“Sàng lọc một số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi phân lập từ đất rừng ngập mặn tỉnh Thái Bình”.

Để diệt muỗi, một biện pháp phổ biến là dùng thuốc diệt muỗi hóa học, tuy nhiên, tính kháng lại thuốc hóa học của muỗi ngày càng tăng. Hơn nữa việc sử dụng thuốc hóa học còn gây độc hại cho người, động vật và gây ô nhiễm môi trường, không diệt trừ được tận gốc mầm bệnh. Do vậy một biện pháp an toàn và hiệu quả nhất để phòng và chống các bệnh do muỗi truyền là sử dụng chế phẩm vi sinh vật để diệt muỗi (bọ gậy) từ vi khuẩn có tên Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), và bacillus sphaericus (Bs) được sản xuất từ các chủng có hoạt tính diệt muỗi cao được phân lập tại những vùng có muỗi cư trú

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi

Các số liệu và kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công

bố trong công trình nghiên cứu khác

Hà Nội, ngày 23 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Kiều Oanh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận tốt

nghiệp tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được

bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những sự giúp đỡ này

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính

-phụ trách phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ

tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn KS Nguyễn Thị Luy, cùng toàn thể các cán bộ

phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công Nghệ Nông Lâm

-Thực phẩm trường Đại học Thành Tây đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình

học tập

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ,

động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ nhiệt tình và quí báu đó

Hà Nội, ngày 23 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Kiều Oanh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Là nước nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, lại có vị trí địa

lý thuận lợi, Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi ban tặng hệ sinh thái rất đa dạng

và phong phú

Việt Nam cũng là nơi để nhiều loài côn trùng có hại phát triển Một trong

số đó là muỗi, vector truyền những bệnh dịch nguy hiểm như sốt rét, sốt xuấthuyết, viêm não Nhật Bản, sùi chân voi, giun chỉ, sốt vàng da… Hiện nay cókhoảng 2,37 tỉ người trên thế giới sống trong vùng sốt rét Hàng năm có khoảng

500 triệu người mắc bệnh sốt rét, làm chết hàng triệu người, hàng triệu người bịbệnh sốt xuất huyết và các bệnh khác [34, 35]

Để diệt muỗi, một biện pháp phổ biến là dùng thuốc diệt muỗi hóa học, tuynhiên, tính kháng lại thuốc hóa học của muỗi ngày càng tăng Hơn nữa việc sửdụng thuốc hóa học còn gây độc hại cho người, động vật và gây ô nhiễm môitrường, không diệt trừ được tận gốc mầm bệnh Do vậy một biện pháp an toàn

và hiệu quả nhất để phòng và chống các bệnh do muỗi truyền là sử dụng chế

phẩm vi sinh vật để diệt muỗi (bọ gậy) từ vi khuẩn có tên Bacillus thuringiensis subsp israelensis (Bti), và bacillus sphaericus (Bs) được sản xuất từ các chủng

có hoạt tính diệt muỗi cao được phân lập tại những vùng có muỗi cư trú [16]

Ở Việt Nam, nhiều phòng thí nghiệm đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng

chế phẩm sinh học Bt trừ sâu hại cây trồng nông lâm nghiệp và đã thu được những kết quả nhất định Tuy nhiên, chế phẩm Bt diệt ấu trùng muỗi vẫn chưa

được quan tâm phát triển Để sản xuất được chế phẩm có hoạt tính mạnh và phùhợp với điều kiện sinh thái Việt Nam, cần thiết phải nghiên cứu, tuyển chọn

được các chủng Bt có hoạt tính cao ở Việt Nam.

Thái Bình là một tỉnh ven biển ở đồng bằng sông Hồng, miền Bắc ViệtNam, có diện tích tự nhiên là 1.542 km2 Địa hình khá bằng phẳng với độ dốcthấp hơn 1%, độ cao phổ biến từ 1-2 m trên mực nước biển, thấp dần từ Bắcxuống Đông Nam, Thái Bình nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới: mùa hènóng ẩm, mưa nhiều từ tháng 5 đến tháng 9; mùa đông khô lạnh từ tháng 11năm trước đến tháng 3 năm sau; tháng 10 đến tháng 4 là mùa thu và mùa xuân

Là một tỉnh đồng bằng không có đồi núi, nhưng Thái Bình lại có 54 km bờ biểntrải dài suốt 2 huyện Thái Thụy và Tiền Hải, nơi đây có hàng ngàn ha rừng ngậpmặn bao bọc, tạo thành bức tường xanh vững chắc mang lại hiệu quả cao vàphòng chống thiên tai, bảo vệ môi trường Vùng đất ngập mặn ven biển Thái

Bình là một trong những khu dự trữ sinh quyển thế giới tạo ra sự đa dạng vàphong phú về động vật, thực vật cũng như các loài vi sinh vật trong đó có vi

khuẩn Bacillus thuringiensis.

Việc tìm kiếm, nghiên cứu hoạt tính diệt muỗi của các chủng Bt phân lập ở

Việt Nam nói chung và ở vùng đất ngập mặn tỉnh Thái Bình nói riêng là cầnthiết nhằm tìm ra những chủng mang gene tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụcho sản xuất thuốc diệt muỗi sinh học Xuất phát từ mục đích này, chúng tôi tiếnhành nghiên cứu đề tài:

“Sàng lọc một số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt ấu

trùng muỗi phân lập từ đất rừng ngập mặn tỉnh Thái Bình”.

Mục tiêu của đề tài:

Sàng lọc được chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi

tốt nhất để sản xuất thuốc diệt muỗi sinh học

Để đạt được mục tiêu của đề tài cần cần thực hiện các nội dung sau:

1 Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất rừng ngập mặn

thuộc tỉnh Thái Bình

2 Thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi của các chủng Bt đã được phân lập.

3 Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh.

4 Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi bằng phương pháp

sinh học phân tử

5 Chọn chủng Bt có hoạt tính diệt bọ gậy tốt nhất để thành lập công thức chế phẩm nhằm đưa vào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm Bt diệt ấu trùng muỗi.

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Trên thế giới

Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được coi

là vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gâybệnh cho côn trùng [1]

Lịch sử nghiên cứu ứng dụng của Bacillus thuringiensis được bắt nguồn

ngay từ những năm đầu tiên của thế kỉ 20 Từ năm 1870 khi Loius Pasteur pháthiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là

Bacillus bombyces.

Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Shigetane Ishiwata nghiên cứu về bệnh

ở tằm dâu, ông đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi

khuẩn thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto Đến mười

năm sau (1911), loài vi khuẩn này được nhà khoa học người Đức là E Berliner

phân lập được từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải, Anagasta kuhniella và ông

đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất, tế bào hình que, có khả năng

sinh bào tử này Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis do phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức Về sau chủng này bị thất lạc và được Mattes và cộng sự đã phân lập lại từ A.kuhniella

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể

có bản chất protein Năm 1956, Angus đã chứng minh được hoạt tính diệt sâu là

do tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết

thanh

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra Bacillus thuringiensis subsp isralensis (Bti) tại Israel, có khả năng diệt được cả ấu trùng muỗi và ruồi

thuộc bộ hai cánh (Diptera) [1]

Năm 1981, gene mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên được tách dòng

và đọc trình tự Từ đó 1 lượng lớn gen đã được tách dòng và nghiên cứu đặc tínhcủa chúng

Trong những năm 1987–1992, người ta tiếp tục nghiên cứu và phát hiện

thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda

và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera

Việt nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringensis (Bt) các nhà khoa học Việt Nam đã đạt được nhiều thành

tựu trong nghiên cứu, sản xuất và đưa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụngvào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp

Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ thực

vật năm 1971

Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Bt tại Viện Sinh vật với môi trường đặc với chủng giống có nguồn gốc từ Trung Quốc thuộc dưới loài Bt subsp thuringiensis, Bt subsp kurstaki Các chế phẩm này được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và

đã đạt được những kết quả đáng quan tâm

Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo

phương pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5m3

Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt đã giảm sút bởi vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lượng không cao do vậy tốc độ tiêu thụ giảm

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Côngnghiệp Thực phẩm Phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực

hiện đã phân lập, sàng lọc và lựa chọn được một số chủng Bti và Bs ở Việt Nam

có hoạt lực diệt muỗi cao, đã tách được các gen mã hóa protein độc tố diệt muỗi

cry4 và cry2, đã sản xuất được một lượng chế phẩm để thử nghiệm trong phòng

thí nghiệm và bước đầu đưa ra áp dụng thực tế Kết quả cho thấy hiệu quả diệt

ấu trùng muỗi sốt rét (Anopheles minimus), muỗi vằn truyền bệnh sốt xuất huyết (Aedes aegypti), muỗi truyền bệnh viêm não Nhật Bản, bệnh sùi chân voi, giun chỉ (Culex quinquefasciatus, Culex pipiens) đạt 95,0 – 100% sau 6 giờ xử lý

trong phòng thí nghiệm Trong tự nhiên (ao, hồ, sông, ngòi) đạt tỷ lệ chết trungbình từ 85,0 – 93,6% sau 4 ngày xử lý [2]

Dự án “Sản xuất thử chế phẩm diệt muỗi” năm 2007 do Viện Khoa họcViệt Nam cấp quản lí đã sản xuất được chế phẩm diệt muỗi dạng dịch thể và đặcbiệt là dạng bánh tan chậm Chế phẩm dạng bánh lõi ngô tan chậm đã cho hiệuquả diệt bọ gậy rất cao (100% trên hiện trường) và hiệu quả diệt bọ gậy kéo dàisau 4 tháng đạt từ 90–100% Bánh lõi ngô diệt bọ gậy là chế phẩm đã được CụcSáng chế phát minh chấp nhận đăng công báo [37]

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.1 Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái và sinh thái học

Bacillus thuringiensis được xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes Nhóm này gồm hơn 20 loài khác nhau, ngoài Bt còn có vi khuẩn B suBtilis, B.cereus (vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy), vi khuẩn B anthracis (vi khuẩn gây bệnh than) Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thường được coi là vi

khuẩn đất Chúng sống trong môi trường đất, côn trùng và bề mặt tiếp xúc vớicôn trùng [22]

Bacillus thuringiensis hình que, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào, bắt màu Gram dương Vi khuẩn Bt hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc Mỗi tế bào Bt có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc có

bản chất protein có khả năng diệt côn trùng Kích thước tế bào khoảng 1,4µm x 2,5-10µm

0,8-Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích thước 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm,quá trình hình thành bào tử không làm thay đổi hình dạng tế bào Một đặc điểm

quan trọng là trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis đều tổng hợp protein tinh thể Protein tinh thể ở mỗi chủng khác

nhau sẽ có hình dạng, kích thước và số lượng khác nhau, tuy nhiên chúng mangđặc điểm chung là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng Khi ở trong

tế bào sinh dưỡng, tinh thể thường nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể vàbào tử đều thoát ra ngoài

Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fucshin và quan sát dưới kính hiển

vi thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt (hình 1.1)

[1, 5, 6]

Trong môi trường lỏng Bacillus thuringiensis có khả năng chuyển động,

khả năng này có được là nhờ các lông roi (flagellar) trên bề mặt tế bào có kíchthước lớn hơn 0,9 µm

B thuringiensis được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất

nhiều môi trường khác nhau Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ biến của

B thuringiensis trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13]

1.2.2 Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus

Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là tiêu chuẩn cho mục đích phân loại Các loài thuộc nhóm B cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B anthracis, B mycoides, B megaterium, mới đây đã phát hiện thêm hai loài là B weihenstephanensis và B peseudomycoides [39].

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi độ

phóng đại 100X

Tế bào Bào tử

Tinh Thể

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

B thuringiensis không lên men sinh axit trong môi trường chứa arrabinoza,

xylose, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose Có khả năng thuỷphân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH=5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà.Không có khả năng khử amin của phenilalamin, không sử dụng axit citric,không khử muối sunphat [36]

B thuringiensis có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ

15-45oC Nhiệt độ tối ưu là 28-30oC

B thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH=7 Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và

dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas [1, 36]

1.2.4 Protein tinh thể của Bacillus thuringiensis

Sự tồn tại của các thể vùi ở Bt được phát hiện đầu tiên vào năm 1915,

nhưng việc nghiên cứu chúng chỉ được thực hiện vào những năm 1950, cácnghiên cứu đã chỉ ra rằng các thể vùi này chính là các protein có cấu trúc tinhthể [37] Các tinh thể protein được hình thành trong quá trình tạo bào tử, chúng

tạo thành từ một hoặc một vài gene cry (crystal) và gene cyt (cytolytic) mã hóa tinh thể độc nằm trên các plasmid Các protein độc tố của Bt rất đa dạng, đã có

hơn 30 loại protein Cry và 8 loại protein Cyt đã được biết đến, hơn 100 gen đãđược tách dòng và xác định trình tự [33] Tùy theo thành phần protein cấu tạokhác nhau mà các tinh thể có nhiều hình dạng đặc biệt (hình lưỡng tháp, hìnhkhối hộp, hình thoi dẹt, hoặc tổ hợp các hình dạng khác nhau) [37]

