Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử
Trang 1
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
~~= đb»s@ LL oh -
LE THI KIM NGAN
GOP PHAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẢN HOÁ HỌC
vA MOT SO TAC DUNG SINH HOC CUA VI THUOC
ThS DO THI NGUYET QUE
BỘ MÔN DƯỢC HỌC CÔ TRUYÊN
BỘ MÔN DƯỢC LỰC TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
1/2009 — 5/2009
Trang 2
Lol Cam on
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của
bản thân, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình về kiến thức, tỉnh thân va co
sở vật chất của bộ môn Dược học cổ truyền & một số bộ môn khác trong
trường Đại học Dược Hà Nội Nhân dịp này, em xin phép được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến :
PGS 1S Vũ Văn Điền - giảng viên bộ môn Dược học cổ truyen,
Ths Dé Thi Nguyét Qué - giảng viên bộ môn Dược lực— là người đã trực
tiếp hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện giúp đỡ & đóng góp cho em những lời khuyên và kinh nghiệm quý báu
Ths Nguyễn Quốc Huy - giảng viên bộ môn Thực vật - đã giúp đỡ
em thực hiện phan vi hoc
Các thây cô giáo, các cán bộ KTV ở bộ môn Duge hoc cé truyén &
bộ môn Thực vật cùng toàn thể các Thây cô giáo trong trường đã truyền đạt
cho em những kiến thức quý giá
Em xin chán thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong suốt thời gian qua đề em có thể hoàn thành
khóa luận này
Hà Nội, tháng 5 năm 2009
Sinh viên
Lê Thị Kim Ngân.
Trang 3ĐT VÀN ĐẼ., ecniabiibiisaaresausssridiidnsaasasanBelssstee 1
PHAN 1, T ÔNG DÁN .ẳtetqntadonaeerasse 2
11,ĐẶC ĐIÊẾM THƯC VẶT Lúa k ngu dang 2
LL1LEEHER GHI HE VĂY ko cccseccocaeisenaassosetiiaettayatasgpaai 2
113 Đhầu Bồ di LẪT váaeeeeeeaaaaadaaoieiebiiossesxesbkaeasasagasa 3
LAF: BO DRG GRRE: vo scccrsunewaysseccscsuvssciservevaserevencqecemsaccveneneness 4
Lẻ tực đc GẦN GIG ss toss tcxvessonessteceerip erste omen veevaeceos 4
1S SAC DONG GIN TO eeeeedeiieeeoseeeeeeee 6
lã 1C Ea eeeeeeeeavararovaardrrtrgoarroidreraareesse 7 l3 GIẨ sac sa ctaccgbandtbotittocecaevrenuobsngrpyege0p0aoxgaug 9
DE TING ects siercasansseevrcoxacunsansnuomacioumentatontensacomacanns 9 PHAN 2 THUC NGHIEM VÀ KẾT QUÁ 10 2.1 NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 10
24 7, Wisi UN cs cases inscicsniuasianstuvcsuvecmaissnsicienianeieamnism 10
Rh De PAM PRED UGNIER CEB os os vicssesiscssuracsvcsiverscvendowcieecesssvave 11
2.2 KÉT QUÁ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT - - 13
2.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học - 5c cc Sss<ss<sse2 35
"E4 TỐ ằẶằẶằ-ằẰ ẴẶằẴằẽẰằẽằẽằẰẮ {ẽ5ẽằẽằẽẽs= 37
Trang 4DANH MUC BANG SO LIEU & HÌNH ANH
5_ | Tóm tắt các nhóm chất hữu cơ trong 4 cắn 31
6 | Định tính cắn C theo hướng alcaloid bằn SKLM 32
7 | Định tính cắn C theo hướng flavonoid bằng SKLM 34
8 | Sự biến đổi glucose huyết theo thời gian trên chuột thí nghiệm | 35
