Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương

Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương

PHUNG THI HONG NHAM

NGHIEN CUU CHIET TACH

VA CAC DAC TINH CUA UREASE

TU HAT DAU TUONG

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2011

1 Bộ môn Hóa sinh

2 Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2011

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy giáo, TS

Nguyễn Văn Rư, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá

trình thực hiện luận văn này, cho em những lời khuyên quí báu để em có thể hoàn thành tôt nhât khóa luận của mình

Em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh, khuyến khích động viên em trong quá trình nghiên cứu học tập

Em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong

bộ môn Hóa sinh đã luôn giúp đỡ, dìu dắt, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành luận

Phùng Thị Hồng Nhâm

1.1 TOng quan VỀ IIF.€ - - 2 - 2E ® SE SE E£EE+EEEEE£EEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrererrke 10

1.2.5 Ứng dung ctia urease trong y-durde c.ccccccccccccssvessesssvssessssessssssesssssssssssessssssseesees 18 1.3 Phương pháp chiét tach va tinh ché enZyM u c.ccccsccscscssesescsssscssessesseessesesseseens 19 1.3.1 Đặc điểm của enzym thực vật vận dụng trong chiết tách và tỉnh chế 19

1.3.2 ChiẾt tdch €ILXJHH - 5 ST TH TH HH TH TH HH1 rệt 19

CHƯƠNG 2: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị - ¿- ¿2 2113 SE EE E111 1111011113111 23

" (71771 1ã nố.ố ố 23

Dụng cụ máy móc tại bộ môn Hóa sinh và bộ môn công nghiệp Dược trường đại học

2.3 Phương pháp nghiên CỨU - - - c2 S339 9 0 ng ng ng ng và 24

Vu j6, 00) 80 8nố e e 25

2.3.6 Phương pháp xác định một số đặc điểm của chế phẩm wrease 32

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN

3.1.1 Phương pháp thu dịch chiết hạt đậu tW0ng - các cecscererkererkrrrrerree 34 3.1.2 Phương pháp diêm tích tạo chế phẩm thô AAl 5-5555 cccesrerkersrerree 34 3.1.3 Phương pháp đông khô A1 tạo sản phẩm đông khô A2 - 34 3.1.4 Phương pháp tỉnh chế tiếp chế phẩm A2 tạo được chế phẩm BT 35 3.1.5 Phương pháp đông khô B1 tạo sản phẩm đông khô B2 36

3.2.1 Xây dựng đường chuẩn nông độ protein-mật độ quang -. 39 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn nông độ ure-mật độ quang, o5ccccsccccee 40 3.2.3 Kết quả xác định hàm lượng protein và HđE của các chế phẩm 42 3.2.4 Xác định một số đặc điểm của chế phẩm wurease ( B2) cccsce+eeesrse 53 6N 0 na 54 3.3.1 VỀ chiết tách, tinh chế urease từ hạt đậu fØ0ïig: . 5-55 ccscccesrsreecee 54 3.3.2 Về lựa chọn phương pháp xác định hoạt độ của ureas€: c5: 55 3.3.3 Vé dic tinh cia ché phém urease tinh chế (B22) -5-sccsrsrerersrereeesree 55

2 mm nẽố ố ố 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

GMO (Genetically modified organism): sinh vật biến đối di truyền

SNCR (Selective Non Catalytic Reduction): sy khu khéng xtc tac chon loc SCR (Selective Catalytic Reduction): sự khử xúc tác chon loc