1.2.5 Hệ gene của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Kích thước hệ gene của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng 2,4-5,7

triệu bp Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên cho

một số chủng Bacillus thuringiensis [18] Hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST, các nhân tố di

truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [32] Trong một thời giandài người ta cho rằng các protein tinh thể được mã hóa chung trên các plasmid

lớn Khi sử dụng kỹ thuật lai ADN với các mẫu dò cho gen cry đã nhận thấy

chúng xuất hiện cả trên NST [14, 28]

1.2.6 Độc tố từ Bacillus thuringiensis

Trước đây, khóa phân loại protein độc tố được Hoft và Whiteley đề nghịnăm 1989 dựa trên tính tương đồng giữa các trình tự acid amin Dựa trên khóaphân loại này năm 1998 Crickmore và cộng sự đã đề xuất một khóa phân loạimới hoàn thiện hơn Trong khóa phân loại này đã đổi tên một số protein và thayđổi cách viết tên độc tố và tên gen mã hóa các độc tố đó [21]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Bacillus thuringiensis có khả

năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt(Cytolysin) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein) Dựa vào tính tương đồngcủa trình tự acid amin của các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khácnhau, cách viết tên độc tố với các bậc cấu trúc đầy đủ được quy ước như sau: họđộc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1,2,3 ), ký tự viết hoa (A, B ), ký tự viếtthường (a, b ), số đếm (1,2,3 ), ví dụ như độc tố Cry12Aa1 Tỷ lệ axit amin

tương đồng để phân chia các lớp độc tố như sau: lớp 1 (Cry1, Cry2 ) có độtương đồng dưới 45%, lớp 2 từ 45%-78%, lớp 3 từ 78%-95%, lớp 4 dưới 99%

[17, 21, 29 ] Ngoài 3 họ độc tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một số

độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase

1.2.6.1 Độc tố Cry

Đây là họ độc tố quan trọng nhất, được phát hiện và nghiên cứu chi tiếtnhất Tính đến năm 2005, đã phát hiện được 310 độc tố Cry khác nhau ( thuộc

47 nhóm từ Cry1- Cry47) [16]

Cấu trúc chung

Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên cứutinh thể bằng tia X với nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa, sau

đó được mở rộng cho các độc tố khác Các protein tinh thể có cấu trúc chunggồm 3 vùng (Domain) Thứ tự các vùng được tính từ đầu N đến đầu C của chuỗipolipeptid [16]

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của protein tinh thể

Vùng 1 có chứa một bó gồm 7 chuỗi xoắn α đối song song (α antiparallel)trong đó chuỗi số 5 được bao bọc bởi các chuỗi còn lại, vùng này mang đầu N[30]

Vùng 2 có chứa 3 tấm β đối song song tạo thành một dạng hình học topođiển hình gọi là “Greek key”, sắp xếp này cũng được gọi là cuộn lăng kính β (β-prism fold) Vùng 2 được xem là quyết định tính đặc hiệu liên quan đến việc gắnđộc tố vào màng, cơ chế gắn cho vùng 2 là phức tạp Các số liệu đã chỉ ra một

sự giống nhau giữa các móc gắn thụ thể của vùng 2 với các epitop đã biết như là

vị trí liên kết kháng nguyên-kháng thể

Vùng 3 có chứa 2 cuộn xoắn, các tấm β đối song song tạo thành một kẹp β(β-sandwich) hình học topo gọi là “jelly roll” Vùng 3 cũng tham gia vào việcgắn thụ thể [30]

Đặc điểm một số protein độc tố Cry

Nhóm Cry1: gồm 139 protein thuộc các nhóm độc tố Cry1A - Cry1L cókhối lượng khoảng 130 kDa, tích lũy thể vùi dạng hình tháp và thường chỉ cóhoạt tính chống lại các loài thuộc bộ vảy Genr đầu tiên mã hóa cho protein

nhóm này được phát hiện bởi Schnepf và cộng sự trong Bt Kurstaki từ chế

phẩm Dipel [35]

Nhóm Cry2: gồm 21 độc tố thuộc nhóm Cry2A, các protein nhóm này cókhối lượng khoảng 70 kDa, có hoạt tính với cả 2 loài thộc bộ cánh vảy (H.vivescens, M sexta, T ni, L dispar, P brasicae…) và bộ hai cánh (Aedesaegipti, Anopheles gambiae…) [35]

Nhóm Cry3: gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3A - Cry3C, có khốilượng khoảng 73 kDa, có hoạt tính chống lại các loài thộc bộ cánh cứng [35].Nhóm Cry4: gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A – Cry4B tích lũy cả hai loạiprotein tinh thể có khối lượng khoảng 70 kDa và 130 kDa, có hoạt tính với cácloài thuộc bộ hai cánh Những protein này cùng với protein 27 kDa do gen

cyt1A tổng hợp tạo ra một phức hợp tinh thể tròn [35].

1.2.6.2 Độc tố Cyt

Cũng có bản chất là protein và hình thành thể vùi như độc tố Cry, nhưngtính tương đồng của trình tự acid amin giữa độc tố Cyt và độc tố Cry hầu nhưkhông đáng kể Độc tố Cyt đầu tiên được Waalwijk phát hiện là Cyt1Aa1 vàonăm 1985 Hiện nay người ta đã phát hiện được 22 độc tố Cyt được phát hiện

chủ yếu thuộc các dưới loài Bacillus thuringiensis israelensis, morrisoni, Medellin, neolonensis, kyushuensis, damstradiensis, fuokukaesis, tenebrionis.