HÌNH ẢNH
1 | Hoa & la Lycium chinense Mill
2 | Qua Lycium chinense Mill
8 | So đồ chiết xuất 4 phân đoạn Câu kỷ tử 18
| 10 | Sắc kí đồ của cắn C ở bước sóng 366 nm 34
| 11 | Sắc kí đồ của cắn C ở bước sóng 254 nm 34
Trang 5
DANH MUC CHU VIET TAT
Trang 6
DAT VAN DE Trong Y học cỗ truyền (Đông y) Câu kỷ tử là vị thuốc được dùng khá
phô biến (đầu vị) ở Việt Nam, Trung Quốc và nhiều nước trên thế giới, nó có tác dụng bổ can thận, ích tinh tuỷ, bỗ phế, chữa suy nhược cơ thể Ở Việt
Nam vị thuốc này vẫn phải nhập từ Trung Quốc là chủ yếu Đã có rất nhiều
nghiên cứu chứng minh được nhiều công dụng mà y học cổ truyền đã dùng &
bổ sung những tác dụng mới
Đái tháo đường là một bệnh rối loạn chuyển hoá đang gia tăng theo sự nâng cao mức sống Hiện nay đây cũng là một bệnh khá phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là Đái tháo đường týp II Việc nghiên cứu tìm thêm thuốc điều trị từ thảo dược là rất cần thiết Vì bệnh Tiểu đường týp II thường phải dùng thuốc
thường xuyên, kéo dài & nếu dùng thuốc tây y thường tác dụng giảm nhanh
nhưng nếu dùng kéo dài thì có những tác dụng bất lợi Vị thuốc Câu kỷ tử là
một trong những vị thuốc mà đông y sử dụng để điều trị bệnh Đái tháo đường
Để góp phần đánh giá đúng khả năng của vị thuốc này, tìm hiểu phân đoạn nào, thành phần nào có tác dụng chính, vì vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh
học của vị thuốc Câu kỷ tử” với các nội dung sau:
> Chiết tách, định lượng cắn các phân đoạn bằng các dung môi có độ
phân cực khác nhau
> Định tính một số nhóm chất trong bột dược liệu & các phân đoạn
> Thử tác dụng hạ glucose huyết của cắn trong các phân đoạn
Trang 7PHAN 1 TONG QUAN
1.1 DAC DIEM THUC VAT
Tén khoa hoc : Lycium chinense Mill
Tén Viét Nam : Câu kỷ tử, củ khởi, rau khởi, khủ khởi, khởi tử,
địa cốt bì, phjăc khau khi (Tay)
Tên nước ngoài : Chinenese box — thorn, Chinense desert thorn,
Chinense wolfberry, Chinense matrimony vine (Anh), Lyciet (Phap)
Ở Trung Quốc ngoài dùng Cau ky tir loai Lycium chinense con ding Câu kỷ
tử thuộc loài Lycium barbarum vGi tén Ninh ha Cau kỷ với tác dụng công dung nhu nhau [8], [18], [38]
1.1.1 Hình thái thực vật [3], [7], [11], [16], [18], [20], [21], [22],
s* Câu kỷ là 1 loại cây nhỏ, cao 0.5-lm, mọc đứng thành bụi sum suê, phân
cành nhiều Cành cứng, nhỏ, uốn cong cần câu & ngã xuống có thể dài
đến 4m, đôi khi có gai ngắn ở kẽ lá, màu xám vàng, dài 5cm
s* Lá nguyên, mọc so le hoặc tụ tập 4-5 cái, hình mũi mác, hẹp dần ở gốc,
đầu tù hoặc nhọn, mép uốn lượn, hai mặt nhẫn, mặt trên màu lục sẫm
bóng, mặt dưới nhạt, cuống lá ngắn chỉ 2-6 mm
* Hoa nhỏ, mọc đơn độc hoặc một số hoa mọc tụ lại ở kẻ lá, cánh hoa màu
tím nhạt hoặc tím đỏ, đài nhẫn hình chuông có 3-6 thùy Tràng hình
phéu, 5 cánh, có lông ở mép Nhị 5 đính ở ống tràng
s* Quả mọng, hình trứng dài 0.5-1.5cm, đường kính 4-Smm [20], khi chin