BUN (Blood Ure Nitrogen): Nitro ure mau

DAM : Diacetyl monoxime

TSC : Thiosemicarbazide

Bảng 3.1 Hàm lượng protein và HđE của dịch chiết hạt đậu tương tươi

Bảng 3.2 Hàm lượng protein và HđE qua phan đoạn (NH¿)zSO¿ 25% bão hòa

Bảng 3.3 Hàm lượng protein và HđE qua phan đoạn (NH¿)zSO¿ 55% bão hòa

Bảng 3.4 Hàm lượng protein và HđE qua phân đoạn đông khô sau (NH¿);SO¿ 55%

bão hòa

Bảng 3.5 Hàm lượng protein và HđE sau phân đoạn lọc gel

Bảng 3.6.Hàm lượng protein và HđE qua phan đoạn đông khô sau lọc gel

Bảng 3.7 Kết quả các giai đoạn tạo chế phẩm A1

Bảng 3.8 Kết quả các giai đoạn tạo chế phẩm A2

Bảng 3.9 Kết quả các giai đoạn tạo chế phẩm B1

Bang 3.10 Kết quả các giai đoạn tạo chế phẩm B2

Bang 3.11 Một số đặc điểm của chế phẩm B2

C4u tric ciia Ure

Chu trinh Ure

Hình ảnh của cây đậu tương và hạt đậu tương

Cấu trúc của urease

Câu trúc trung tâm hoạt động của urease

Nguyên lý của sắc ký rây phân tử

Câu tạo của phân tử Sephadex

Cột lọc gel

Đường chuẩn sự phụ thuộc mật độ quang vào nông độ protein

Đường chuẩn sự phụ thuộc mật độ quang vào nông độ ure

Các giai đoạn tạo chế phẩm A1

Các giai đoạn tạo chế phẩm A2

vực khác nhau Trong y học, các enzym được nghiên cứu và tinh chế không chỉ để làm thuốc mà một số enzym còn có vai trò quan trọng trong các xét nghiệm chân đoán Urease, enzym thuỷ phân ure, được ứng dụng trong các kit phân tích để xác định ure trong các mẫu bệnh phẩm va dung dịch đạm thủy phân vì có tính đặc hiệu rất cao

véi co chat ure Enzym nay co trong nhiều loại thực vật bậc cao như đậu, lúa

mạch, và nhiều loại vi khuẩn như Helicobacter Pylori, Proteus mirabilis Do có giá

trị trong các xét nghiệm định tính và định lượng ure trong mẫu thử, urease sớm được

các nhà khoa học quan tâm tìm hiểu và nghiên cứu cách chiết tách, tinh chế Tại Việt

Nam, với nguồn nguyên liệu đậu tương phong phi, van dé tinh sach urease tir hat dau tương đã được một số nhà khoa học quan tâm đến nhưng chưa có công trình nào đưa ra được quy trình tinh sạch hiệu quả có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm urease Nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài với giá

thành rất cao Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu chiết tách và các đặc

tính của urease từ hạt đậu tương” nhằm xây dựng quy trình tỉnh sạch urease hat đậu tương hiệu quả nhất, với những mục tiêu cụ thể như sau:

1 Nghiên cứu chiết tách, tỉnh chế urease hạt đậu tương tạo ra các chế phẩm có độ tỉnh sạch khác nhau

2 Xác định được một sô đặc tính của chê phầm urease sau một sô bước tỉnh chê

Chuong I: TONG QUAN

1.1 Tổng quan vé ure

1.1.1 Khái niệm, cấu tạo, nguồn gốc

Ure (hay carbamide) là một hợp chất hữu cơ có công thức hóa học là (NH;);CO

Ưre có vai trò quan trọng trong sự trao đôi chất của các hợp chất chứa nitro ở động vật

và là chất chứa nitro chính trong nước tiêu của động vật có vú

Ure được tìm thấy trong nước tiểu của động vật có vú và động vật lưỡng cư, cũng như một sô loài cá Ngoài ra ure còn có trong đât, nước

+ Công thức phân tử: CHaN;O

+ Khối lượng phân tử: 60,06 g.mol 1

1.1.3 Vai trò của ure trong công-nông nghiệp, sinh lý co thé va trong y hoc

a Trong nong nghiép

Ure được sử dụng làm phân bón cung cấp Nitơ cho cây trồng, ure có hàm lượng nitơ cao nhất trong các phân đạm rắn được sử dụng phố biến trong nông nghiệp Nhiều

vi khuẩn trong đất có các enzym urease xúc tác chuyến ure thành hai phân tử amoniac và một phân tử carbon đioxide, do đó ure trong phân bón rất nhanh chóng được chuyên đổi sang dạng amoni trong đất Sau đó amoni được chuyển thành dang nitrat mà cây trồng có thê hấp thu được

b Tronơ công nghiệp

Ure là một nguyên liệu để sản xuất các hợp chất hoá học quan trong, chang han như:

- Các sản phẩm nhựa, đặc biệt là nhựa ure-formaldehyde

- Các chất kết dính, chẳng hạn nhu formaldehyde, ure hoặc ure melamine-

formaldehyde được sử dụng trong ván ép

- Xyanat kali , một nguyên liệu công nghiệp

- Chất nỗ ure nitrat

- Ure được sử dung trongphảin tng SNCRvaSCR để giảmNO,gây Ôô

nhiễm trong khí thải từ quá trình đốt cháy từ động cơ diesel, nhiên liệu kép và khí đốt