1.2.6.3 Độc tố Vip

Có một số protein diệt sâu không liên quan đến protein Cry được tạo ra ở

một số chủng Bt trong pha sinh trưởng sinh dưỡng của tế bào, các protein này gọi chung là Vip (Vegetative Insecticidal Protein) do gen vip mã hóa tổng hợp

Các Vip này không phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào Độc tốVip được phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch

và cộng sự

Gene vip3A mã hóa protein 88 kDa được tổng hợp trong suốt pha sinhdưỡng nhưng nó không được tiết ra ngoài Gene mã hóa protein Vip3A xuất

hiện trong cả các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus Protein này có

hoạt tính đối với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy như: Agrotisipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea Khi côntrùng mẫn cảm ăn phải độc tố, Vip3A là nguyên nhân gây phân giải các tế bàobiểu mô ruột giữa; các đặc tính vật lý của Vip3A biểu lộ tính độc như proteinCry [25, 26]

1.2.7 Cơ chế tác động của độc tố Cry

Cơ chế tác động của protein tinh thể của Bacillus thuringiensis liên quan

tới sự hoà tan của tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Các tinh thể độc đềuđược bắt nguồn từ một protein có khối lượng phân tử lớn khoảng 130-140kDa,được gọi là “tiền độc tố” Tiền độc tố này phải được hoạt hoá thì mới gây ra tínhđộc Trong những điều kiện bình thường thì protein tinh thể không bị hoà tan, dovậy nó rất an toàn với người và động vật bậc cao Tuy nhiên trong môi trường

pH cao (khoảng 9,5), protein tinh thể sẽ bị hoà tan Môi trường pH này thường

thấy trong ruột giữa của ấu trùng thuộc bộ cánh vảy Với lý do này, Bt được xem

là một tác nhân diệt côn trùng có tính đặc hiệu cao [27]

Hình 1.3 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng

Tinh thể độc gây độc lên côn trùng thông qua con đường tiêu hoá Nhờ có

hệ enzyme protease và môi trường pH kiềm ở ruột giữa của côn trùng mà tinh

thành phần cấu tạo của tinh thể Khi tan nó sẽ tạo ra các mảnh độc có khối lượngphân tử nhỏ Các mảnh độc này sẽ gắn với các thụ thể có ở trên màng biểu môcủa tế bào ruột làm thủng tế bào Kết quả là ruột bị tê liệt, ấu trùng ngừng ăn, pHruột bị giảm do sự cân bằng với pH máu pH thấp là điều kiện thuận lợi cho bào

tử vi khuẩn nảy mầm, vi khuẩn xâm nhập vào côn trùng gây ra sự nhiễm trùngmáu và làm chết côn trùng

Khi các tinh thể độc được hoà tan trong môi trường kiềm nhân tạo màkhông có protease thì hầu hết các tinh thể protein đặc biệt là loại 130kDa khôngđộc với các tế bào của côn trùng, vì vậy các tinh thể protein được gọi là “Tiềnđộc tố”

Các nghiên cứu gần đây về cấu trúc nội độc tố  đã chỉ ra rằng nội độc tố được chia làm 3 vùng Cả 3 vùng này đều có những chức năng nhất định trongquá trình gây độc lên côn trùng

Có cấu trúc chặt chẽ, có chức năng bảo vệ phần cuối của độc tố, ngăn cản

sự phân chia thêm nữa bởi tác động của protease ở ruột [1]

Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng là

sự gắn kết của độc tố với thụ thể và sự hình thành lỗ rò (kênh ion)

1.2.8 Phân loại Bacillus thurigiensis

Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới

cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh Phương pháp

này đã được cải tiến năm 1980, 1981 và được công nhận là phương pháp đáng

tin cậy, được Trung Tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt tại Viện Pasteur,

paris khuyến cáo sử dụng trên thế giới từ năm 1982 Phương pháp được xác địnhchủ yếu dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên–kháng thể Cho đếnnăm 1999, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết

thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis [31].

1.3 Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp israelensis (Bti)

Trong thời gian 1975-1976, một dự án tài trợ bởi Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) thực hiện ở Israel nghiên cứu các tác nhân gây bệnh và các ký sinh

trùng Trong quá trình thực hiện dự án, một dưới loài mới của Bt đã được phát

hiện và có độc tính cao với ấu trùng muỗi [38], dưới loài này được xác định và

đặt tên là Bacillus thuringiensis subsp israelensis, kiểu huyết thanh H14 [9].

Chủng này được tìm thấy ở hoang mạc Negev của Israel

Bti tác động khá đặc hiệu trên côn trùng bộ hai cánh (Diptera), diệt nhiều loại muỗi và ruồi khác nhau Bti nhanh chóng được nghiên cứu và thương mại

hóa vào những năm 1980, một vài sản phẩm được phát triển Nhu cấu bảo vệmôi trường và sự phát triển mạnh tính kháng thuốc của côn trùng đối với các

loại thuốc hóa học là căn cứ cho các nghiên cứu về Bti Các sản phẩm từ Bti

được bán tại nhiều nước, nhiều chương trình dự án diệt muỗi và ruồi bằng sản

phẩm Bt được thực hiện ở Châu Phi, Mỹ, và Châu Âu Nói chung, Bti thường

được sử dụng tại các khu vực có hệ môi trường tương đối nhạy cảm, việc sửdụng thuốc hóa học bị hạn chế

1.3.1 Tinh thể độc của Bti

Tinh thể độc của Bti có dạng hình cầu (trứng) có kích thước khoảng

0,7÷1,2 µm có hoạt lực đặc hiệu với côn trùng bộ 2 cánh (Diptera) Người ta đã

xác định thành phần protein của Bti bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) theo đó tinh thể độc của Bti có 4 gen cry và 2 gen cyt

mã hóa các protein Cry4Aa (125 kDa), Cry4Ba (135 kDa), Cry10Aa (58 kDa),Cry11Aa (68 kDa) và Cyt1Aa, Cyt2Ba (27 kDa), các gen này nằm trong mộtplasmid có khối lượng 72 MDa [18] Các protein này thực chất là các tiền độc

tố, nó chỉ có tác dụng gây độc khi được hòa tan và phân giải thành mảnh nhânđộc, tác dụng phân giải xảy ra trong môi trường kiềm và dưới tác dụng củaprotease thì:

Protein 27 kDa bị phân hủy thành protein 25 kDa (cả 2 protein này đều cóhoạt lực diệt côn trùng thấp)

Protein 72 kDa bị phân hủy thành các tiểu phần 31 và 35 kDa, 2 tiểu phầnnày cũng có tác dụng diệt muỗi thấp

Protein 78 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 kDa

Protein 128 và 135 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 và 73 kDa [20]

1.3.2 Hoạt tính diệt côn trùng của Bti

Bti có độc tính cao với các vi sinh vật thuộc họ Culicidae (muỗi) và

Simuliidae (ruồi) Các loại muỗi khác nhau thường có mức độ nhạy cảm khác

nhau với Bti Nói chung, muỗi Culex và Aedes thường nhạy cảm hơn muỗi Anopheles [8] Ngay cả trong cùng một loại muỗi, mức độ nhạy cảm cũng thay

