Nhằm mục tiêu tìm hiểu sự thay đổi tác dụng và thành phần hoá học của dược liệu Đơn lá đỏ ở dạng chế biến và không chế biến, đồng thời bước đầu đánh giá khả năng chống khối u thực nghiệm
Trang 1B Ộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
BQl
s v NGTTYỄN P H Ứ C Á H H
VÀ TÁC DỤNG CHỐNG KHÔI u CỦA ĐƠN LÁ Dỏ
[ExcoecarìacoclììnchỉnensỉsVm, Euphorbiaceaeỉ
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHÓA 1997 - 2002 )
QUc^ 4 ^ THS NGUYỄN THÁI AN
TS TRẦN LƯU VÃN HIẾN Al«c Uực ụ*s: BỘ MÔN DƯỢC HỌC c ổ TRUYẼN
PHÔNG ĐÔNG Y THựC NGHIỆM • VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM
3 / 2002 - 5/2002
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Với lòng kúứi ừọng và biết ơn sâu sắc nhất, em xin bày tỏ lòng biết Cín chân ứiành tói :ThS Nguyễn Thái An
TS Trần Lưu Vân Hiền
Là những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và dành rất nhiều thời gian, công sức giúp đỡ em ttong suốt thòi gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Cũng nhân dịp này, em xin được bày tỏ lòng biết ơn tới sự giúp đỡ của PGS TS Phạm Xuân Sinh, GS TS Trần Mạnh Bình, PGS TS Bế Thị Thuấn, TS Đỗ Ngọc Thanh Cùng toàn thể các thầy cô và cán bộ Bộ môn Dược học cổ truyền, Bộ môn Dược liệu, Phòng Đông y thực nghiệm - Viện Y học cổ truyền Việt Nam, Phòng thí nghiệm Trung tâm trường Đại học Dược, Thư viện Đại học Dược đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Một lần nữa em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2002
Sinh viên
Nguyễn Phúc Ánh
Trang 3M ỤC LỤC
Trang
PHẦNI ĐẶT VÂN ĐỂ 1
PHẦN II TỔNG QUAN 2
2.1 Đặc điểm thực vật 2
2.1.1 Tên khoa học 2
2.1.2 Bộ phận dùng 2
2.1.3 Mô tả thực vật 2
2.1.4 Đặc điểm vi học 3
2.1.5 Phân bố 5
2.1.6 Trổng trọt thu hái và chế biến 5
2.2 Thành phần hoá h ọ c 6
2.3 Tác dụng sinh học 7
2.4 Công dụng 8
PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KÊT Q U Ả 10
3.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 10
3.1.1 Nguyên liệu 10
3.1.2 Phương pháp nghiên cứu 10
3.2 Kết quả và nhận xét 11
3.2.1 Xác định một số nhóm chất bằng phản ứng hoá học 11
Trang 43.2.2 Định lượng flavonoid toàn phần 19
3.2.3 Định tính flavonoid bằngSKLM 20
3.2.4 Định lượng tanin toàn phần 22
3.2.5 Phân lập các polyphenol 24
3.3 Tác dụng chống khối u của đơn lá đỏ 24
3.3.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 24
3.3.2 Kết quả nghiên cứu 26
3.3.3 Nhận xét 28
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ ĐỂ X UÂ T 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
Trang 6PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỂ
Từ xa xưa, cây cỏ đã được loài người sử dụng làm thuốc chữa bệnh Ngày nay, thời đại của khoa học kỹ thuật hiện đại, con ngưòd đã có thể tổng hợp được các hoạt chất có cấu trúc và tác dụng tương tự các thành phần có nguồn gốc thiên nhiên Tuy nhiên các loài thảo dược hiện nay vẫn được tiếp tục sử dụng
ở Việt Nam, việc sử dụng cây cỏ làm thuốc là một tập quán có từ lâu đời Với điều kiện khí hậu của vùng nhiệt đới, cây cỏ nước ta rất phong phú và đa dạng, trong đó có nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh
Cây Đơn lá đỏ (Excoecarỉa cochinchinensis Lour.) đã được dùng làm
thuốc từ lâu theo kinh nghiệm dân gian để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, dị ứng,
ỉa chảy Những nghiên cứu gần đây về vị thuốc này cho thấy trong Đơn lá
đỏ có các thành phần tanin, flavonoid Đây là những hợp chất hiện đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm về tác dụng chống oxy hoá (antioxydant), ức chế sự phát triển của HIV, khối u
Bên cạnh đó, tuỳ thuộc vào mục đích điều trị mà vị thuốc được sử dụng ở các dạng chế biến khác nhau Nhằm mục tiêu tìm hiểu sự thay đổi tác dụng và thành phần hoá học của dược liệu Đơn lá đỏ ở dạng chế biến và không chế biến, đồng thời bước đầu đánh giá khả năng chống khối u thực nghiệm của vị thuốc Đơn lá đỏ và hỗn hợp các polyphenol chiết xuất từ dược liệu Đơn lá đỏ, khoá luận tiến hành nghiên cứu với hai nội dung sau:
1 Nghiên cứu về thành phần hoá học của các mẫu dược liệu chế biến và không chế biến ,
2 Nghiên cứu khả năng chống khối u thực nghiệm của Đơn lá đỏ
Trang 7PHẦN II-T Ổ N G QUAN
2.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT:
2.1.1 Tên khoa học:
Excoecaria òíco/ơr Hassk [4], [7], [10], [14], [20]
Excoecaria cochinchinensis Lour [5], [14], [24].
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
- Tên Việt Nam : Đơn lá đỏ hay còn gọi là Đơn tướng quân, Đơn tía, Đơn
mặt quỉ, Đơn mặt trời, Liễu đỏ [5^
- Tên Trung Quốc : Hồng bối quế hoa [14], Bách thiên liễu [10]
Hoa mọc thành bông ở kẽ lá hay đầu cành, bông hoa đực dài 2cm, bông hoa cái ngắn hơn, cùng gốc hay khác gốc [15] Cây ra hoa vào các tháng 4, 5, 6[12],[18] (X e m h ìn h l)
Trang 8Hình l:Ả n h cây Đơn lá đỏ.
Hoa đực có 3 nhị, chỉ nhị mảnh, bao phấn đính lưng, bao phấn hình bầu dục Hoa cái có bầu trên hình trứng, 3 lá noãn hàn liền tạo thành bầu có 3 ô, đính noãn trung trục [18]
Trang 9Mình 2 Sơ đồ tổng qiiáí vi phẫu lá.
1 Biểu bì
2 Mỏ clày
3 Mổ mềm
4 Mô clạii, 5 Bó li be - gỗ
Trang 107 'ỉ inh (hể caiixi oxalal
ở Việ( Nam, Đ(tn lá (l(S niọc lioang liay đnực trổng ở nliiềii iKĩi nliư ; Long An, Tiền Giang, Đồng Thííp, Hậu Giang, An G iang
ở phía bắc, cây được (rồng nhiều Ỉ1 làng hoa Ngọc ĩlà - Hà Nội, Tliái
