các vết màu vàng nhạt có Rf xác định theo bảng 3

2.2.3.3 - Phổ hồng ngoại, tử ngoại

Các hợp chất ß-aminoceton đã tổng hợp được tiến hành phân tích bằng quang phổ hồng ngoại (IR) và tử ngoại (UV) tại phòng thí nghiệm trung tâm trường ĐH Dược Hà Nội với sự giúp đỡ của TS Đỗ Ngọc Thanh

- Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Spectrophomeler Perkin - Elmer (USA), sử dụng kỹ thuật viên nén trên KBf ghi ở vùng 600 - 4000cm’‘

- Phổ tử ngoại được đo trên máy Cary lE Varian spectrophometer (Australia)

- Hình ảnh phổ được ghi trong phần phụ lục

Chúng tôi nhận thấy'mỗi ß-aminoceton đều có dải hấp thụ đặc trưng tại vùng tưofng ứng với các nhóm chức của cấu trúcdự kiến tổng hợp Kết quả được ghi ở bảng 5

I

ci

4—>

5Pç

<o

oü

o

<N CÒ

00 m

^ S

en (N

(N S CN

X

z ẫ

>

in ƠN r-H T— H

0 vo T— H

vo vo in r-H

0 tn H

CỎ in (N r-H

0 I— H

00 en

0 ^

^ co r—( r—1

qp en

0 ^ co r-H 1— H

<N 0

en

ON

00 0

en m 1— H

(N CN

1-H

CN

0 <N

vo in r-H r-H

en

r in

r-H

S

T— H cd

l>

in

vo

C^ (N tri vo H

O n

m T— H

r in 'O

-GN vb

r ' ' i

> ° “

1

vo (N en

in es

en

in CN CÒ

00 OÑ m

en

en cñ

in vo

en

1>

en cñ CÕ

0 'O co

00 co m

i l

c/:) u m vo t> 00 C^. 0 t -H r-H t -H (N r-H

2.2.4- Phưoìig pháp thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được

Với mục đích tổng hợp những dãy chất mới có tác dụng sinh học hy vọng có thể có ý nghĩa trong ngành dược, chúng tôi đã tiến hành thử tác dung kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được bao gồm 4 hợp chất azomethin và 8 hợp chất P-aminoceton, từ đó tìm hiểu mối liên quan giữa cấu trúc hoá học và tác dụng sinh học của các chất này

Thử đinh tính theo phươnspháp khuvếch tẩn trên thãch ÍDươc điển Viêt Nam m )

- Môi trường thạch nền (môi trường 1)

Thạch : 18gNước cất v/đ rlOOOml -Môi trường cao thịt- cao men -Môi trường Sabouraud

Trên các hộp petri có đường kính bằng nhau đổ khoảng 10 -12 ml môi trường Iđể tạo mặt phẳng, sau đó cho thêm 8ml môi trường 2 (đối vói vi khuẩn) và môi trường 3 (đối với vi nấm) có trộn nhũ dịch vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ 1% so với môi trường lên bề mặt môi trường 1 Khi thạch nguội, các khoanh giấy tẩm chất thử được đặt lên bề mặt thạch theo một

sơ đồ đã qui định, để ở nhiệt độ phòng trong 2h cho các chất thử khuyếch tán vào môi trường Kết quả được đọc sau 18-24h nuôi cấy ở nhiệt độ 35®c đến 37°C(đối với vi khuẩn) và 25°c - 28®c (đối với vi nấm) Đo đường kính vòng vô khuẩn chính xác đến 0,lmm

Song song vói các mẫu thử làm mẫu chứng âm (khoanh giấy chỉ tẩm dimethylformamid) và mẫu so sánh là sulfanilamid

Kết quả được ghi trong bảng 6

Bảng 6: Phổ kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp.

vsv

chất thử

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

B cereus B pumilus s lutea s aureus E coli s typhi s flexeri p mirabilis p aeruginosa c albicans

-*> Xác đinh nồng đô ức chế tối thiểu (MIC)

Để đánh giá hoạt lực kháng khuẩn kháng nấm của các chất tổng hợp chúng tôi tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Qua kết quả phổ kháng khuẩn kháng nấm của các chất tổng hợp được,chúng tôi đã chọn hai chất đại diện là chất số 4 và chất số 5 để nghiên cứu nồng độ ức chế tối thiểu trên các vi

sinh vật kiểm định Kết quả được thể hiện ở các bảng 7 và 8

Để so sánh chất tổng hợp với nguyên liệu ban đầu chúng tôi tiến hành thử nồng độ

ức chế tối thiểu của nguyên liệu ban đầu là sulfanilamid trên các vi sinh vật kiểm định Kết quả được thể hiện ở bảng 9

*Môi trường

-Môi trường canh thang cao thịt -cao men

(môi trường 4)Pepton : lOg

Glucose: 20g Nước cất v/đ ; lOOOml PH=5,8 ± 0,2

Đóng ống 4,3ml

-Các môi trường được.hấp tiệt trùng ở 1 atm/20 phút

* Chuẩn bị mẩu thử: Mẫu thử được pha loãng trong dung môi dimethylíormamid với các nồng

độ khác nhau sao cho có dãy nồng độ cuối cùng từ Imcg/ml đến 2 0.0 0 0mcg/ml tuỳ theo mục đích thí nghiệm

* Tiến hành: Cho vào mỗi ống môi trưcíng 0,2ml chất thử ở các nồng độ qui định, thêm 0,5ml nhũ dịch vi sinh vật có khoảng 10’ tế bào/ml Song song với các ống thử làm 2 ống chứng:

- Chứng 1; môi trường +0,2ml dimethylformamid + 0,5ml nhũ dịch vi sinh vật

- Chứng 2 : môi trường + 0,2ml nước cất +0,5 ml nhũ dịch vi sinh vật

Nuôi cấy ở 35 - 37°c/18 - 24h đối với vi khuẩn

Và 25 - 28°C/24 - 48h đối với vi nấm

*ống thử nào có nổng độ chất thử nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật là nồng độ ức