đổi theo loài

Các loài muỗi không thuộc nhóm ăn bằng vòi lọc thì hầu như không bị diệt

bởi Bti Muỗi Culicoides occidentalis và Coquilenttidia perturbans khi thử nghiệm đã không bị diệt bởi Bti Trong giống muỗi ăn thịt Toxorhynchites, có

một số loài nhạy cảm và một số loài không nhạy cảm

Côn trùng thuộc họ Chironomidae và Tipulidae cũng thuộc nhóm có nhạy

cảm với Bti Ở một số khu vực, chúng là sinh vật quan trọng làm nguồn thức ăn

cho các sinh vật khác Ở một số khu vực khác, Chironomids là những sinh vật

có hại Liều dùng để diệt Chironomids thường cao gấp hàng chục lần liều dùng

để kiểm soát muỗi [10]

1.3.4 Các dạng chế phẩm Bti

Hiện nay, có một số chế phẩm Bti các dạng như lỏng, bột, hạt,… đang được

bán trên thị trường (Bảng 1.2) Dạng công thức chế phẩm sẽ quyết định đếnphạm vi ứng dụng, tính chất tồn lưu, mức độ phân tán và hiệu quả của chếphẩm

Các chế phẩm Bt diệt côn trùng đã được thương mại hóa từ lâu, do đó khi phát hiện ra Bti thì chế phẩm từ Bti nhanh chóng được phát triển dựa trên cơ sở nghành công nghiệp Bt sẵn có Các chế phẩm thương mại thường có thời gian bảo quản lâu, hoạt tính chống muỗi và ruồi Các chế phẩm Bti được cấp và đăng

ký bởi Cơ quan Bảo vệ Môi trường (EPA) tại Mỹ từ năm 1980, thương mại hóarộng rãi ở Mỹ, Châu Âu và Australia vào năm 1984 Các chế phẩm đầu tiên này

có dạng lỏng và thời gian bảo quản ngắn, tác động hạn chế, bị ảnh hưởng bởicác yếu tố môi trường [19]

Các chế phẩm dạng lỏng với nồng độ đậm đặc thường được dùng chonhững vùng nước đọng, nước lụt Các chế phẩm dạng hạt nổi thường được dùngcho vùng nước chảy Để diệt các loài bọ gậy ăn chìm thì chế phẩm phải có tỷtrọng lớn hơn nước 1,1 lần Các chế phẩm nổi thường có tỷ trọng so với nước

nhỏ hơn 0,9 và rất có hiệu quả với muỗi Anopheles [10] Các chế phẩm dạng

bánh được cho thấy có hiệu quả tác động kéo dài hơn các dạng chế phẩm khác[10]

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thương mại có nguồn gốc Bti dùng cho

diệt ruồi và muỗi [10].

by Abbott?)

1.3.5 Tính kháng thuốc của côn trùng đối với Bti

Tính kháng thuốc của Bt nói chung đã tăng lên đáng kể, đặc biệt ở côn trùng Lepidoptera Tuy vậy việc áp dụng Bti trong nhiều năm vẫn chưa làm phát

sinh tính kháng trong quần thể côn trùng Đã có rất nhiều công trình cố gắng làm

phát sinh tính kháng của côn trùng với Bti trong phòng thí nghiệm nhưng đều

không đạt được tính kháng thuốc hoặc đạt với mức độ kháng thuốc vô cùng yếu[24].

Muỗi Ae Vexans ở Đức phơi nhiễm ngoài đồng ruộng với Bti trong 10 năm

nhưng vẫn không phát sinh tính kháng [10] Sự không phát sinh được tính kháng

đối với Bti được giả thiết là do cơ chế tác động gồm nhiều protein độc tố Khi sử dụng chỉ một protein độc tố của Bti để diệt muỗi đã dẫn đến kết quả là tính

kháng thuốc phát sinh tăng lên ngay sau vài thế hệ [10] Khi cả 4 protein độc tốđược sử dụng, cơ hội phát sinh tính kháng thuốc là vô cùng nhỏ

1.3.6 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hiệu quả của chế phẩm

Những điều kiện hữu sinh và vô sinh đều có thể ảnh hưởng đến Bti Nói chung, tác động của Bti giảm khi nhiệt độ môi trường giảm và phụ thuộc nhiều

vào chất lượng nước Tập tính ăn của ấu trùng muỗi cũng ảnh hưởng đến hiệuquả diệt

Tập tính ăn của bọ gậy

Culex thường ăn trong toàn bộ khối nước và Aedes thường ăn trên bề mặt

vật rắn, các chế phẩm dạng hạt cố định có hiệu quả tốt đối với cả hai loại muỗi

này Anopheles thường ăn trên bề mặt, trong khi đó, Bti lại chỉ tồn tại trên mặt

nước trong thời gian rất ngắn Ngoài ra, tốc độ lọc nước của ấu trùng các loại

muỗi khác nhau cũng khác nhau Nói chung, Anopheles thường ít nhạy cảm với Bti hơn Culex và Aedes Các chế phẩm dạng nổi khắc phục được sự khác nhau

về tập tính ăn của các loại muỗi, cho hiệu quả diệt như nhau giữa Culex và Anopheles

Liều dùng và mật độ bọ gậy

Liều dùng và mật độ bọ gậy cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của chế phẩm.Mật độ bọ gậy càng cao thì liều dùng cần thiết càng phải lớn Để đạt được cùngtỷ lệ chết như nhau thì liều dùng cho 50-100 cá thể bọ gậy/đĩa phải gấp 1,5-2 lầnkhi dùng cho 5-20 cá thể bọ gậy/đĩa [33]

Tuổi của bọ gậy

Tuổi bọ gậy càng cao thì hiệu quả chế phẩm càng giảm Ấu trùng muỗiphát triển qua 4 giai đoạn Liều lượng chết của ấu trùng tuổi 4 có thể phải caogấp 10 lần liều lượng chết của ấu trùng tuổi 2 Ở giai đoạn nhộng và tiền nhộng,

ấu trùng ăn rất ít hoặc ngừng ăn, do vậy chúng không bị tác động bởi Bti [33].