Bình, Nam Định .Ngoài ra, cfty còn đirợc trồng ở Quảng 'ĨAy, Ví1ii Nam (Trung Quốc) 119],124]
Cây dược (rồng làm cảíih, lấy lá và cành non làm Ihiiốc |4 |, |51, 114] những cây mọc hoang llniờng to cao iKm, U1 íl có màu đỏ tín hơn, có khi míit clirới cổ màu xanh, phiến lá liìnli nicìc thiiôn (lài [ 141
2 ỉ.6 'rrồ n g (rọf, thu hái VÍ1 chế biến:
-Trổng (rọl:
Tliưcìiig gieo hạt VÌIO vụ (lông xuân |41, híiy (lAm cành vào mùa xnAn và đầu hè, có nơi Irồiig bằng rễ cAy 112|
Trang 11- Thu hái, chế biến:
Thường thu hái quanh năm, hái lá, cành non vào buổi sáng sófm, mang về phơi âm can cho héo, sau đó cắt khúc 3-6cm, tiếp tục phơi nắng cho khô, có khi sấy ở nhiệt độ 50 ° c trong 2-3 giờ Rễ lấy về sao vàng hay phoi khô [14]
Sắc ký cột phân lập tanin thu được 2 chất:
- FAD 1: dự kiến là acid gallic có phổ u v Ằ =272nm, 216nm Phổ
IR hấp thụ ở 1245cm"', 1447cm‘', 1541cm"‘, 1619cm“', 1705cm ',
3 4 0 0 c m , 3285cm ■' Nhiệt độ nóng chảy từ 251-253 ° c [17]
- FAD 2:dự kiến là acid ellagic: có phổ u v A =203nm, 255nm, 303nm,367nm Phổ IR hấp thụ ở 1193cm-', 1336cm ' , 1447cm-', 1509cm-', 1619cm ' , 1699cm"', 3074cm“' , 3558cm '' Nhiệt độ nóng chảy là 361-363°c [17]
Trang 12sắc ký cột phân lập anthocyan thu được một chất FAD 9 có phổ u v
^rnM^=212nm, 274nm, và phổ IR có các đỉnh 1214cm"’, 1450cm ',
1 6 1 4 c m , 1709cm -', 2 8 5 0 c m , 3393cm ' [13]
Hàm lượng flavonoid toàn phần định lượng bằng phương pháp đo quang trên các mẫu ở một số địa phương như sau: mẫu dược liệu của Thái Bình 1,42%; Nghĩa Đàn - Nghệ An 1,38%; Nam Đàn - Nghệ An 1,35%; Tuyên quang 1,31%; Hà Nội
- Đơn lá đỏ có tác dụng chống dị ứng, chống choáng phản vệ, đặc biệt
là khi kết hợp với Kim ngân hoa, nâng cao tỷ lệ súc vật sống sót qua cơn choáng phản vệ [14], [15]
- Đơn lá đỏ kết hợp với Thương nhĩ tử và Kinh giói dưới dạng chè nhúng
có tác dụng chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hoá [16]
- Nhựa cây độc với cá [4], [5], [14] Hợp chất daphnan diterpen ester được chiết từ nhựa gây kích ứng da [12]
Trang 13- Đơn lá đỏ có tác dụng kháng khuẩn, tác dụng trên các vi khuẩn
Bacillus subtilis; B mỵcoides; B cereus; B pulmilus[\5^ và có tác dụng
kháng nấm Candida albicans tốt [15], [18].
- Dịch chiết flavonoid từ lá đơn đỏ có tác dụng ức chế rất tốt đối với vi
khuẩn Gram(+) như Bacillus subtilỉs; B cereus; B pulmilus; Sarcina lutea.
- Dịch chiết saponin có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn Gram(+) kém
nhưng lại có tác dụng tốt trên nấm Candida albicans [12].
Thử tác dụng của một thành phần tách từ hỗn hợp flavonoid toàn phần bằng
sắc ký chế hoá, nhận thấy nó có tác dụng trên cả chủng Staphylococcus aureus [12].