động cơ

c Trong sinh lý cơ thể

Ure tham gia nhiều chu trình quan trọng trong cơ thể, đặc biệt là bài tiết Nitro Ure được tông hợp trong cơ thể của nhiều sinh vật như một phần của chu trình urea, hoặc từ quá trình oxy hóa của các acid amin hoặc từ amoniac Ure được sản xuất

trong gan và vận chuyển trong máu (2,5-7,5 mmol/lít) và được bài tiết qua thận như một thành phần của nước tiểu Ngoài ra, một lượng nhỏ được bài tiết cùng với nafr1

clorua và nước qua mô hôi

The Urea Cycle

NH4 + CO2 +2ATP NAGS Cystoine + ATP

oa tr N-acotylglutamato —_—_ Glutamate OXIDANT

Cc (necessary co-factors GCLC/GCLM INJURY Carbamyl Phosphate

gamma-glutamyicysteine Citrulline

sử dụng để trợ giúp loại bỏ ráy tai

Một số loại túi lạnh nhanh (hoặc nước đá gói) có chứa ure tinh thế và nước Các

túi nước bên trong gây ra một phản ứng thu nhiệt và được sử dụng để làm giảm sưng

Tương tự như nước muối, tiêm ure được sử dụng để thực hiện phá thai

Các test ure máu (BUN) dùng để định lượng nitơ trong máu đến từ ure Nó được

sử dụng như là một dấu hiệu đánh giá chức năng thận

Ure c6 carbon-14 hay carbon-13 được sử dụng trong các test hơi thở ure, được

sử dụng dé phát hiện sự hiện diện cua vi khuan Helicobacter pylori (H pylori) trong da

dày và tá tràng của con người, để chân đoán viêm loét dạ dày tá tràng Xét nghiệm này

có tác dụng phát hiện enzym urease, sản xuất bởi HH pylori, gây ra phản ứng thủy phân

tạo ra amoniac từ ure, làm đôi màu chât chi thi.

Urease test dùng để xác định sự có mặt của H.pylori: H.pylori có khả năng tiết ra urease thủy phân ure, phương pháp này dựa trên nguyên tắc là đưa mảnh sinh thiết vào

một lượng nhỏ dung dịch ure có chỉ thị màu Hoạt tính urease của vi khuẩn (nếu có) sẽ

nhanh chóng phân hủy ure thành amoniac làm môi trường trở thành kiềm hóa và chỉ thị màu sẽ thay đồi

Thiosemicarbazide (TSC).[1]

1.2 Téng quan vé urease

1.2.1 Khái niệm, nguôn gốc urease

Các loại enzym được khoa học biết đến cho đến nay được chia làm sáu nhóm, được kí hiệu theo thứ tự từ EC 1 đến EC 6, trong đó urease thuộc nhóm EC 3.5, nhóm

các enzym tác động lên liên kết Carbon-Nitrogen (bao gồm cả liên kết peptide), phân nhóm EC 3.5.1 là phân nhóm enzym thủy phân liên kết C-N của amid mạch thăng Khái niệm : Urease (EC 3.5.1.5) là enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết carbon-mtrogen trong nhóm amid cua ure thanh carbon dioxide va amoniac

urease (NH,).CO + H,O — CO, + 2NH;

Urease còn gọi là ure amidohydrolase có bản chất là một nickel protein Phản ứng thuỷ phân ure có xúc tác của urease không cần cung cấp năng lượng từ bên ngoài [14]

Enzym urease đã sớm được các nhà khoa học nghiên cứu và tính chế Năm 1926, James Sumner lân đâu tiên đã kết tính và chứng minh được urease có bản chât là một

protein va câu trúc của nó lân đầu tiên được đưa ra bởi P.A Karplus vào năm 1995

Nguồn gốc : Urease được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn (Helicobacter Pylori),

nắm men và một số thực vật bậc cao như đậu (đậu tương, đậu đen ), lúa mạch

Trong các nguồn nguyên liệu sản xuất urease kế trên, đáng chú ý nhất là hạt đậu tương, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm và có hàm lượng urease cao Cây đậu

tương (còn gọi là đỗ tương, đậu nành, Glycine max L Merr, Fabaceae) 1a mot loai cay

trồng phô biến, phân bố ở rất nhiều nơi và đã có nhiều giống được cải biến di truyền

(GMO) nhằm tăng năng suất

Trong hạt đậu tương có các thành phần hoá học phong phú như:

Protein (40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); cac muỗi khoáng, vitamin, enzym, sắp, nhựa, cellulose và các acid amin co ban [2]