mau d6 sam hoặc vang do Hat nhiéu, hinh than det, dai 2-2.5mm [21],
[18], [20]
“* Mua hoa: Thang 6 — 10 Mia qua: Thang 7-10 [21], [22]
Trang 8
HI Hoa & lá Lyciwm chinense Mill — H2 Quả Lycium chỉinense MIII
Nguôn ảnh:
Hình 1: www.webtretho.com/forum/showthread.php?t=221221 Hinh 2: http://ecocrop.fao.org/ecocrop/srv/en/crop View?id=7444
1.1.2 Phan bé sinh thai [9], [18], [21], [22]
% Chi Lycium L cé khoang 100 loai trên thế giới, phân bố rải rác khắp các
vùng nhiệt đới và á nhiệt đới ở châu Mỹ châu Phi & châu Á Có 2 loài câu
kỷ đáng chú ý là:
>» Cau ky qua do: (Lycium chinense Mill.) & loai Lycium barbarum cé
nguồn gốc từ vùng Tây á, mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc,
Nhật Bản, Triều Tiên, Malaysia, Indonesia
> Câu kỷ quả đen (L.ruthenicum Murray) cũng có nguồn gốc ở vùng Tây
á hoặc Nam á Cây được trồng ở Ân Độ, Malaysia và một số nơi khác
%Ở Việt Nam hiện nay cé ca 2 loai L.chinense & L.ruthenicum nhưng
không rõ được nhập từ bao giờ Cây trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng), Hà Nội
& một số nơi khác nhưng chỉ dùng làm rau ăn Từ năm 1996, Trạm Nghiên Cứu Dược Liệu Thanh Hóa đã nghiên cứu trồng loài Lycium chinense Mill thành công và hàng năm đều thu hoạch được nhiều quả
* Nhìn chung cả 2 loài Câu kỷ trên đều là cây ưa sáng & ưa ẩm Cây sinh
trưởng tốt trong vụ xuân — hè, có hoa quả vào cuối mùa hè đến đầu mùa
thu Về mùa đông có hiện tượng rụng lá Đối với loài Câu kỷ quả đỏ,
Trang 9muốn có hoa quả, không được thu hoạch ngọn và lá làm rau Câu kỷ có
khả năng tái sinh chồi sau khi chặt Từng đoạn thân, cành đem vùi xuống
đất cũng có khả năng tái sinh
1.1.3 BO phan ding [21]
> Qua chín phơi khô của cây Câu kỷ Quả được thu hái sau khi chuyển sang màu đỏ da cam Sau khi đem phơi âm can để vỏ quả se lại thi dem phơi nắng cho đến khi vỏ quả khô lại và cứng, còn ruột thì vẫn xốp
> Vỏ rễ phơi hay sấy khô (Địa cốt bì)
> Vỏ hạt gồm một lớp tế bào mô cứng hình chữ nhật ở phía ngoài, phía
trong là một vài hàng tế bào bị ép, dẹt Tế bào nội nhũ hình đa giác,
trong có giọt dầu Rễ mầm được cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác
Mô mềm lá mầm không rõ rệt
s* ,Soi bội
Câu kỷ tử (CKT): Tế bào vỏ quả hình đa giác hoặc hình chữ nhật, to
nhỏ không đều Mảnh mạch xoắn Tế bào vỏ hạt có vách nhấp nhô Mảnh tế bào nội nhũ Các giọt dầu màu vàng cam
1.2 THÀNH PHÀN HÓA HỌC
s* Quả Câu kỷ chứa tỉnh dầu trong đó 36 thành phần trung tính đã được nhận dạng bằng sắc ký khí liên hợp với phổ khối Hai secquiterpen được nhận dang 14 dehydro -a - cyperon va solavection Methyl linoleate chiếm tỷ lệ
Trang 10cao (18%) trong phân đoạn trung tính Các ester của các acid béo Ca, C¡¿
và C¡s cũng có với tỷ lệ cao Quả có betain 0.09% [9], zeaxanthin, physalien [21]
> Qua con cd 3 mg% acid ascorbic, 1.7 mg% acid nicotianic, atropin