Dịch sắc lá Đơn đỏ, tanin toàn phần và chất FAD1 phân lập từ tanin toàn phần có tác dụng chống oxy hoá [17]
Mã đề, Kim ngân hoa dùng để chữa dị ứng, mẩn ngứa, mề đay, mụn nhọt [19\
Rễ cây chữa kinh nguyệt không đều, trừ phong thấp [19]
Trang 14- Dofn thuốc có Đơn lá đỏ dùng trong nhân dân:
+ Chữa mụn nhọt, mẩn ngứa: Dùng 20-30g lá sắc uống, dùng riêng hay phối hợp với lá Thài lài tía, Bầu đất tía, Đậu ván tía [4], [5], [10]
+ Chữa đi lỏng lâu ngày: Dùng 15g lá khô sao vàng, ứiêm một miêhg gừng nưỚQg, sắc với 3 bát nước, cô đên còn lại một bát chia làm 3 lần uống trong ngày [4], [5], [14],
+ Chữa đại tiện ra máu và trẻ em đi lỵ; Lấy một nắm lá, sắc uống [4],[5], [10]
+ Chữa Zona mẩn ngứa, mất ngủ: Lá tươi 400g, sao vàng, để nguội Thêm 600ml nước, sắc còn 200ml(một bát) chia làm 2-3 lần uống trong ngày [14]
+ Chữa mụn nhọt, lở ngứa, viêm cơ: Lá đơn đỏ kết họfp vód Kim ngân hoa,
Ké đầu ngựa, Sài đất, Thổ phục linh, Hà thủ ô, Hoàng đằng, Huyền sâm, Kê huyết đằng, Lá móng tay, Bồ công anh, Ngưu bàng tử mỗi vị 12g sắc uống [3], [14]
Trang 15PHẦN III - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
3.1.1 Nguyên liệu, súc vật, hoá ch ất:
Nguyên liệu: các mẫu nghiên cứu được thu hái và chế biến ở Hà Nội,
có ký hiệu lần lượt như sau:
Lá khô sao vàng : L3 Cành non: L4
Súc vật thí nghiệm : chuột nhắt trắng có trọng lượng 24 ± 1 g do Viện
Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội cung cấp
Benzo [ỡé] pyren và dầu Ba đậu (Croton oil) của hãng Sigina
3.1.2 Phương pháp nghiên cứu :
3.12.1 Hoá học :
- Định tính các hợp chất theo tài liệu [2], [9]
- SKLM theo tài liệu [17]
- Định lượng Aavonoid toàn phần bằng phương pháp cân [18]
- Định lượng tanin theo D Đ V N II tập 3 bằng phương pháp bột da[8]
- Phân lập các polyphenol toàn phần bằng sắc ký cột theo tài liệu [9]
- Độ ẩm dược liệu được xác định trên máy PRECICA- HA60
- Cất thu hồi dung môi trên máy BUCHI ROTAVAPOR R -114
Trang 16- Đo phổ ư v trên máy UV- VIS Spectrophotometer carry IE Varian [Úc] tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Đại học Dược.
- Đo phố hồng ngoại trên máy FT-IR Spectrophotometer 1650 Perkin Elmer (USA) tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Đại học Dược
3.1.22 Nghiên cứu tác dụng chống khối u:
- Mô hình tạo khối u thực nghiệm được tiến hành theo phương pháp đã
được R.Ramanathan miêu tả [23], tác nhân gây khối u là Benzo [a ] pyren và
dầu Ba đậu (croton oil) được bôi trên vùng da đã nhổ sạch lông
- Nghiền gan thận chuột trên bộ nghiền đồng thể Relex
- Xử lý kết quả trên phần mềm Excell
- Đo quang trên máy ELX 800 (Biotex- Instrument)
- Ly tâm trên máy lEC Centra 4R
- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi NIKON
3.2 KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT :
3.2.1 Xác định một sô nhóm chất bằng phản ứng hoá học :
32.1.1 Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hoả
Cân 5g dược liệu mỗi loại đã tán nhỏ cho vào bình cầu rồi chiết với
ether dầu hoả bằng bộ chiết Soxhlet trên nồi cách thuỷ sôi cho đến khi dung
môi trong bình chiết không màu Lọc dịch chiết qua bông, cất thu hồi bớt
dung môi, dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính
Trang 17* Định tính chất béo :
Chấm 3 giọt dịch chiết ether dầu hoả trên giấy bóng mờ, hơ trên bếp
điện đến khô , không thấy để lại vết mờ, chứng tỏ dịch chiết của cả 4 mẫu thử
đều không có chất béo
* Định tính carotenoid :
Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, để bốc hơi dung môi, cắn còn lại
màu nâu, thêm 2 giọt H2SO4 đặc thấy xuất hiện màu xanh lá ở cả 4 mẫu thử
Chứng tỏ dịch chiết có carotenoid