Hình 1.3 Hình ảnh của cây đậu tương và hạt đậu tương

(Glycine max L Merr, Fabaceae)

1.3.a) Cay dau tuong

1.3.b) Hạt đậu tuong gia

1.2.2 Dac diém vé cau tric cia urease

Trọng lượng phân tử của urease là 440kDa, chúng có thể polymer hóa để tạo thành đại phân tử polymer với 6 tiểu đơn vị có trọng lượng khoảng 3.000.000 Dalton

[8]

Urease bao gôm hai nửa liên kết với nhau bằng liên kết không đồng hóa trị mà

khi tách ra enzym vẫn giữ được hoạt tính Mỗi nửa phân tử urease được cấu tạo bởi ba

monome giống nhau, mỗi monome có trọng lượng phân tử khoảng 83 kDa, bao gồm 3

tiểu phân ơ = 60,3 kDa, B = 11,7 kDa, y = 11,1 kDa (Hinh 1.4) [7]

Khi tồn tai nhu mot dimer, enzym có hai trung tâm hoạt động Mỗi trung tâm hoạt

động có tính đặc hiệu cao và chỉ liên kết với ure hoặc hydroxyure Mỗi trung tâm hoạt

động của urease đều chứa một nguyên tử nickel, được sắp xếp theo hình kim tự tháp vuông liên kết với năm phối tử khác Mỗi nguyên tử nickel liên kết với hai nguyên tử nitơ của imidazol, một carboxylate và một phân tử nước Hai tiểu đơn vị này liên kết với nhau bởi một phân tử carbamate Các enzym urease có tính đối xứng, mặc dù có những vị trí không đối xứng mà chỉ tồn tại như là một thành phần sinh học của enzym (Hinh 1.5) [8]

Urease có thể được xác định bằng cách sử dụng phố học hồng ngoại vì nó hấp thụ

IR

Hinh 1.4 Cau tric ctia urease

` Carbam ate

H20

Hinh1.5 Cau tric trung tam hoạt động của urease

Màu xanh [a cay = Nickel, trang = Carbon, đỏ = oxy, xanh da trời= Nitơ

1.2.3 Tinh chat cia urease

- Trọng lượng phân tur: 440 kDa [4]

- D6 6n dinh: 6n dinh trong EDTA 10°M hoac 50% glycerol trong vai thang & 4°C

- Kha bén với nhiệt (< 80°C)

se Khả năng xúc tác phản ứng thủy phân ure

Urease hoạt động trong khoảng pH rộng từ 4-9, pH tối ưu là 7,4, nhiệt độ tối ưu là

60°C, cơ chất đặc hiệu là ure và hydroxyure [17]

Hằng số Michaelis: Km = 5,3 mM trong đệm phosphate 1/15M, pH 7 [4]

Tốc độ phan tng Vmax = 6,77 mM/phut/10UI Summer (Don vi hoat lực UI Summer được định nghĩa là lượng enzym có khả năng thuỷ phân ure tạo thành lmg

NH; trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn) [4]

© Ảnh hưởng của chất ức chế đối với hoạt động xúc tác của enzym

Urease bị ức chế bởi các kim loại nặng như các phức hợp chỉ (như Pb & Pb”) Trình tự của các ion kim loại nặng đối với ảnh hưởng đến hoạt tính urease là: Hg” >

Cu” > Cd”” > Co” > Pb* > Sr’* Các nghiên cứu cho thấy rằng urease bị ức chế bởi các kim loại nặng có thể được hoạt hóa lại nhờ EDTA

Ngoai ra, hydroxamic acid, Phosphoramide, Boric acid, boronic acid da duoc chứng minh là các chất ức chế cạnh tranh của urease

s Anh hưởng của nhiệt độ đôi với hoạt tinh cua urease

Hoạt tính của urease tăng lên theo sự tăng nhiệt độ, tuy nhiên khi vượt quá 80°C, urease sẽ bị biến đôi và mat dan hoat tinh O 84°C, urease bi mat hoat tinh sau 15’ [9]

1.2.5 Ứng dụng của urease trong y-dược

Kừ xác định nhanh ure:

Kit thử này hoạt động trên nguyên lý: giẫy thử có gắn urease khi ngâm vào dung dịch cần thử có chứa ure, urease sẽ thủy phân ure thành amoniac và carbonic Amoniac sinh ra làm thay đối pH môi trường làm đôi màu chất chỉ thị gắn trên giấy - dung dịch chứa càng nhiều ure thì màu càng đậm hơn