Các sinh vật khác

Các sinh vật khác, nhất là các loài ăn bằng cách lọc nước, sẽ làm giảm

nồng độ Bti trong nước và làm giảm lượng Bti mà các ấu trùng muỗi ăn phải,

đẫn đến hiệu quả diệt giảm [11]

Chất lượng của nước

Các yếu tố chất lượng nước như: nồng độ muối, chất ô nhiễm, chất vô cơ,chất hữu cơ đều ảnh hưởng đến hiệu quả của chế phẩm Càng nhiều chất hữu cơ

lơ lửng trong nước thì lượng Bti bị ấu trùng ăn phải càng ít và hiệu quả chế

phẩm giảm Nồng độ Clo trong nước cao sẽ làm phá hủy và kìm hãm độc tố.Nước lẫn đất cũng làm giảm hiệu quả của chế phẩm Ngoài ra các chất hóa họckhác như các axit cũng có ảnh hưởng tới hiệu quả của chế phẩm

Nhiệt độ

Nhiệt độ nước giảm sẽ làm giảm hiệu quả của chế phẩm Khi nhiệt độ nước

giảm, ấu trùng ăn ít hơn và hấp thu ít Bti hơn.

pH

Các nghiên cứu cho thấy Bti ít nhạy cảm với pH Nói chung, chế phẩm Bt

thường kém hiệu quả khi pH nước lớn hơn 8 [34]

1.4 Tổng quan về muỗi

Muỗi là một nhóm sinh vật thuộc lớp côn trùng hợp thành họ Culicidae, bộHai cánh (Diptera) Chúng có một đôi cánh vảy, một đôi cánh cứng, thân mỏng,các chân dài Muỗi đực hút nhựa cây và hoa quả để sống, muỗi cái hút thêm máungười và động vật Kích thước thay đổi theo loài, nhưng ít khi lớn hơn 15mm

Đa số có trọng lượng khoảng 2 đến 2,5 mg Chúng có thể bay với tốc độ 1,5-2,5km/h [39]

1.4.1 Phân loại khoa học của muỗi

Kingdom (giới): Animalia (động vật)

Phylum (nghành): Athropoda (chân khớp)

Class (lớp): Insesta (côn trùng)

Ordo (bộ): Diptera (hai cánh)

Familia (họ): Culicidae (muỗi)

Muỗi đã tồn tại trên hành tinh của chúng ta khoảng 170 triệu năm [39] HọCulicidae thuộc bộ Diptera chứa khoảng hơn 3000 loài thuộc 3 phân họ:Anophelinae gồm: 3 giống, Culicinae: gồm 37 giống chiếm hơn 80%,Toxorhynchitinae: gồm 1 giống

Trong đó những giống muỗi được biết đến nhiều nhất gồm: Anopheles, Culex, Aedes, Masonia, Sabethes, Wyeomyia và Malaya.

Muỗi được xếp vào nhóm côn trùng có khả năng gây bệnh cho người vàđộng vật Khi hút máu, muỗi có thể truyền các loại virus gây bệnh cho người vàđộng vật như bệnh sốt xuất huyết, sốt rét, viêm não Nhật Bản… Một số loàimuỗi có khả năng hút máu nhưng không là vật trung gian truyền bệnh, tuy nhiênnhững vết đốt của chúng lại là nguyên nhân gây dị ứng cho nhiều người Khi mà

số lượng muỗi tăng cao quá mức, chúng gây hại đến vật nuôi, ảnh hưởng đếnđời sống con người

1.4.2 Vòng đời của muỗi

Muỗi sinh trưởng qua 4 giai đoạn (Hình 1.4):

Hình 1.4 Vòng đời của muỗi

- Trứng (egg)

- Ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng) (larva)

- Nhộng (pupa)

- Muỗi trưởng thành (adult)

Muỗi sinh trưởng chủ yếu trong các đầm lầy, ao hồ hoặc các vũng nướcđọng Chúng đẻ trứng xuống nước, trứng nở thành ấu trùng gọi là bọ gậy hay

lăng quăng [39] Bọ gậy phải thường xuyên bơi lên mặt nước lấy oxy trongkhông khí thông qua một ống thở ở đuôi Bọ gậy thường ăn các vi sinh vật trongnước để sống Sau một thời gian chúng phát triển thành nhộng rồi biến tháithành muỗi trưởng thành bay lên khỏi mặt nước Muỗi cái có vòi đặc biệt có thểxuyên thủng da người và động vật để hút máu tạo ra nguồn protein sản sinh ratrứng.

Muỗi đực không có vòi để hút máu nên chỉ ăn nhựa cây và hoa quả Nhánhmuỗi Toxorhynchites không hút máu mà ăn thịt các muỗi khác

Muỗi cái xác định mục tiêu hút máu qua mùi vị và cảm nhận nhiệt, chúngđặc biệt nhạy cảm với CO2 trong hơi thở động vật và một số mùi trong mồ hôi.Một số người ví dụ nam giới béo và thuộc nhóm máu O hấp dẫn muỗi nhiềuhơn Muỗi cảm nhận được tia hồng ngoại phát ra từ người có thân nhiệt cao nên

dễ tìm được động vật và chim máu nóng

Nhiệt độ thích hợp cho muỗi sinh trưởng và phát triển là khoảng 20 đến

250C vì vậy chúng xuất hiện ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam Vòngđời của muỗi phụ thuộc vào loài và nhiệt độ, thay đổi từ vài ngày đến một tháng[39]

1.4.3 Khả năng gây bệnh của muỗi

Một số loài muỗi có khả năng là vật trung gian truyền bệnh giữa ngườivới người hay giữa động vật và người Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử

vong cao như Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho người, Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết, Culex tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bản, Mansonia annulifera truyền bệnh giun chỉ Brugia malayi, Culex quinquefasciatus truyền bệnh giun chỉ Wuchereria bancrofti… Ở Việt

Nam vào mùa hè và mùa mưa hàng năm sự phát triển của muỗi thường xuyêngây nên các dịch bệnh làm tử vong nhiều bệnh nhân Mùa hè năm 2004 có vàichục nghìn người Việt Nam bị nhiễm bệnh sốt xuất huyết trong đó có vài chục

ca tử vong Trên thế giới có khoảng hơn nữa tỷ người mắc bệnh sốt rét hàngnăm, tập chung ở Châu Phi với thủ phạm truyền bệnh là muỗi

1.4.4 Vòng đời và đặc điểm sinh học của một số giống muỗi điển hình

1.4.4.1 Muỗi Anopheles

Hình 1.5 Muỗi Anopheles trưởng thành

Anopheles là một giống muỗi thuộc họ Culicidae Có khoảng 400 loài Anopheles trong đó có khoảng 30-40 loài có thể truyền 4 loại ký sinh trùng khác nhau thuộc giống Plasmodium gây bệnh sốt rét cho người Anopheles sống chủ

yếu ở vùng nhiệt đới và mỗi năm nó truyền kí sinh trùng sốt rét cho ít nhấtkhoảng 300 triệu người và ít nhất 1 triệu người chết trên toàn thế giới

Giống như nhiều loài muỗi khác, Anopheles trải qua 4 giai đoạn phát triển

trong vòng đời của mình: trứng, ấu trùng (bọ gậy, lsăng quăng), nhộng, muỗitrưởng thành Ba giai đoạn đầu diễn ra trong môi trường nước trong vòng 5-14ngày phụ thuộc vào loài và nhiệt độ môi trường Muỗi cái trưởng thành là vectơtruyền bệnh sốt rét Muỗi cái có thể sống đến 1 tháng hoặc hơn (trong điều kiệnnuôi nhốt, nhưng không quá 1-2 tuần so với tự nhiên)

Muỗi Anopheles đa số đốt về đêm và thường bay vào nhà từ 5 giờ chiều

đến 9 giờ tối có thể sống được trên dưới 1 tháng ở nhiệt độ 20 oC đến 30oC Ởcác nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, quần thể muỗi phát triển quanh năm, vớinhững đỉnh cao vào đầu mùa mưa, trong mùa mưa và cuối mùa mưa (tùy loạimuỗi)

Các loài Anopheles ở Việt Nam: tính đến năm 1995 thì số loài Anopheles

ở Việt Nam lên tới 59 loài và được chia như sau [7]:

- Vectơ truyền bệnh chính: An minimus, An dirus, An sundaicus.

- Vectơ nghi ngờ truyền bệnh phụ: An subpictus, An jeyporiensis, An maculates, An aconitus, An inesis, An vagus, An indejinitus.

- Vectơ nghi ngờ truyền bệnh: An campestris, An culicifaciens, An baezai, An lesteri, An interruptus.

1.4.4.2 Muỗi Culex

Hình 1.6 Vòng đời của muỗi Culex

a Trứng muỗi Culex b Ấu trùng muỗi Culex

c Nhộng muỗi Culex d Muỗi Culex trưởng thành Culex là một giống muỗi với một số loài trong đó là vật chủ trung gian

truyền bệnh nguy hiểm như: Giun chỉ (filariasis), Viêm Não Nhật Bản (Japaneseencephalitis), virus sông Nin (West Nile virus), bệnh sốt rét gia cầm (avianmalaria)

Muỗi Culex có thể hút máu động vật, người và chim Chính vì thế những bệnh do Culex truyền thường khó dập vì cộng đồng vật bị muỗi hút máu trở

thành nguồn chứa mầm bệnh và có sự di chuyển rất rộng, dẫn đến lan truyềnbệnh ở một số vùng lớn

Vòng đời của giống muỗi Culex kéo dài khoảng 2 tuần và trải qua một số giai đoạn phát triển tương tự muỗi Anopheles Muỗi Culex đẻ trứng từng quả

riêng hoặc thành cụm tùy theo loài Trứng muỗi nổi trên mặt nước, trứng nởthành ấu trùng (gọi là bọ gậy) sau vài ngày.

Trong giai đoạn bọ gậy, ấu trùng muỗi sống trong nước và ăn chất hữu cơ

trong môi trường nước Nhiều loài ấu trùng Culex cũng ăn trong khi thở trên mặt

nước và chỉ rời khỏi mặt nước khi bị đe dọa Nhờ có ống thở dài hướng lên bềmặt nước giữ cho thân treo dưới mặt nước chếch góc 450 Vì vậy ấu trùng muỗi

Culex thường ăn dưới bề mặt nước một khoảng cách ngắn, khoảng cách này phụ

thuộc vào độ tuổi và kích thước của ấu trùng và góc mà thân tạo thành khi treodưới mặt nước và vào chiều dài của ống thở Bọ gậy phát triển thành nhộng(pupa)

Nhộng có hình dấu phẩy trong giai đoạn nhộng, ấu trùng muỗi không ănuống và nở thành muỗi trưởng thành sau 1 đến 2 ngày

Một số loài muỗi Culex chính:

Culex tritaeniorhynchus: trung gian truyền bệnh viêm não Nhật Bản là loài

muỗi có số lượng nhiều và chiếm tỷ lệ cao ở các vùng trồng lúa thuộc miền BắcViệt Nam, chúng thường hút máu vào ban đêm và thích hút máu súc vật hơn Bọgậy muỗi này sống ở nhiều loại thuỷ vực, nhiều nhất ở ruộng lúa, mương máng

và các hố vũng Trong năm, mật độ muỗi cao nhất vào các tháng 4, tháng 5 vàtháng 9

Culex quinquefasciatus: trung gian truyền bệnh giun chỉ phân bố rộng cả 3

vùng cảnh quan rừng núi, trung du và đồng bằng nước ta Số lượng tăng dần từnông thôn đến thành phố do bọ gậy của muỗi này rất thích hợp với các loại cốngrãnh chứa nước thải

Culex pipiens: Là muỗi phân bố rộng rãi nhất trên thế giới Nó được tìm

thấy trên khắp các lục địa, trừ Nam Cực và nó mang một số bệnh, đặc biệt làarboruses (virus động vật chân đốt truyền) [40] Chúng hay tấn công người vàđặc biệt là chim vì vậy rất khó khống chế bệnh

Trứng của Culex pipiens thường riêng lẻ hoặc xếp thành bè và có thể nổi

trên bề mặt, chúng có thể chìm nếu nước bị xáo trộn Ấu trùng của muỗi nàythích nước ô nhiễm và có thể phát triển trong cả bể phốt [40]

1.4.4.3 Muỗi Aedes

Là một giống muỗi thường gặp ở vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt, là vật chủtrung gian truyền các bệnh nguy hiểm như: sốt xuất huyết, sốt vàng da Chúngcòn được gọi là muỗi vằn do trên thân có những dải trắng đen

Hình 1.7 Muỗi Aedes trưởng thành

Vòng đời của muỗi Aedes là tương tự các giống muỗi khác và trải qua các

giai đoạn: Trứng -> bọ gậy -> nhộng -> muỗi trưởng thành

Ấu trùng của muỗi Aedes có ống thở ngắn, tiếp xúc với bề mặt nước nên giúp chúng cũng ăn được dưới bề mặt nước như ấu trùng muỗi Culex Ngoài ra chúng có thân dài hơn ấu trùng muỗi Culex và có khả năng uốn cong như hình chữ U nên nó có khả năng vừa ăn được trên mặt nước vừa thở như Anopheles Khác với ấu trùng muỗi Culex, ấu trùng muỗi Aedes thường treo thẳng thân

dưới bề mặt nước và các ấu trùng thường không xếp hàng đều như các ấu trùng

Culex.

Một số loại muỗi Aedes chính:

- Aedes aegypti: trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết có nguồn gốc Châu Phi Có hai dưới nhóm là Ae aegypti queenslandensis và Ae Aegypi forosus.

- Aedes albopictus: có nguồn gốc Châu Á, cư trú chủ yếu ở nông thôn, có

khả năng truyền bệnh cho trứng

1.4.5 Phòng chống muỗi [42].

Sử dụng các tác nhân sinh học: Các tác nhân sinh học phòng chống muỗi trong

môi trường sống của chúng là những kẻ thù tự nhiên, chẳng hạn như các sinh vậtgây hại hoặc động vật ăn thịt

- Cá hoặc lươn nhỏ trong bể nước để tiêu diệt bọ gậy

- Chuồn chuồn ngoài đồng ruộng Các ấu trùng chuồn chuồn trong nước ăn

bọ gậy, còn chuồn chuồn trưởng thành bắt muỗi trong không trung

- Các loài bò sát nhỏ như thạch sung, thằn lằn để ăn muỗi trong nhà

- Dơi bắt muỗi trong không trung.

Hiện nay, các nhà khoa học đang thử nghiệm với chủng muỗi đực bị mấtkhả năng sinh sản khi thả chúng vào tự nhiên Các con muỗi đực vô sinh sẽ cạnhtranh giao phối với muỗi cái bình thường làm giảm tỷ lệ sinh của muỗi

Phương pháp cải tạo môi trường: Mục đích chủ yếu là làm giảm hoặc phá bỏ

các ổ nước là nơi muỗi đẻ trứng, do đó sẽ làm giảm mật độ muỗi Đây là biệnpháp đơn giản, rẻ tiền nhưng nhiều khi mang lại hiệu quả cao Có thể thực hiệncác hình thức sau:

- Hủy bỏ nơi sinh sản: thu dọn và phá hủy các dụng cụ như lốp xe ô tô, mũsắt, các hộp kim loại, hộp nhựa… lấp đầy các ổ nước bằng đất, đá hoặctháo cạn nước trong các ổ nước

- Làm thay đổi tốc độ dòng chảy, thay đổi độ mặn của nước, vớt thực vậtthủy sinh trong các thủy vực làm cho môi trường trở nên không thuận lợicho sự phát triển của bọ gậy và lăng quăng

- Phát quang cây cối: vừa làm giảm nơi sinh sản của các loài thích đẻ trứngtrong các ổ nước có bóng râm, vừa phá bỏ nơi trú ẩn của muỗi trưởngthành

Phương pháp vật lý:

- Đèn bẫy muỗi: được chế tạo với một đèn phát ánh sáng hấp dẫn muỗi vàcôn trùng tụ tập đến, bao quanh bởi lưới kim loại có hiệu điện thế thấp.Khi muỗi và côn trùng sa vào lưới, dòng điện nhỏ sẽ phóng qua và tiêudiệt chúng Phương pháp này sử dụng được trong nhà và ngoài trời

- Vợt điện: được thiết kế như vợt bắt muỗi cầm tay, chỉ gồm lưới kim loại

có điện thế, chạy pin Vợt này có thể có ích trong nhà, nhưng không cótính hiệu quả cao

- Màn ngủ là phương pháp hiệu quả để phòng chống muỗi đốt khi ngủ

- Lưới cửa: là các lưới kim loại (hay nhựa) có lỗ nhỏ, không cho muỗi haycác loại côn trùng vượt qua và xâm nhập vào nhà ở, nhưng vẫn đảm bảotính thoáng khí và ánh sáng

- Sử dụng thuốc bôi lên da để xua muỗi khỏi da, tiện dụng khi đi du lịchđến vùng đất nhiều muỗi Chúng thường chứa các hóa chất sau: DEET,tinh dầu bạc hà Tinh dầu xả, hay tinh dầu khuynh diệp…

- Sử dụng hóa chất do Bộ Y tế khuyên dùng để tẩm màn và áp dụng quytrình kỹ thuật phun không gian, phun tồn lưu

 Tẩm màn: màn ngủ khi tẩm hóa chất có tác dụng nhanh, kích thích

hoặc giết muỗi khi tiếp xúc, ngăn không cho chúng tìm thấy các lỗ rách, thủng ởmàn Sử dụng màn ngủ tẩm hóa chất xua diệt côn trùng sẽ kéo dài thời gian vàtác dụng hiệu lực của màn ngủ

 Phun tồn lưu: phun trực tiếp hóa chất lên toàn bộ bề mặt tường

trong nhà, vách, rèm cửa, gầm bàn ghế, gầm giá chứa hàng, bồn cây, cống rãnh,khu vực xả rác, khu vực có đèn chiếu sáng ban đêm… nhằm diệt trừ và ngănchặn côn trùng xâm nhập thuốc có tác dụng tồn lưu lâu, có khả năng ngăn chặn

sự phát triển trở lại của côn trùng trong một thời gian dài sau khi phun

 Phun không gian: được áp dụng cho cả không gian bên trong và

khu vực khuôn viên bên ngoài Sử dụng phun máy phun ULV đưa dưới dạngsương mù vào trong không gian, các ngóc ngách, lên trần cao, các lùm cây, cốngrãnh nhằm tiêu diệt ngay các loài muỗi đang có mặt

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Sinh phẩm

2.1.1 Các chủng vi khuẩn Bacillus thurigiensis

Các chủng B thuringiensis phân lập từ đất rừng ngập mặn thuộc huyện

Thái Thụy - Thái Bình (Hình 2.1) do phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Hàn

Hình 2.1 Sơ đồ rừng ngập mặn huyện Thái Thụy – Thái Bình

2.1.2 Các chủng ấu trùng muỗi

Ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus do phòng Di truyền Vi sinh vật,

Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.2 Hóa chất

- Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy: Agar (Việt Nam), cao thịt(Đức), peptone (Đức),…

- Hóa chất dùng nhuộm bào tử và tinh thể

- Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTP, Taq, Buffer, Nước khử

ion…

- Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris-base, TAE…

- Các cặp mồi có trình tự như sau :

Cặp

mồi

thước (bp)

cry4BF 5’ CGCTTTCAGACCTAATAATATAATAC 3’ cry4B 321cry4BR 5’ CGG CTT GAT CTA TGT CAT AAT CTG 3’ cry4B 321

Rừng ngập mặn

2.2.1 Các dung dịch