^Định tính phytosterol:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, để bốc hơi dung môi đến khô, cho
vào ống nghiệm Iml anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm Im l H2SO4 đặc theo thành
ống nghiệm Kết quả cho thấy, ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện
một vòng tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh Sơ bộ kết luận trong
dịch chiết của cả 4 mẫu thử đều có phytosterol
32.1.2 Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn:
Bã dược liệu sau khi chiết bằng ether dầu hoả để bay hơi hết dung môi,
cho vào bình cầu dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90°, lắp sinh hàn hồi lưu,
đun cách thuỷ sôi trong 30 phút, lọc Dịch lọc để làm các phản ứng định tính :
Trang 18- Phản ứng với kiềm :
+ Phản ứng với hơi amoniăc: nhỏ 3 giọt dịch chiết cồn lên tờ giấy lọc,
hơ nóng nhẹ cho khô, trên giấy có vết màu vàng nâu nhạt, hơ lên miệng lọ amoniăc đã được mở nút, thấy màu vàng của vết tăng lên rõ rệt ở cả 4 mẫu thử Phản ứng dương tính
+ Phản ứng với dung dịch NaOH 10% : cho Iml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa đục và màu của dịch chiết vàng đậm hơn so vơí dịch chiết ban đầu ở cả 4 mẫu Phản ứng dương tính
- Phản ứng với dung dịch FeClj 5%: cho Iml dịch chiết cồn vào ống nghiệm thêm vài giọt dung dịch FeClj 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen ở cả 4
mẫu Phản ứng dương tính
Qua các phản ứng trên sơ bộ kết luận trong dịch chiết của cả 4 mẫu thử
đều có flavonoid
* Định tính coumarin:
- Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào ống nghiệm, mỗi ống 1 ml
dịch chiết cồn, ống 1 cho thêm 0,5 ml NaOH 10 %, ống 2 để nguyên, cho cả 2 ống đun trên nồi cách thuỷ sôi trong vài phút, ống có kiềm xuất hiện nhiều tủa đục vàng Thêm vào mỗi ống 2ml nước cất thì cả 2 ống đều trong, thêm vào ống
có kiềm vài giọt HCl đặc không thấy xuất hiện tủa, nhưng màu vàng của dung dịch đều đậm hơn so với dịch chiết ban đầu ở cả bốn mẫu Phản ứng dương tính
- Soi huỳnh quang: nhỏ hai giọt dịch chiết cồn lên giấy lọc, sau đó nhỏ tiếp
lên một giọt NaOH 10% Để khô rồi đem soi dưới ánh sáng tử ngoại ở Ả 366
nm thấy có vết màu xanh hơi vàng
Trang 19Sau đó cũng làm một mẫu thử khác tương tự: nhỏ hai giọt dịch chiết cồn lên giấy lọc, thêm một giọt NaOH 10%, để khô, che nửa vết chất thử bằng một mảnh kim loại rồi soi dưới ánh sáng tử ngoại trong 30 giây thấy bên không bị che có màu xanh hơi vàng Lấy miếng kim loại ra thấy chỗ bị che không có màu, để một lúc lại sáng màu lên như bên không bị che mảnh
- Phản ứng Salkowski: lấy 1 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm thêm Iml acid H 2 SO 4 đặc từ từ theo thành ống nghiệm, thấy xuất hiện một vòng nâu đỏ ở giữa hai lớp chất lỏng và dịch chiết ở phía trên có màu xanh Phản ứng dương túứi
Sơ bộ kết luận có saponin ở cả 4 mẫu thử
3.2.1.3 Định tính alcaloid:
Lấy 2 gam dược liệu mỗi loại cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm
30 ml dung dịch H2SO4 2%, đun sôi trong 30 phút, để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn dung tích 100 ml, kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm (thử bằng chỉ thị màu) Chiết alcaloid dưới dạng bazơ bằng chloroform (10 ml X 3 lần) Sau đó chuyển alcaloid dưới dạng bazơ sang dạng muối bằng cách lắc với dung dịch H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước để làm các phản ứng định tính :
- Phản ứng với thuốc thử Mayer: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm con, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa trắng hay vàng nhạt ở cả 4 mẫu thử Phản ứng âm tính