Ngoài ra, có thể xác định hàm lượng ure bằng cách dùng một dụng cụ cảm biến ure Cảm biến này được chế tạo trên cơ sở máy đo pH được gắn cô định enzym urease Khi tiến hành thử, nếu dung dịch thử có chứa ure thì sẽ phản ứng với enzym làm tăng

pH Dựa vào khoảng pH biến đổi có thể biết được có ure hay không và lượng ure là bao nhiêu Cách sử dụng rất đơn giản, chỉ việc nhúng điện cực của dụng cụ cảm biến vào dung dịch, để khoảng 10 phút và dựa vào đường chuẩn để biết được néng dé ure Enzym có định:

Ngày nay người ta đã tìm ra hơn 120 bệnh về rối loạn chuyên hóa ở người, đa số

các bệnh này là do thiếu một loại enzym đặc biệt nào đó

Một enzym có chức năng tương tự không có nguồn gốc từ cơ thể người không

thể đưa một cách trực tiếp vào cơ thể bởi vì nó sẽ gây ra một đáp ứng miễn nhiễm có

hại cho cơ thê Để giải quyết vấn đề này người ta cô lập enzym trong các vi hạt, sợi hay gel Khi đó, enzym có thê không gây ra đáp ứng miễn nhiễm có hại nào trong khi cơ chất của nó có kích thước nhỏ có thể đi xuyên qua gel, các lỗ trên sợi hay màng của các

vi hat

Cũng theo nguyên tắc này người ta có ý tưởng làm thận nhân tạo Trong thiết bị

nhân tạo này, urease và hạt resin hấp thụ hay than chì được kết thành nang với nhau

Khi đó ure sẽ bị urease phân hủy tạo thành amoni, amoni sẽ được hấp thụ trong các vi nang:

urease

khuếch tán vào vỉ nang hấp thụ lên serin hay than chì

1.3 Phương pháp chiết tách và tinh chế enzym

1.3.1 Đặc điểm của enzym thực vật vận dụng trong chiết tách và tỉnh chế

+ Lượng enzym nhỏ hơn rất nhiều so với các thành phần khác trong tế bào

+ Enzym không bên, đễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài

+ Ngoài protein enzym còn có nhiều protein khác, gây khó khăn cho quá trình chiết

+ Lựa chọn vi tri giau enzym

+ Nguyên liệu trước khi chiết tách phải bảo quản và sơ chế

+ Phá vỡ tế bào (phương pháp cơ học, vật lý, hóa học)

+ Loại tạp và chiết tách bằng các dung dịch đệm, dùng các muối, dung môi hữu cơ dé kết tủa enzym từ đó tách enzym ra khỏi tế bào thực vật

© Phương pháp chiết tách:

+ Phương pháp gây biến tính chọn lọc: Dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH

+ Phương pháp kết tủa phân đoạn: Dựa trên khả năng kết tủa của các enzym ở các nồng

độ muối khác nhau (các muối v6 co NaCl, (NH¿);SŠO¿ K;SO¿ ) hoặc dùng một số

dung môi hữu cơ (alcohol, aceton )

Ngoài ra có thể dùng phương pháp siêu ly tâm, phương pháp sử dụng chính enzym trong nguyên liệu để phá vỡ cấu trúc tế bào (gọi là phương pháp “tự phân”)

Sử dụng phối hợp các biện pháp trong chiết tách enzym cơ bản có thể loại được

các tạp cơ học, mảnh vụn tế bảo, pectid, lipid, phospholipid, protein khác ra khỏi dịch

chiết trong giai đoạn này [14]

1.3.3 Một số phương pháp tỉnh chế enzym

Enzym thường chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tế bào hoặc các cơ quan và có lẫn nhiều tạp chất, do đó việc tinh chế là rất cần thiết Trong những trường hợp nhất định cần phải tỉnh chế enzym để sử dụng cho những mục đích riêng như papain tỉnh khiết để tách mô tế bào; tinh chế chymotrypsin để điều chế thuốc tiêm (chống viêm, giảm phù

nề), chymopapain tỉnh khiết để điều chế thuốc tiêm (chữa thoát vị đĩa đệm cột sống),

hoặc dùng trong nghiên cứu

Urease có bản chất là protein do đó các phương pháp tinh chế enzym cũng là các phương pháp tỉnh chế protein Nguyên lý tỉnh chế dựa vào tính chất lý hóa của enzym:

e Tỉnh chế enzym dựa vào tính chất hòa tan kết túa

Bằng cách thay đôi mật độ điện tích, pH Protein thường được tủa ở điểm dang

điện (pI) đặc trưng của mỗi enzym hoặc kết hợp dùng muối, dùng dung môi hữu cơ để kết tủa, tỉnh chế enzym Thay đổi sự hydrat hóa cũng có thể dẫn tới tủa enzym do làm thay đổi độ tan của protein, thường dùng các muối vô cơ hay còn gọi là điêm tích.[6]

e Tỉnh chế enzym dựa vào kích thước phân tử protein (phương pháp sắc ký rây phân tử) Nguyên tắc:

Sử dụng một nguyên liệu có tính chất hạt, đưa các hạt gel vào cột Chuyển dung

dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, mở van ở đáy cột,

ta thu nhận các phân đoạn khác nhau Quá trình này gọi là quá trình rây phân tử

Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel đã trương nở thì xảy ra quá trình tách các chất có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ lợt vào trong lỗ gel trong khi các phân tử có kích thước lớn di chuyên bên ngoài hạt gel và bị rửa giải sớm hơn các phân tử nhỏ Phương pháp này có ưu điểm

là tiện lợi, nhanh, không đòi hỏi lượng lớn và cé thé tinh ché enzym truc tiép tir ché

phẩm thô [6]

* Phương pháp siêu ly tam

Dùng để xác định trọng lượng phân tử và tính đồng nhất của chế phẩm hơn là

tỉnh chế Nguyên tắc là đựa vào tỷ trọng, kích thước và hình dạng của phân tử [6]

* Phương pháp điện di

Thường dùng để xác định độ tinh khiết của protein hơn là để tinh chế Dựa vào

sự khác nhau của mật độ điện, sự phân bố điện tích, hình dạng và kích thước của các

phân tử nên các protein khác nhau có độ di chuyên khác nhau Phương pháp này cũng dùng để tách một protein ra khỏi protein khác [6]

© Phương pháp sắc kí ai luc

Tinh chế enzym dựa vào sự tạo phức hợp hấp phụ lập thể Đây là phương pháp đặc hiệu đề phân biệt các enzym Mỗi enzym tạo phức hợp hấp phụ với chất có tính đặc hiệu lập thể, phù hợp với trung tâm hoạt động Chất giá không tan gắn với nhóm đặc hiệu của enzym Khi di chuyên qua chất giá, vì tương tác của các nhóm đặc hiệu đó nên enzym di chuyển chậm hơn các protein khác Sau đó enzym được rửa giải khỏi cột bằng cách thay đôi nông độ ion, pH hoặc hằng số điện môi của dung môi rửa giải [6]

© Phương pháp sắc kí trao đổi ion

Tinh chế enzym dựa vào trao đổi ion Sử đụng các chất có khả năng trao đổi ion

(cation hoặc anion) làm chất giá Cần lựa chọn chất giá ưa nước có điện tích ngược với

điện tích trên protein Rửa giải bằng cách thay đối hàm lượng muối hoặc pH của dung dịch Ưu điểm của phương pháp này là có thể dùng phâm tách riêng enzym trong một hỗn hợp protein Có thể tái sắc kí để tăng độ tinh khiết cho enzym [6]

Sau khi tỉnh chế, các chế phẩm enzym cần được sấy khô (sây chân không ở nhiệt

độ thấp hoặc sấy thăng hoa) để có thể sử dụng lâu dài Các chế phẩm thương mại có thê

ở dạng dung dịch có thêm chất bảo quản

> Phương pháp tỉnh chế urease thường được sử dụng là phương pháp diêm tích, sắc

ky loc gel ray phân tử trên Sephadex, điện di, siêu lọc và sắc ký trao đổi ion trên gel DEAE-cellulose Trong nội dung nghiên cứu này sử dụng hai phương pháp đó là phương pháp diêm tích và sắc ký lọc gel

CHUONG 2: DOI TUQNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Nguyén vat liéu, thiét bi

2.1.1 Nguyên liệu

Hạt đậu tương được lẫy từ quả già của cây đậu tương Giycine max L Merr,

Fabaceae được thu hải sau 50-80 ngày sau khi ra hoa tại Phú Thọ

+ Dung dich clurua feric

+ Dung địch thuốc thử DAM — TSC

+ Dung dich dém phosphat pH=7, 1/15M

+ Thuốc thử Gornal

+ Dung dich ure 1%

+ Dung dich ure 0,1%

+ (NH¿);SO¿, HNO+, Ethanol tuyệt đối, nước cất, aceton, Sephadex G-75

2.1.3 Dung cu may moc:

Dung cụ máy móc tại bộ môn Hóa sinh và bộ môn công nghiệp Dược trường đại

học Dược Hà Nội, bao gồm:

1.Máy đo quang phố hấp thụ U-1800

2.Máy ly tâm lạnh Heraus 15R

3.Máy ly tâm thường

4.Máy điều nhiệt

5.May dong khô Christ alpha 1-LD

6.Kính hiển vi.