[18], lysin, cholin, 3.96 mg% caroten, 150 mg% Ca, 6-7 mg% P, 3.4 mg% Fe, 0.23 mg% amoni sulfat [10], [22]
> Quả chứa chất béo 2.2%, protein 4.6%, acid cyanhydric và có thể có atropin [11], 18]
* Hai chất còn được chiết tách từ quả và nhận dạng là B-Sitosterol va Acid
melissic
B-Sitosterol
s* Hạt chứa nhiéu Sterol: 4,4- dimethylsterol, cycloartanol, cycloartenol,
24 — methylencycloartenol (cac chat này chiếm tỷ lệ cao) Một số dẫn chất của lanosterol (các dẫn chất này chiếm tỷ lệ thấp) Trong số các sterol này
Trang 11có gramisterol (44%), citrostadienol (18%), lophenol (9%), cycloeucalenol (8%), nor- cycloartenol (6%), obtusifoliol (6% )
Cycloartenol s* Theo A.Y.Leung và cộng sự (1966), quả chứa §-10% acid amin trong đó chừng l nửa ở dạng tự do: acid aspartic 1.2%, Prolin 0.65%, Acid
glutamic 0.63%, Alanin 0.37%, Arginin 0.19%, Serin 0.14% va 9 acid
amin khac [21]
s* Vỏ cây cũng chứa j-Sitosterol và Acid melissic Ngoài ra, còn có Acid linoleic, 5 @ - stigmastan-3,6-dion, sugiol [21]
s* Vỏ rễ chứa :
> Betain, acid malissic, sugiol [9]
> 0.08% alcaloid, 1.07% saponin, 1 alcaloid gọi là kukoamin và một dipeptid gọi là lyciumamid (N-benzoyl-L-phenylalanyl-L- phenylalaninol acetat) [21], [22]
*%*Lá chứa Betain, lyciumwithanolid A và B, tinh dau trong đó
hydroxydehydro-J-ionol [21] Va protein 3.5%, lipid 0.72%, glucid 2.25%,
tro 1.37%, rat giau vitamin A [22]
s* Câu kỷ còn được cho là có scopoletin, acid vanilic [2I]
1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC
Các bộ phận của cây Câu kỷ thường được sử dụng trong điều trị như:
quả, vỏ rễ & lá Nhưng trong phạm vi nội dung của bài khóa luận này chỉ tập
trung vào các tác dụng (TD) của Câu kỷ tử
Trang 121.3.1 Câu kỷ tử
* Tác dụng tăng cường miễn dịch [21]
> Nước sắc Câu kỷ tử 50% với liều 2.5g/kg/ngày, dùng bằng đường uống trong 3 ngày liên tiếp, làm tăng cường khả năng thực bào của đại thực
bào trong xoang bụng chuột nhắt, đồng thời tăng cường hoạt động của
men lysozym trong huyết thanh và nâng cao hiệu quả kháng thể kháng
hồng cầu cừu của huyết thanh & tăng số lượng tế bào có kháng thể hình thành trong tô chức lách
> Quan sát (QS) trên lâm sàng ở những người già mà chức năng miễn dịch
giảm, dùng dạng chiết từ Câu kỷ tử hoặc ăn quả Câu kỷ tử tươi thì hệ
thống miễn dịch đã bị giảm của họ được điều chỉnh, tỷ lệ chuyển hóa của nguyên bạch câu (leukocytoblast), globulin miễn dịch trong huyết
thanh như IgG, IgA và IgM đều tăng
s* Tác dụng hạ Cholesterol huyết, đường huyết & bảo vệ gan
> Dạng chiết nước từ Câu kỷ tử dùng cho chuột cống trắng và thỏ có tác
dụng làm giảm cholesterol & có tác dụng bảo vệ gan Nuôi chuột dài
ngày (75 ngày) bằng thức ăn có trộn dạng chiết từ Câu kỷ tử (0.5% và 1%) hoặc betain (0.1%) có tác dụng bảo vệ gan, chống lại những tổn
thương do tetraclorua- cacbon gây nên [21]
> Dẫn chất pyrrole có tác dụng bảo vệ gan so với sylibin ở nồng độ 0.]
> Cerebroside trong Lycium chinense có tắc dụng bảo vệ các tế bào gan
của chuột nuôi cấy khi bị gây độc bằng galactomine [30]
Trang 13> Trên lâm sàng, những người già trên 60 tuổi uống dạng chiết từ Câu kỷ
tử với liều 100mg liên tục trong 4 tuần lễ thì cholesterol huyết, -
lipoprotein & triglycerid đều giảm [21]
* Tác dụng chống lão hoá [S]
> Dạng chiết nước từ Câu kỷ tử cho vào thức ăn của ruồi giấm (2%), làm
cho sức ăn của ruồi giấm tăng 47% & ức chế sự tích lũy fuscin của ruồi
> Người già mỗi ngày dùng 5g quả câu kỷ trong 10 ngày liên tiếp thì hoạt
độ của men superoxid dismutase (SOD) tăng 48%, hemoglobin tăng 12% & lipid peroxyd giảm 65%
%* Tác dụng dối với hệ thống máu [21]
> Nước sắc Câu kỷ tử (10%) dùng cho chuột nhắt trắng với liều 0,5ml/kg
chuột liên tục trong 10 ngày làm tăng lượng bạch cầu Dạng đông khô Câu kỷ tử có tác dụng ngăn ngừa hiện tượng giảm bạch cầu do cyclophosphamid gây nên trong điều trị ung thư thực nghiệm trên chuột
cống trắng
> Người bình thường hoặc bệnh nhân ung thư ăn quả khô câu kỷ 5g/ngày
liên tục thì số lượng bạch cầu tăng lên rõ rệt
s* Các tác dụng khác
> Betain làm tăng trọng gà nuôi thịt so với lô đối chứng, và làm tăng lượng trứng đẻ ở gà mẹ Dịch chiết Câu kỷ tử tác dụng trực tiếp lên tuyến yên của chuột cống trắng kích thích rụng trứng [21]
> Betain có thể tăng giải phóng mucin & tác dụng này cần được nghiên
cứu tiếp để có thê được dùng như là những thuốc long đờm trong điều trị các bệnh đường hô hấp cấp & mãn tính [31]
> Dịch chiết MeOH & dịch chiết nước (DCN) của Câu kỷ tử có tác dụng
chống xốp xương [35].
Trang 14> Dịch chiết MeOH của Eyeiwm chinense ức chế hoạt tính & chọn lọc đối với monoamine oxidase B (MAO-B) có các giá trị IC50 là 0.44, 0.29,
0.40 Vì vậy nó có thể làm chậm trễ tiến trình thoái hóa gây ra do các
> Độc tính: Nước sắc địa cốt bì trên chuột nhắt trắng dùng qua đường dạ
dày với liều 262,6g/kg súc vật vẫn không chết
1.3.3 Lá : Thường được dùng làm rau ăn
1.4 CÔNG DỤNG
s* Tính vi, cong nang [21]
> Tinh vi : Vi ngot, tinh binh
> Quy kinh =: Can, than
> Công năng : Dưỡng can, minh mục, bé than, ich tinh, nhuận phé
* Công dụng: Câu kỷ tử được coi là vị thuốc bỗ toàn thân dùng cho cơ thể
suy nhược, lưng gối mỏi đau, hoa mắt, thị lực giảm, di tinh, đái đường
Trang 15PHAN 2 THUC NGHIEM VA KET QUA
2.1 NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
Bộ bình chiết Soxlech, máy cất quay Buchi (Thuy Sÿ)
Tủ sấy Memmeret (Đức), cân xác định độ 4m Precisa XM-120, cân phân tích
Máy đo đường huyết Sure Step cùng kít thử tương ứng, nhà sản xuất
Lifescan, Inc, Milpitas, USA
Đèn tir ngoai, may anh Canon IXY digital
Bép dun cach thuy, tủ lạnh
Kinh hién vi Leica (Birc), lam kinh, phién kinh, dao tem,
> Héa chit
Các dung môi được mua tại thị trường Hà Nội đạt tiêu chuẩn phân tích
Streptozotocin bét pha tiém (STZ) cia hang MP Biomedicals, LCC, Phap
Các thuốc thử: Mayer, Diazo, Dragendoff, Ninhydrin, FeCl; 5%,
Ban mong silicagen GF 254 (Merk)
> Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss có trọng lượng từ 16-18 g, cả 2 giống,
đạt tiêu chuẩn thí nghiệm được mua từ Viện vệ sinh & Dịch tễ TW
10
Trang 16"Chuột sau khi được mua về nuôi 3-5 ngày trước khi làm thí nghiệm tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lý-Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuột được cho ăn thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp và
được cho uống nước đun sôi để nguội
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1 Kiếm tra tính đúng của dược liệu
s* Vi Cau ky tử được mua tại công ty dược liệu (DL) Mediplantex, nhập từ
Trung Quốc Do đó không thể xác định rõ được tên khoa học & tính
đúng của vị thuốc Vì vậy chúng tôi phải dựa vào DĐVN II & Dược
điển Trung Quốc (2005) để xác định
s* Mô tả đặc điểm bên ngoài của được liệu bằng quan sát trực tiếp với mắt
thường & kính lúp để đối chiếu với đặc điểm được mô tả trong được
điển
* Dược liệu được nghiền (tán) thành bột mịn, soi dưới kính hiển vi và xác
định các đặc điểm của bột dược liệu theo tài liệu [8]
* Ngâm dược liệu trong cồn 50°, cắt & nhuộm bằng phương pháp nhuộm
kép theo [4] Sau đó xác định các đặc điểm vi phẫu của dược liệu [8]
2.1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học
s* Chiết xuất dược liệu bằng MeOH, sau đó chiết phân đoạn bằng các dung
môi có độ phân cực tăng dân Tiến hành định lượng cắn trong các phân
đoạn bằng phương pháp cân
s* Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu & cắn của các phân
đoạn bằng phản ứng hóa học
s* Định tính một số nhóm chất trong cắn các phân đoạn bằng SKLM
Phần nghiên cứu về hoá học tiến hành theo các phương pháp hoá thực vật thường qui ghi trong các tài liệu [2], [3], [14]
2.1.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học
ll
Trang 17Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết (GH) của Câu kỷ tử
+ +9 Phương pháp: Gây tăng glucose huyết bằng STZ (theo phương pháp của
Hsu (1997) & CT Nityanand (1984) ) [28]
> Nguyên tắc: STZ gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào B của đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển GLUT2, bẻ gãy sợi ADN, ức chế sự sao chép ADN, ức chế sự nhân lên của tế bào, đần dần dẫn đến hủy hoại tế
bào đảo tụy và gây ra tình trạng ĐTĐ trên động vật thực nghiệm STZ
đã được nhiều nhà khoa học sử dụng để làm tác nhân gây ĐTĐ thực
nghiệm trên động vật
> Chuột nhắt trắng được nuôi ôn định trong phòng thí nghiệm, sau đó gây
tăng GH bằng cách tiêm màng bụng STZ một liều duy nhất là
I50mg/kg Định lượng GH của chuột trước và sau khi tiêm 72h (3 ngày sau), lựa chọn những con có GH tăng cao trên 10mmol/1 để tiến hành thi
nghiệm Cho uống thuốc thử (TT), đến ngày thứ 5, định lượng GH GH
được đo bằng máy đo GH Sure Step kèm theo kít thử tương ứng
> So sánh nồng độ glucose huyết trước & sau khi uống thuốc thử giữa các
lô thử thuốc & lô chứng
> Công thức tính độ giảm glucose huyết :
Di tenth <= « am Ọ giam ( 0) — Ctr X
Trong đó :
“Cụ: Nồng độ GH trước khi uống thuốc hoặc dung môi pha thuốc
= C;: Nồng độ GH sau khi uống thuốc hoặc dung môi pha thuốc
“> Xử by số liệu:
“Số liệu được xử ký bằng phương pháp thống kê sinh học test T-student,
sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003 Với độ tin cậy 95%, sự khác
12
Trang 18biệt có ý nghĩa thống kê nếu P < 0.05 và không có ý nghĩa thống kê nếu
P > 0.05 [23]
= Két qua (KQ) thi nghiém dugc biéu thi bằng trị số trung bình cộng / trừ sai sé chuan (M + SE)
2.2 KET QUA THUC NGHIEM VA NHAN XET
2.2.1 KIEM TRA TINH DUNG CUA DUOC LIEU
2.2.1.1 Đặc điểm dược liệu
s* Quả hình trứng dài hay trái xoan, hai đầu hơi lõm, dài 1-2cm, đường
kính 5-7 mm, mặt ngoài đỏ sẫm đến đỏ xám, mềm, bóng, thường nhăn
nheo Gốc quả có vết cuống quả màu trắng còn sót lại, đỉnh quả có điểm nhỏ hơi nhô lên
% Quả có nhiều hạt nhỏ hình thận dẹt, hai mặt hơi căng phông lên hoặc có
| mặt lõm Hạt màu vàng nâu có nội nhũ, rốn hạt là một điểm nhỏ ở mép hạt
Trang 19Mặt cắt ngang vỏ quả nhìn từ ngoài vào trong gồm các đặc điểm:
s* Vỏ quả ngoài gồm một lớp tế bào dài, vách hơi dày, bên ngoài có lớp
cutin
Vỏ quả giữa có khoảng một chục lớp tế bào to nhỏ không đều, trong có
các tinh thé calci oxalat đạng cát và các bó libe - gỗ sắp xếp không theo
thứ tự nhất định
% Vỏ quả trong gồm một lớp tế bào hình tròn hay hình trứng tạo thành
lớp tế bào hơi nhấp nhô (Hình 5)
Hình 5 Vi phẫu vỏ Câu kỷ tử
s» Chú thích:
>» 1: Vỏ quả ngoài
Trang 20
2.2.1.3 Đặc điểm bột dược liệu
Bột dược liệu có màu đỏ cam, có vị ngọt, hơi chua Gồm các thành phần sau:
s Tế bào vỏ quả hình đa giác hoặc hình chữ nhật, to nhỏ không đều
s* Mảnh mạch xoắn
s* Tế bào vỏ hạt có vách nhấp nhô
% Mảnh tế bào nội nhũ
s* Các giọt dầu màu vàng cam (Hình 7)
Hình 7 Một số đặc điểm soi bột Câu kỷ tử
Trang 21Sau khi kiểm tra đặc điểm được liệu, vi phẫu, soi bột được liệu, thấy
các đặc điểm giống với các đặc điểm được mô tả trong DĐVN III Vì vậy chúng tôi cho rằng mẫu nghiên cứu chính là mẫu đã được ghi trong DĐVN III
với tên khoa học là Lycium chinense Mill
2.2.2 NGHIÊN CUU VE HOA HOC
2.2.2.1 Chiết tách, định lượng cắn các phân đoạn của bột Câu kỷ tử
s* Bột được liệu xay thô, cân một lượng chính xác, gói bằng giấy lọc, đặt vào bình chiết soxchlet, chiết bằng MeOH Thu hồi dịch chiết MeOH dưới áp
suất giảm cho tới cao lỏng
s* Hòa tan cao lỏng trong nước nóng, được dịch chiết nước Đem dịch chiết
nước lắc lần lượt với với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan,
CHC]:, EtOAc, n-BuOH, thu được dịch chiết 4 phân đoạn, cất thu hồi dung môi thu được cắn, kí hiệu la: A, B, C, D tương ứng
s* Quá trình chiết xuất 4 phân đoạn Câu kỷ tử được tóm tắt ở sơ đồ hình 8
KL 2050 24t ( 17
Trang 22`
Dc n- hexan Dc CHC]; Dc EtOAc Dc n-BuOH
n-hexan | CHCl; || | EtOAc n-BuOH L_
18
Trang 23% Cắn thu được của các phân đoạn đem sấy ở 50°C đến khối lượng không
đổi Cân cắn & tính hàm lượng các chất trong các phân đoạn theo công
| > m : Khối lượng dược liệu cần định lượng (g)
> h : Độ âm dược liệu (%)
| 4+ Tiến hành định lượng 5 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả được tóm
| Bảng 1 Hàm lượng cắn trong các phân đoạn chiết
lượng | am
iz DL | DL | (g) | (%)| (g) |(Œ42)| (œ) |(@%2)| () |@®2 (g) | (%)
1} 150 | 7.51 | 4.74 | 3.42] 2.48 | 1.79] 2.45 |1.77| 9.47 | 6.83 2| 150 | 7.63 | 4.57 | 3.30] 2.82 | 2.04] 3.11 | 2.25] 10.53 | 7.60
3 | 250 | 6.91 | 7.19 | 3,09| 3.50 | 1.50 | 3.70 | 1.59 | 16.26 | 6.99 4| 250 | 7.32 | 8.01 |3,46 | 3.53 | 1.52 | 4.88 | 2.11] 17.34 | 7.48
5 | 580 | 6.87 | 16.52 | 3,06] 7.90 | 1.46 | 9.66 | 1.79 | 38.42 | 7.11
TB 3.23 + 0.09 | 1.63 + 0.14 | 1.93 + 0.15 | 7.30 + 0.15
s* Nhận xét: Sau 5 lần định lượng, thây hàm lượng căn D là nhiêu nhất, có
thể là vì n- BuOH có độ phân cực lớn, do vậy hòa tan được nhiều chất hơn so với các phân đoạn còn lại Hàm lượng cắn A cũng tương
đối nhiều so với 2 cắn B & C
19
Trang 24
2.2.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
A Định tính các nhóm chất hữu cơ trong bột dược liệu
s* Câu kỷ tử đem sấy khô, xay thành bột thô để định tính
` Lấy 40g bột dược liệu chiết với 100ml cồn 909, lọc qua giấy lọc hoặc
bông, thu được dịch chiết cồn (DCC) để làm các phản ứng định tính
* Lấy 40g bột được liệu chiết nóng với 100ml nước (đun trên bếp cách
thủy), lọc qua bông thu được DCN để làm các phản ứng định tính
A.I Định tính alcaloid
* Lấy khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 50ml,
thêm 10ml dd H;ạSO¿ 1N, đun đến sôi, để nguội Lọc vào l1 bình gạn,
kiềm hóa dịch lọc bằng dd NHạ đặc (6N), sau đó cho vào bình gạn, lắc với CHCI; 3 lần, mỗi lần 10ml Gộp hết dịch chiết CHCI; bốc hơi đến khô, thu được cắn alcaloid base, hòa tan cắn bằng 10 ml H;SO¿ IN,
chia vào 3 ống nghiệm đẻ làm các phản ứng sau:
> Ông 1: Thêm 1-2 giọt TT Mayer, xuất hiện tủa vàng nhạt (phản ứng dương tính)
> Ong 2: Thêm 1-2 giọt TT Bouchardat, xuất hiện tủa nâu.( phản ứng dương tính)
> Ong 3: Thém 1-2 giọt TT Dragendorff, xuất hiện tủa đỏ cam (phản ứng dương tính)
s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có chứa alcaloid
A.2 Dinh tinh flavonoid
s* Phản ứng Cyanidin: Cho 2ml DCC vào 1 ống nghiệm, thêm 1 ít bột Mg kim loại Nhỏ từ từ vài giọt HCI đậm đặc, lắc nhẹ, đun cách thủy 5°
QS: DD chuyển sang màu đỏ cam (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lan, KQ tuong tu
20