7.Dụng cụ thủy tinh khô và sạch

2.2 Nội dung nghiên cứu

v' Tách riêng urease từ hỗn hợp protein trong hạt đậu nành băng phương

pháp diêm tích với (NH¿);SO¿

Y Tinh ché tiép urease

wx Định lượng protein — urease và xác định hoạt độ urease dựa trên nguyên

tắc xác định lượng ure còn dư sau phản ứng thủy phân bằng phương pháp

do mau diacetyl monoxime

vx Nghiên cứu một số đặc tính của urease

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này để loại các tạp proten và các phân tử có trọng lượng phân tử cao khác ra khỏi urease trong dịch chiết hạt đậu tương chúng tôi đã dùng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính là (NH¿)zSO¿ ở các nồng độ khác nhau

Chúng tôi tiến hành trên các mẫu dịch chiết hạt đậu tương để tạo chế phẩm thô:

Diêm tích dùng (NH¿);SO¿ ở 2 phân đoạn 25% và 55% tạo chế phẩm A1, đông khô chế

phẩm AI tạo chế phẩm A2 Sau đó dùng các kỹ thuật tinh chế để tỉnh chế A2 tạo chế phẩm BI, đông khô chế phẩm BI tạo được chế phẩm B2

Trong các giai đoạn phân tách sử dụng phương pháp Gornal để xác định hàm lượng protein và dựa trên nguyên tắc xác định lượng ure còn dư sau phản ứng thủy phân bằng phương pháp đo mau diacetyl monoxime để xác định hoạt độ của enzym urease

2.3.1 Phuong phap diém tich

* Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa protein enzym ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nông độ bão hòa)

Thường các phân tử protein trong dung dịch có hai loại tương tác protein — protein và tương tác protein — dung môi Sự có mặt của (NHa)zSO¿ (hoặc NaC]) trong dung dịch protein sẽ làm thay đổi cân bằng giữa hai loại tương tác trên Ở một nồng

độ nhỏ muối (NH,4)2SO, sé lam cho protein tan vao dung dich nhiéu hon Khi nồng

độ (NH¿);SO¿ tăng lên tới một giá trị nào đó thì tương tác protein — protein trội hơn

và các phân tử protein bắt đầu kết tủa Giá trị nồng độ muối (NH¿);SOx gây nên kết tủa protein tùy thuộc vào từng loại protein và người ta lợi đụng sự khác nhau này để

tách chọn lọc các protein ra khỏi nhau

Một tính chất khác của protein là tính tan của các protein sẽ thấp nhất trong dung dịch tại điểm đẳng điện của chúng, người ta lợi dụng tính chất này đề tiễn hành kết tủa chúng tại giá trị điểm đắng điện của chúng Giá trị điểm đẳng điện có được bằng cách thay đổi pH của dung dịch chứa protein

2.3.2 Phương pháp đông khô

*Quá trình đông khô gồm 3 giai đoạn: đông lạnh, sấy sơ cấp, sấy thứ cấp

+ Giai đoạn đông lạnh: Trong giai đoạn này, sản phẩm được đóng băng hoàn toàn ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti (đối với đạng kết tinh) hay nhiệt độ chuyền đổi thủy

tinh (đối với đạng vô định hình) của hệ Đầu tiên, các tinh thể nước đá được hình thành

và tách khỏi dung dịch Phần dung dịch chưa được đông lạnh có nồng độ được chất, tá dược tăng dân, băng điểm của nó giảm xuống và tiễn đến nhiệt độ eutecti (hay nhiệt độ

chuyển đổi thủy tinh) Cuối cùng các thành phần khác trong hệ kết tinh hoặc chuyển sang dạng vô định hình Kết thúc quá trình, hệ tồn tại nhiều dạng khác nhau: tỉnh thê,

vô định hình hoặc cả tinh thể và vô định hình

+ Giai đoạn sấy sơ cấp: Sản phẩm sau khi được đông lạnh thích hợp được chuyên sang buông đông khô dưới điều kiện áp suất nhỏ hơn áp suất hơi nước đá (thường từ 0,05 — 0,20 mmHg hay 0,0665 — 0,226 mbar), nhiệt độ condensor (nhiệt độ buồng

ngưng) khoảng -50°C, nhiệt độ của giá từ -30 đến 10°C Trong điều kiện này, nước sẽ

thăng hoa trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không qua giai đoạn lỏng trung gian Quá trình nhận biết được bởi bề dày băng giảm trong khi bề dày của sản phẩm đông khô tăng lên Ở giai đoạn này, nhiệt độ của sản phẩm phải thấp hơn nhiệt độ phá

vỡ cẫu trúc khoảng 2 — 5°C

+ Giai đoạn sấy thứ cấp: Nhiệt tiếp tục được cung cấp cho sản phẩm để loại bỏ hoàn toàn nước không được đông lạnh và nước hấp phụ trên bề mặt tinh thể Giai đoạn này

thường kéo dài, đến khi chế phẩm đạt độ âm tương đối khoảng 1% thì kết thúc

2.3.3 Phương pháp tỉnh chế bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử trên Sephadex G-75

* Nguyên tắc:

Sử dụng một nguyên liệu có tính chất hạt, đưa các hạt gel vào cột Chuyển dung

dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, mở van ở đáy cột,

ta thu nhận các phân đoạn khác nhau Quả trình này gọi là quá trình ray phân tử

Sephadex là một dextran oligosaccharide được cấu tạo từ nhiều đơn vị a — ølucose nỗi với nhau bằng liên kết 1,2 ; 1,4; 1,6 ; 1,3 o-plucoside Do có nhiều liên kết

tạo thành mạng lưới, sephadex có khả năng hút nước và trương nở, khi ngâm các hạt gel trong nước vài gid sẽ tạo thành hai pha:

- Pha mang: gdm các mạng lưới liên kết trong hạt gel

- _ Pha loãng: pha năm giữa các hạt gel, phủ đầy bằng dung môi hoặc nước

Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel Sephadex đã trương nở

thì xảy ra quá trình tách các chất có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau Các

phân tử có kích thước nhỏ sẽ lọt vào trong lỗ gel trong khi các phân tử có kích thước lớn đi chuyên bên ngoài hạt gel và bị rửa giải sớm hơn các phân tử nhỏ Phương pháp

nảy có ưu điểm là tiện lợi, nhanh, không đòi hỏi lượng lớn và có thé tinh ché enzym

trực tiếp từ chế phẩm thô

L XS H 0H

OH

Hình 3.2 Cấu tạo của phân tir Sephadex

* Xác định hoạt tính riêng của dung dịch enzym trước khi lọc gel theo công thức:

HTR,=

Hm | won

* Tổng hàm lượng protein sau lọc gel được xác định theo công thức:

Vị¡>V, : thé tich cua méi peak (1>n) (ml)

c tym sau khil oc gel

T enk@nt qual traéoxa d nh gel theo cơngth Uc:

% Hi: Hiéu suat vé hoat tinh cua enzym thu được qua lọc gel (%)

HTR,: Hoat tinh cua enzym sau khi qua loc gel (dvht/ml dung dich enzym)

HTR,: Hoạt tính của enzym trước khi qua lọc gel (dvht/ml dung dich enzym)

* Hiệu suất thu nhận protein sau khi loc gel:

2 Ms

%Hụy= “ —x100

Trong đó:

%H,;: Hiệu suất thu nhận protein sau khi lọc gel:

>Ms : Tông khối lượng protein của dung dịch enzym sau khi loc gel (mg/ml dung

dịch enzym)

M, : Tổng khối lượng protein của đung địch enzym trước khi qua lọc gel (mg)

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ urease

Nguyên tắc: (Dựa trên nguyên tắc định lượng ure còn dư theo phương pháp đo màu điacetyl monoxime) Dưới tắc dụng của urease, ure bị thủy phân giải phóng CO;

và NH3 Phan ure con lại tham gia phản ứng với Diacetyl monoxime (DAM) với sự có mặt của chất oxy hóa (FeClạ) và ở môi trường acid nóng sẽ cho sản phẩm ngưng tụ màu hồng Màu của phản ứng được tăng cường nếu cho thêm Thiosemicarbazide

(TSC) Do quang dung dịch này ở 520 nm, cuvet lcm Dựa vào biêu đồ mẫu tính ra lượng ure bị thủy phân, từ đó xác định được hoạt tinh cua urease

Phản ứng xảy ra như sau: