Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NUÔI CÁY VÀ

CHIET TÁCH PEPTIDOGLYCAN TỪ VÁCH

TE BAO VI KHUAN Lactobacillus rhamnosus GG

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ KHÓA 59 (2004 — 2009)

Người hướng dẫu : TS NGUYÊN THỊ LẬP

NNữỉ thực hiện :_ Bộ môn Hoá Sinh

Bộ môn C'ông Nghiện Dược (Trường ĐH Được Hà Nội) Viện Công Nghệ Sinh Học (Viện Khoa hoc va Cong nghé Viet Nam) : 07/2008 - 05/2009 _ Pama Đa,

LOI CAM ON

Trước hết, em xin bày tỏ lòng kinh trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới cô giảa TS Nguyễn Thị Lập, người thấy đã chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quỷ bảu cho em trang học tập, nghiên cửu cũng như Irong cuộc song

Em xin gui loi cam ơn chân thành tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân, thấy giáo Tha Lê Xuân Hoành đã luôn nhiệt tình giún đữ va di hên cạnh em rong quả frìinh làm thực nghiệm

Em cũng xin trân trọng cảm ơn TS Quyên Dinh Thi va cde anh chị cong tác tại nhòng công nghệ sinh học enzym — Viện công nghệ sinh học đã giúp

đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khỏa luận của mình

Em xin cam ơn các chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Hóa Sinh và Bộ môn Công Nghiệp Dược đã hỗ trợ em trong quá trình làm thực nghiệm

Em xin cảm ơn Ban giảm hiệu, Phòng đào tạo, các nhòng han và các thầy cã đã tạa mọi điều kiện và đìu dất em trong quả trình học tập tại Irưởng

và thực hiện kháa luận tất nghiệp

Cuối cùng, em xin dành lời cảm cm từ trái tìm mình tới gia đình và những người hạn thân thiết đã luận luân động viên, khích lệ em trong hoe tap, trong cuộc sống và hết lòng giúp đỡ em thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 3 năm 2009 Sinh viên

Nguyên Ngọc Thoa

MUC LUC

Trang bia phy Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các hình vẽ

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN iygtcbiïldbeibabidiadsiobsscsodtuage 3

1.1 VIKHUAN Lactobacilius rhammosus GΠ2z sai

Bk Ec gio bu cà Biih ĐT uáacdctasaáuibeisiabidliciedgisoasase 3

1.1.3 Phương pháp phân lập giông thuần, giữ giông, nhân giống 5

1.1.6 Tae dung cua Lactobacillus rhamnosus trén lam sang va img dung9

1.2 Peptidogliycan và tác dụng kích thích miễn dịch 10

1.2.1 Đại cương về peptiđoglyCän - -sccccseccecssererrsxrersieee M1:

1.2.2 Phương pháp định tính peptidoglycan coi I]

1.2.3 Tác dụng vả cơ chẻ kích thích miễn dịch đã nghién ctru cia peptidoglycan 1 1

1.3 Các phương pháp chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn 13

1.3.1 Vách t bảo vi khuẩn Gram dương - 5c sccsscscsccvcersseee 13 1.3.2 Những quy trình tỉnh sạch peptidoglycan đã được công bỏ trên thể BIO toan v00 40 gục tong 0020686/10)6001613016803u05u12288 ===5 14

CHƯƠNG LÍ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

Di lý hế ị 100 more ST XI 18

° 1:1 CHÍNH Và NI Úc go ung kGk t0 u2v2ssasxoxeazealfR

ế> 4⁄5 MŨI HƯƠHH ME ca gá tuoi da ddioioc¿dk giïyktušg64G134G146640166600 5e 18

4 A TARY Ge REE aauncekooiiiicciSkoioiateniticakzxectusdi 19 2.2 PHUONG PHAP NGHIEN CU U.ssssccosssescssssossversncsosessssrrsssernsesovese „19

uc: 4.:Ê HƯƠIE Pháp lầm mỗi TOROS is soins esi cceennesnecdetencannitonccbcedenalareseiacee 19

2.2.2 Phương pháp phân lập giống thun 55c 55c lO)

2:24 Phưng: pháp BÌ HỒN iiáccáccá66cGeae0xeiobslSusgadilise 21

2.2.4.Phurong phap mhén giGmg cicessscsesesssverseesrseersesseaserseteaereneeseeenee22

2.2.5.Khao sat thời gian nuôi cây đẻ thu được sinh khối tôi đa 22

2.2.6.Khao sat pH môi trường nuỗi cấy để thu được sinh khối tối đa 23

2.2.7, Quy trinh chiét tach peptidoglycan tir vach tế bao vi khuan Lactobacillus R00 1 cau uy rời tt G6 UattùàGisad66002dsxsa 33 2.2.8 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE định tính peptidoglycan 24

CHUONG ITI KET QUA NGHIEN CUU VA BAN LUẬN 26

3.1 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU — 26

3.1.1 Thời gian nuôi cây đẻ thu được sinh khối tối đa 26

3.1.2 pH môi trường nuôi cấy dé thu được sinh khỏi tôi đa 27

3.1.3 Sinh khối thu được từ môi trường MRS (Merck) và MRS tự pha 28 3.1.4, Quy trình nuôi cấy tỗi ưu cho vi khuan Lactobacillus rhamnosus GG 29

3.1.5 Kết qua dinh tinh peptidoglycan chiết tách được 7Ô NT LH at xáidiakb goi kkkguagsyayanazezff 3.2.1 Quy trinh nudi cay Lactobacillus rhamnosus GG 32

KT CƯ sissies ice a casei cs anaes a iba

BE XUẤT e2 i ae i Nd tai ie hakiiatiini 40 TAI LIEU THAM KHAO

PHU LUC

Bromo cresol purple Cell wall proteins Deoxinbonucleic Deoxiribonuclease Enzym-linked immunosorbent assay

Ethylen diamine tetra acetic acid Immunoglobin A

Interleukin-1-beta Kilo Dalton

Lactobacillus rhamnosus strain GG

De Man, Rogosa and Sharpe N-acetyl muramic

N-acetylglucosamin Optical density Polymerase chain reaction Phosphate- buffered Saline Ribonuclease

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Acid Trichloroacetic

Tumor necrosis factor Alpha

Acid amin Bảo tảng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ

Giá trị mật độ quang

Phản ứng khuyếch đại gen

Đệm phosnhat

Điện di thạch polyacrylamid với sự có mặt của Natri dodecyl sulfat

Yếu tổ gây hủy khỏi u

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN

Hình ! Hinh thái vi khuẩn GG soi trực tiếp 3

Hình 3 Phan lap giéng thuan bằng phương pháp cấy ria 5 Hình4 Ba phương pháp định lượng vi khuẩn 8

Hinh 6 Sơ đỗ cấu trúc vách tế bảo vi khuẩn Gram (+) 14

Hình 7 Đường cong sinh trưởng phát triển của vi khuẩn

Hinh 8 D6 thị tương quan giữa pH môi trường nuôi cay 28

và sinh khối tế bào

Hình 9 Đỏ thị tương quan giữa sinh khối thu được từ MRS (Merk)

Hinh 10 Anh dién di peptidoglycan sau khi pha va

Hinh 11 Anh dién di peptidoglycan sau khi pha vo

nảy Do vậy, các nhà khoa học Nga đã tập trung nghiên cứu để tìm ra một

sản phẩm có tác dụng tăng cường hệ thông miễn dịch tự nhiên của cơ thẻ, an

toàn vả kinh tế

Ngảy nay trên thế giới, việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch

không đặc hiệu trong việc tăng cường và điều hòa hệ thống miễn địch của cơ thể ngày cảng trở nên phô biển Những chất kích thích miễn dich không đặc

hiệu nảy sẽ làm tăng sức để kháng của cơ thẻ, kích thích sản xuất kháng thé

đặc hiệu chống lại những tác nhân gây bệnh Do vậy, chúng được sử dụng

nhiễu trong phỏng và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến miễn địch như suy giảm miễn dịch, dị ứng và ung thư Một trong những chất rất được quan tâm phát triển hiện nay là Delta Immune ban chat la peptidoglycan cé trong vách tế bảo Lactohacillus rhamnosus GG, Đề góp phần phát triển, nghiên

cứu, ứng dụng peptidoglycan trong điều trị, chúng tôi đã thực hiện khóa luận

tốt nghiện: “Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan

từ vách tế bào vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus GG” véi cdc mục tiểu

cụ thể như sau:

1 Nghién ctru va x4y dumg quy trinh nudi cay téi wu vi khuan Lactobacillus

rhamnosus GG

2 Xây dựng quy trình chiết tách và định tính được peptidoglycan từ vách tế

bao Lactobacillus rhamnosus GG

CHUONG I: TONG QUAN

1.1 VI KHUAN Lactobacillus rhamnosus GG

1.1.1 Nguồn gốc và hình thái

Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) hay còn có tên gọi khác là Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 là một dòng của loài vi khuẩn có ích,

sinh acid lactic Lactobacillus rhamnosus, thugc chi Lactobacillus, ho

Lactobacilaceae [12] Nam 1983, hai nhà khoa học người Phần Lan

Sherwood Gorbach và Barry Goldin đã chiết tách thành công vi khuẩn này

ra từ ruột của những người khỏe mạnh [46]

Về đặc điểm hình thái, 1.GG là trực khuẩn Gram đương, dưới vật kính dầu 100% có hình que đài thanh mảnh, màu nâu, kích thước tế bào khoảng

0.7-1.1 x 2.0-4.0 n¡m, không có khả năng di động (hình 1) Trong phương

pháp nhuộm Gram L.GG bat mau tim [10]

Hình 1 Hình thái vi khuẩn L.GG soi trực tiếp

Ngoài ra, khi nuôi cấy /.GG trên đĩa thạch petri thu được những khuẩn

lạc to, hình dạng trông giỗng như hạt vừng, bẻ mặt nhẫn, màu trắng sữa, đục

mờ Những khuẩn lạc này mọc sâu trong thạch, lan xuống đáy (hình 2) [18].

Hình 2 Hình thái khuẩn lạc L.GG [4]

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Laetabaeillus rhamnosus GG có nhu cầu dinh dưỡng rất lớn Nhu cầu

vé carbon duge cung cap tir glucose, Nhu cau về các hợp chất nitrogen chủ

yếu là từ cao thịt, cao nắm men và peptone Nhu cầu về chất khoáng và các nguyên tô vi lượng gồm muối kalihydrophosphat, diamonium hydrogen citrate và natri acetafe, ion magie và mangan [8] Vì vậy, môi trường chuẩn

và thích hợp nhất để tăng sinh, giữ giống và chiết tách thành phần từ vi

khuân thuộc chỉ Ứactobacillus là môi trường De Man Rogosa Sharpe (MRS) [29]

Vẻ hỗ hắp, L.GG là vi khuẩn ky khí [31]; có khả năng tôn tại trong một khoảng phân bế nhiệt độ khá rộng là 2-52°C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối

uu la 37°C [5] Do vay điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn này là tủ ẩm 37C

có bố sung 5% CO,

Lactobacilius là những vì khuẩn sinh acid lactic do vậy làm giảm pH của môi trường và làm đổi màu chỉ thị từ màu tím pH trung tính sang màu vàng ở pH acid trên môi trường Bromo Cresol Purple (BCP) Chúng có khả năng tên tại trong một khoảng pH acid thấp (3- 4,5), phát triển tốt trong

khoảng pH từ 5 đến 7 [5], [14], tuy nhiên pH thích hợp nhất là 6,2 [31]

L.GG phat triển theo quy luật hàm số mũ sau 18 giờ, ngừng lại sau 24

giờ và được chia làm 4 pha Pha lag (pha thích ứng) kéo dải từ 0-5 giờ Pha

log (pha lũy thừa) phát triển năng động nhất trong khoảng thời gian từ 5-18

giờ Pha dừng hay pha ỗn định là pha sinh khối tế bảo không tăng thêm nữa

từ 18-24 giờ Cuỗi cùng là pha suy tàn từ 24-45 giờ [31]

1.1.3 Phương pháp phân lập giống thuần, giữ giống, nhân giống

Phân lập giống thuần là phương pháp tạo ra vi sinh vật thuần khiết phát triển từ một tế bào ban đầu riêng biệt Để đạt được mục đích đó người ta tạo

ra các khuẩn lạc riêng rẽ bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy

ria Đây là hai phương pháp thông dụng nhất do Koch nêu ra Trong phương

pháp pha loãng, đầu tiên pha loãng mẫu cần phân lập bằng nước muỗi sinh

lý vô trùng để cho số lượng của chúng ít đi do đó các khuẩn lạc sẽ mọc tách

rời nhau ra Phương pháp cấy ria được minh họa trong hình 3, khuẩn lạc riêng rẽ ở vị trí số 4 sẽ được lấy ra, tăng sinh trong môi trường MRS lỏng để tạo các ampul giống Khi cấy xong, đem ủ trong tủ ấm 37C, lật ngược đĩa petri đáy lên trên và nắn ở đưới Sau thời gian cần thiết sẽ thu được khuẩn

lạc riêng rễ [8]

Hình 3 Phân lập giống thuần bằng phương pháp cấy ria [$]

Giữ giống là một khâu quan trọng để đảm bảo chất lượng và tính én

định của chủng vi khuẩn nghiên cứu trong một thời gian dài Đối với vi

khuẩn ky khí người ta dùng kỹ thuật cấy đâm sâu trên thạch đứng Cụ thể

như sau: ống nghiệm được đồ khoảng 2/3 môi trường MRS thạch, tiệt trùng

ở 121C trong 135 phút, sau đó trong tủ cây vô trùng đâm sâu que cấy có vi khuẩn dọc theo ông thạch cho đến tận đáy Tùy theo yêu cầu có thể đâm từ I-3 đường [8] Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp sẽ thu được khuẩn lạc hình que, thanh mảnh, màu nâu sắm nhưng ngăn hơn khuẩn lạc trên đĩa

petri Phuong pháp nảy có thể giữ giống trong vòng từ 1,5- 2 tháng nếu bảo quản ở 4°C Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học, dong kho

trở thành phương pháp phố biến để bảo quản vỉ sinh vật Thời gian bảo quản

khoảng 6 tháng [4]

Đề thu được nhiều sinh khối tế bảo, vĩ khuẩn được tăng sinh trong mỗi

trường MRS lỏng (MRS broth) Trước tiên, giỗng thuận khiết trong các ampul được lẫy ra một cách cẩn thận và cây truyền sang môi trường MRS lỏng để hoạt hóa lại, sau đó nuôi cấy trong điều kiện thích hợp băng cách bỏ sung mỗi trường liên tiếp sau mỗi chu kì phát triển Phương pháp bán liên

tục nảy đã được sử dụng rất nhiêu đề thu sinh khối nắm men phục vụ trong

công nghiệp [7] [8], [29]

1.1.4 Phương pháp định tính vi khuẩn

Người ta có thê định tính vi khuân bảng phương pháp soi trực tiếp trên

kính hiển vi điện tử để quan sát hình thái, cách sắp xếp tế bảo hay nhuộm

Gram dé phan loại vi khuẩn Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương

bat mau tim con Gram âm bắt màu hồng Ngoài ra, bằng cách quan sát hinh dạng, mảu sắc và kích thước khuẩn lạc cũng có thể xác định được vi khuẩn

đo mỗi vi khuẩn có một khuẩn lạc đặc trưng riêng Vì thể với các KIT định tính và khỏa phân loại Bergey có thể nhanh chóng định danh tên vi sinh vật

[12]

Ngày nay, công nghệ gen dùng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) giúp định tên được các dòng trong từng loài vi khuẩn một cách chính xác [38].

1.1.5 Phương pháp định lượng vi khuẩn

Vi khuân có thẻ được định lượng một cách trực tiếp hoặc gián tiếp theo

ba cách chủ yếu được minh họa băng hình 4, đó là định lượng trực tiếp bằng

buông đếm hông cầu, định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng cách đếm số lượng

khuẩn lạc trên mỗi trưởng đặc và phương pháp đo độ đục [8], [21]

Với phương pháp định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng câu, số tế bao trong ImÌ mỗi trưởng được tỉnh theo công thức sau đây [8] :

Nguyên tắc của phương pháp định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng cách

đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trưởng đặc lả: một tế bảo ở pha tăng trưởng hay ở giai đoạn sớm của pha ổn định đều có thể phân chia theo cấp số nhân

cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được Số lượng

khuân lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉnh là số lượng tế bào sống trong thê tích đó Do vậy cần phải pha loãng sao cho mỗi

khuẩn lạc chỉ được hình thành từ một tế bào sống duy nhất [8] Số lượng

khuẩn lac trong 1 ml mau được tính bằng công thức sau :

Kas =< 5 ụ

Trong đỏ :

n : số khuẩn lạc trung binh trong đĩa netri ở mỗi độ pha loãng nhất định

v : thể tích dịch mẫu dem cay (1 ml)

D: hệ số pha loãng.

Người ta cũng có thể dùng phương pháp đo độ đục để xác định nỗng độ

vi khuẩn dựa trên nguyên tắc sinh khối tế bào có thể biểu diễn bằng giá trị mật độ quang (OD) đo được [6] Chủng vi khuẩn L.GG khi đo tại bước sóng 600nm thì cứ một đơn vị OD tương ứng với 0,34g tế bảo khô thu được từ

1.1.6, Tac dung cua Lactobacillus rhamnosus trén lam sang va rng dung Lactobacillus rhamnosus la mot probiotic thuộc hệ vị khuẩn có ích ở

đưởng ruột, theo tiếng Hy Lạp, probiotic có nghĩa là "dành cho cuộc sống” [43] Day la một chủng vi khuẩn đã được chứng minh với nhiều tác dụng có

ÿ nghĩa trên lắm sảng

Theo két qua nghién ctu in vitro va in vive gan đây, L.GG tăng cường

chức năng sinh lý của hệ thông ruột bằng cách bám chặt vào chất nhờn ở thành ruột, lưu trú tại đây và cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh Chúng được

ví như một hảng rào bảo vệ cơ thẻ khỏi những tác nhân gây bệnh đường ruột

và do đó được ứng dụng trong phòng và điều trị tiêu chảy đặc biệt là ở trẻ

em [35]

Kết quả thử nghiệm lâm sảng vẻ điều trị tiêu chảy do vi khuẩn Rotavirus được tiễn hành trên 287 trẻ em ở độ tuổi từ 1-36 tháng cho thấy L.GG lam giảm thời gian bị nhiễm Rofavius cũng như làm giảm thời gian phải năm viện điều trị của bệnh nhân [20]

Đông thời 7.GG tăng cường khả năng thải độc, bài tiết, chuyên hóa của

cơ thẻ Đã có những bằng chứng khoa học cho thấy L.GG làm giảm tích lũy

aflatoxin trong ruột từ 30% xuống con 5% thông qua việc tăng cường thải trừ phức hợp aflatoxin- L.GG [22]

L.GG cũng đã được chứng minh là có khả năng cải thiện vả tăng cưởng

hệ thống miễn địch của cơ thẻ thông qua việc kich thích sản xuất các cytokine của tế bào đơn nhân máu ngoại vi [30] [32], tăng đáng kế lượng interferon gamma [36], kich thich dap ứng miễn dịch hệ tiêu hóa bằng cách

tăng sản sinh kháng thể IgA có trong lớp màng nhây của ruột [30] Chính vi

thể, 7.GG được ứng dụng trong các chế phẩm vi sinh giúp tăng cường sức đề

kháng chỗng lại bệnh tật và giảm nguy cơ mắc một số bệnh phỏ biển ở trẻ sơ sinh như: ngứa, dị ứng, viêm mũi dị img, hen, cham [46]

Đelta Immune là một ứng dụng mới hiện nay, về bản chất đỏ là những

đoạn thành tế bảo của /.GG với cầu trúc cơ bản là peptidoglycan được dùng

như một chế phẩm tăng cường hệ miễn dịch, sử dụng rộng rãi ở Nga trong

khoảng gắn 20 năm nay và ở Mỹ trong khoảng 5 năm nay [46] Với tác dụng

kích thích miễn dịch không đặc hiệu, Delta Immune được dùng đẻ điều trị

các bệnh suy giảm miễn địch phổ biến hiện nay như: viêm phế quản mãn,

viêm loét đường tiêu hóa và đặc biệt là phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tỉnh, ung thư [46]

1.2 PEPTIDOGLYCAN VA TAC DỤNG KÍCH THÍCH MIEN DICH

1.2.1 Dai cwong vé peptidoglycan

Peptidoglycan hay còn có tên gọi khác là Murein có thành phân cơ bản bao gỗm: N-acetylglueosamin, acid N-acetyl muramic và 1 chuỗi tetrapeptid

chửa cả L và D acid amin, trùng hợp xen kẽ với nhau tạo thành chuỗi

peptidoglycan Tetrapeptid trên mỗi chuỗi peptidoglycan liên kết với

tetrapeptid trên chuỗi khác tạo thành lớp và tetrapeptid trên các lớp khác

nhau liên kết chéo với nhau tạo thành mạng lưới không gian đa lớp vững chắc bao quanh ngoài màng sinh chất Đẳng thời các thành phân của mạng

lưới peptidoglycan liên tục được mở ra để đường mới có thẻ găn thêm vào,

nhờ đó mả tê bào có thé sinh trưởng, phân chia được (hình 5) [3]

1d

>” a» eid N-acetyl muramic

œ az acid amin

Hình 5 Mô hình chudi polyme peptidoglycan

1.2.2 Phương phap dinh tinh peptidoglycan

Đề định tính peptidoglycan người ta thường dùng kỹ thuật dién di SDS- PAGE với thang protein đã biết về trọng lượng phân tử Peptidoglycan được coi là tình sạch nêu kết quả thu được những vạch tách rời riêng biệt và trọng lượng phần tử phù hợp với các nghiên cửu làm cùng phương pháp [9]

Theo kết quả của các nghiên cứu đã tiễn hành, peptidoglycan tỉnh sạch

có nhiều loại khác nhau với trọng lượng phân tử có thể lả: 15 kDa [17]; 30 kDa [13]; 46 đến 54 kDa [1 1]; 50 kDa [34] [46] Theo một nghiên cứu tách

chiết của Ashok Kumar và cộng sự cho kết quả như sau: 120, 92, 80, 66, 55,

miễn dịch không đặc hiệu này cé mét vi tri quan trong trong sự phát triển

I1

biện pháp điều trị bằng miễn dịch hiện nay Đặc biệt trên cơ sở nghiên cứu

được lý miễn địch tiền lâm sàng, các chất này đã tỏ ra có triển vọng lớn nhất

trong việc chấp thuận hợp pháp đẻ ứng dụng trên lâm sảng [2]

Vẻ tác dụng kích thích miễn dịch của peptidoglycan

Peptidoglycan là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu Nó đã

được chứng minh là có khả năng kích thích sản xuất IL-1-beta trên cá chép

Cyprinus carpio sau 4 giờ và đạt được nông độ cao nhất sau 5 ngày [23]

Thêm nữa, peptidoglycan hiệp đồng tác dụng cùng với

phytohaemoagglutinin (PHA-P) tăng cường đáp ứng miễn dịch của co thé [23]

Peptidoglycan từ vách tế bào /.GG còn được biết đến dưới tên Delta

Immune hay Russian Choice Immune kích thích rất mạnh sự sinh trưởng vả biệt hóa cao các bạch cầu lympho tại đường ruột cũng như trong máu Ngoal

ra, Delta Immune con lam tăng trưởng cytokines (những phân tử sinh học điều hành hoạt động tế bảo} Đặc biệt là khả năng trợ giúp đại thực bao, day

là những tế bảo miễn dịch có vai trò quan trọng trong khởi đầu cơ chế miễn dịch đông thời điều hòa hoạt tính của TNFE-alpha và Interleukin-2 để các chất này không gây tên thương cho cơ thể trong các bệnh viêm mãn tính, dị

ứng và bệnh tự miền [42]

Về cơ chế tác dụng của peptidoglyean, [1|

Có thê nói, sự có mặt của peptidoglycan trong cơ thẻ không gây sản

xuất kháng thể chống lại nó mả chỉ kích thích cơ thé tăng cường sản xuất

khang thé noi chung dé chong lai bat cứ một kháng nguyên nào khác đang

ton tại trong cơ thẻ

Peptidoglycan tác dụng lên các chất có thẩm quyên miễn dich (dai thực

bao, lympho T va B) Cac tế bào có thâm quyền miễn địch này đáp ứng với

kích thích của kháng nguyên qua 3 giai đoạn mà trong mỗi giai đoạn đẻu cỏ

vai trỏ của chất kích thích miễn địch không đặc hiệu Ở giai đoạn tiếp nhận kháng nguyên, chất kịch thích miễn dịch làm tăng hoạt tính thực bảo do đó

gây tăng hoạt tính kháng nguyên, tăng sản xuất Interferon, kich thich tăng sinh tế bào để chuyên đại thực bào có định thành di động Sang giai đoạn chuyển dạng lympho, chất kích thích miễn địch kích thích chuyển dạng

Iympho thành các tế bào trẻ hóa trở lại (dang blast), chuan bj cho qua trinh

nhân lên và phân chia Và giai đoạn phân chia và nhân lên, chất kích thích mien dịch làm tăng cường quá trình này, biểu hiện hàm lượng acid deoxiribonucleie (ADN) tăng lên rõ rệt do đó một lượng lớn các tế bảo có

khả năng tông hợp kháng thể Và kết quả là làm tăng sinh tổng hợp kháng

thé

1.3 CAC PHUONG PHAP CHIET TACH PEPTIDOGLYCAN TU VACH TE BAO VI KHUAN

1.3.1 Vách tế bào vi khuẩn Gram dương

Vách tế bảo là lớp ngoài cùng bao quanh vi khuẩn, bên chắc và có độ day 20-80nm So di nhu vậy là do vách tế bào ví khuẩn Gram (+) được cau tạo bởi hệ thông mạng lưới peptidoglycan lập thể ba chiều, là polyme gắn

kết đa chiều vững chắc (hình 6) Chính lớp peptidoglycan này lả cơ sở để

phan biét Gram (+) va Gram (-) vi peptidoglycan chiém khoang 90% trong

vách tế bảo Gram (+) Thêm vảo với lop peptidoglycan nay con có acid

teichoic, Acid teichoic là nolyme của D- alanin và glycerol phosphat, cỏ thể liên kết với peptidoglycan hoặc màng tế bào chất, loại acid teichoic liên kết với màng tế bảo chất được gọi là acid lipoteichoic Nhờ cấu tạo như vậy

vách tế bảo thực hiện được chức năng duy trì ngoại hình tế bảo, bảo vệ tế

bảo chỗng lại những điều kiện ngoại cảnh bất lợi [3]

lä

Protein mang

IIIfffff ng AiG A MAA NAN AN

Mang te bao IIIIIIILII IIiIIILLÔ) WIUU IWU IIULU 0

Hình 6 Sơ đỗ cầu trúc vách tế bào vi khuẩn Gram (+)

1.3.2 Những quy trình tỉnh sạch peptidoglycan đã được công bố trên

thé giới

Đã có nhiều quy trình chiết tách thành công peptidoglycan được công

bố, nhìn chung có thể chia thành 3 giai đoạn chính, đó là: phá vỡ vách tế bao

vi khuẩn; tỉnh sạch vách tế bảo vả cuỗi cùng là tách riêng thu lay peptidoglycan Cy thé nhu sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn phá vỡ vách tế bào vi khuẩn

Trong các nghiên cứu đã tien hanh, vach tế bảo vi khuẩn Gram (+) co

thể được phá vỡ bằng 2 cách: sử dung LiCl hodc cát thủy tỉnh

e Quy trình sử dụng LIC]:

Phan tan sinh khoi té bao vao dung dich LiCl 5M (10-15mg LiCl trong Iml H;O) tạo thành một hỗn dịch, sau đó ủ ở ÚC, trong 10 phút Mục đích của LÍCI là để loại bỏ protein lớp ngoài cùng (S-layer) của vách tế bảo vi

khuản, nhiệt độ thấp đẻ ức chế sự tái hop cua lp S-layer này [28]

l4

Với nhương pháp này, người ta có thể quan sát các thành phản cầu tạo

và cầu trúc của peptidoglycan dưới kính hiển vi điện tử Tuy nhiên, LiCI là

hóa chất đắt tiên và đây là một kỹ thuật phẫu thuật ở mức độ nano phúc tạp

do vậy khó có thẻ thực hiện ở nước ta hiện nay

se Quy trinh sử dụng cát thủy tinh:

Theo Ashok Kumar và cộng sự, tế bảo vi khuẩn được phá vỡ bằng cát

thủy tỉnh (đường kinh 0,17-0,18 mm) trong máy làm đồng nhất hóa Hỗn

dịch đem ly tâm (3000 vỏng/phút, 10 phút, 4'C) thu dịch nỏi Ly tâm dich nỗi (13000 vòng/ phút, 25 phút, 4”C) thu căn tế bảo, Rửa căn nảy bằng nước

3 lần [26] Ngoài loại cát thủy tỉnh trên, vách tế bào cũng có thể được phá vỡ

bằng cát thủy tỉnh (đường kinh 0,45-0,50 mm) [40] Mặt khác, trong nghiên cứu của mình, Fox A và cộng sự công bỗ lượng cát thủy tĩnh sử dung la 30g

[16]

Theo một nghiên cứu khác sau khi tiễn hành lăc mạnh hẳn dich sinh

khối tế bảo với sự có mặt của cát thủy tỉnh đem ly tâm (1700 vòng/ phút, Š

phút, 4”C) đẻ loại bỏ những tế bảo chưa bị phá vỡ Dịch nỏi thu được đem ly

tam (17680 vong/ phut,15 phat, 4°C) thu cắn là vách tế bào, tiếp đó rửa lại

bảng nước cất vài lần và đồng khô Cứ 0,1 mg vách tế bảo được phân tán

vảo Iml H;O chứa L0” acid trichloroacetic (TCA) vả đun söi trong I5 phút

Cuỗi cùng rửa lại | lan bang dém phosphat (PBS) pH 7,3 va 4 lan bang nude

[37]

Không chỉ được xử lý bằng cát thủy tỉnh, có quy trình còn sử dụng thêm

một tác nhân lảm mát là đồng khí CO› Cách này có thẻ phá vỡ hơn 95% tế

bao [16]

15

Giai doan 2: Giai đoạn tỉnh sạch vách tế bào vi khuẩn bang enzym

Sau khi phá vỡ cầu trúc, vách tế bảo vi khuẩn được xử lý bằng một số

enzym Sau đây là một sỏ phương pháp đã được nghiên cứu vả tiến hành trên thể giới:

Theo Ashok Kumar, cắn tế bào sau ly tâm được phan tan vào dung dịch đệm phosphat pH 7,6 chứa tryspin (200ug/ml), RNase (100Hg/ml), DNase

(50ug/ml) Đem ủ ở 37C, 18 giờ Sau đó rửa bằng nước 3 lần và đông khô

[26]

Trong nghiên cứu của X Zhang và cộng sự, vách tế bảo được xử lý

băng 3 enzym trên nhưng khác ở nông độ sử dụng: DNase (1 mgig sinh khối

ướt), RNase (10 mg/g sinh khỏi ướt) tryspin (20 mg/ø sinh khi ướt) Sau

đây, để loại bỏ protein màng ngoài cùng (CWPS) xử lý tiếp băng các

protease nhu: proteinase K (2 mg/g trong lugng wot), pespin (20 mg/g trong

lượng ướt), papain (5 mgig trọng lượng ướt) Bước tiếp theo là dùng hỗn

hợp dung mỏi chloroform- methanol (2:1} để loại bỏ acid lipoteichoic hay glycosyl glycerid [41]

Mặt khac, Fox A va céng su dua ra mét guy trinh nhu sau: vach te bao

được ủ với RNase (0,025mg/mg } ở 37C trong 4 giờ và lắc liên tục Lẫy ra

rửa bằng đệm phosphat (PBS) và xử lý tiếp bằng trypsin (0,025mg/mg) ở

3TC trong 4 giờ Rửa lại lằn nữa rồi phan tan vao dém phosphat (PBS) pH

7,0 có chứa 0,00I1M cystcin và 0,001M EDTA Cuỗi cùng ủ với papain (

0,02mg/mg) ở 37C trong 4 giờ, rửa bằng đệm phosphat (PBS) 2 lần, bằng

nước 1 lan, thấm tách và đông khô [16]

Giai đoạn 3: Giai đoạn tách riêng thu lấy peptidoglyean

Peptidoglycan được tách ra từ vách tế bảo tính sạch băng cách chiết 5 lần với formamid ở 170C trong 1 giờ Sau lân chiết cuối cùng, phần còn lại không tan được rửa với nước I lần, thâm tích lại bằng nước trong 48 giờ va

16

đông khé Phuong phap nay đã được mô tả chỉ tiết bởi Krause và MeCarty

- Mỗi trường nuôi cây: MRS đặc và MRS thạch (Merck, Đức)

- Pepton, cao nắm men, cao thit, glucose, natri acetat, Natri clorid

- Cat thủy tình (đường kính: 0,1 7-0,18 mm}

- Đệm phosphat (PRS) nH 7,6

- Cac enzym: DNase 10 mg/ml va RNase 10 mg/ml, Trypsin 1X (25mg/ml) (Sigma, Australia)

- Trichloroacetic acid (TCA) 5%

- Thang protein: Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas,

My)

2.1.3 Môi trường MIRS

Cũng thức mỗi trường MIRS lóng tự pha:

Pepton 10,0g Diamonium hydrogen citrat 2,0

Cao thit 10,0g Natri acetat 3,0g

Cao nam men 5,0g Tween 80 I,0ml

Công thức mỗi trường MRS đặc:

Cir 1000ml MRS lòng được bỗ sung thêm 18,0g thạch

- May dong kho

- May siéu ly tâm lạnh

- Máy lắc ngang

- Đĩa petri, ông nghiệm, đầu côn các loại

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp làm mỗi trường

Pha chế mỗi trường: từng thành phan của môi trường MRS được cân,

đong chính xác theo công thức băng cân kỹ thuật Sau đó hòa tan hết với

nước, bỏ sung nước cho đủ thẻ tích Nếu môi trường có thạch can lam tan

thạch băng cách đun trong lò vỉ sóng khoảng 30 giây (chủ ý không để môi trưởng tràn ra ngoài) Môi trường cản phải trong để quan sát, nêu cần thiết thì

tiến hành lọc băng bông Điều chỉnh pH của môi trưởng bằng dung dịch HCI

19

hay NaOH vẻ pH 6.2 Đối với MRS-Merck pha theo công thức quy định của

dùng đến phải bảo quản trong tủ lạnh 4”C

L.GG được tăng sinh trong MRS-Merck và MRS tự pha từ cùng một éng gidng long Nudi cay trong ti 4m 5% CO, sau 24 gid dem ly tam (8000

vong/phat, 5 phut, 4"C) thu cin, phan tan cin nay vao 10ml H2O cat Tran

déu hon dich trén bang cach ding pipet hút lên hút xudng vai lan réi do dé

đục ở bước sóng 600nm bảng may do mat dé quang UV-VIS

2.2.2 Phương pháp phân lập giỗng thuần

Giống thuẫn được phân lập bằng phương pháp pha loãng:

- Chuan bị 5 ống nghiệm, mỗi ông chứa 9ml nước muối sinh lý vỗ trùng,

đảnh số thứ tự từ 1 đến 5

- Lay một lượng bột từ chế phẩm chứa /.GG cho vào ông nghiệm số 1, lắc

nhẹ

- Dùng pipet pasteur 1000u1 hút Imi từ ống nghiệm số 1 cho vào ống

nghiệm số 2, trộn đều bằng cách hút lên, hút xuống vải lẳn Cứ tiếp tục làm

như vậy cho đến ông số 5

- Sau đó lẫy Iml từ mỗi ông số 4 và ống số 5 cho vào 2 đĩa petri đã tiệt trùng

- Hé mở đĩa petri đỗ nhanh khoảng 12-15ml MRS thạch đã tiệt tring con am

vào, xoay qua xoay lại vải lần

- Đề thạch đặc lại, lật ngược 2 dia petri nay, cho vao ta 4m 37°C, 5% CO;

- Sau 72 gid lay mét khuan lac moc riéng ré tang sinh trong môi trường MRS long sé thu được vi khuẩn /.GG thuần khiết Ông giống vi khuẩn ở dạng lỏng

bảo quản trong tủ lạnh 4”C giữ được trong 1 tuần

2.2.3 Phương pháp giữ giống

L.GG được giữ giống bảng kỹ thuật cấy đâm sâu trên thạch đứng và cứ

|,5- 2 tháng cây truyén mot lan

Cấy đâm sâu trên thạch đứng

Thạch đặc được đỏ từ 1⁄2 đến 2/3 ông nghiệm, sau khi tiệt trùng đê đứng, thạch đông lại ta có ông thạch đứng Tủ cấy được tiệt trùng bing con 95" va

UV trước khi sử dụng

Các bước sau được thực hiện trong tủ cấy vô trùng:

- Đưa que cấy vòng có vỉ sinh vật đâm sâu vào đọc sát theo thành ông thạch

cho đến tận đáy ông nghiệm, đâm từ 1-3 đường Lưu ý khi cắm que cấy vào

cũng như khi rút que cây ra, chủ ý phải giữ que cấy thăng, nhẹ nhang va không làm cho mỗi trường bị nứt nẻ

- Tiếp đến nuôi cây trong tủ âm 37C, 59% CO:, trong 42 giờ Sau đó ống

giảng được bảo quản trong tủ lạnh 4°C

Cây truyền từ ống thạch đặc sang mỗi trường MRS lỏng

Que cây vòng được sử dụng với các bước lần lượt như sau:

- Đốt đèn côn trong tủ lên

- Tay trải cảm 2 ông nghiệm: ống thạch đứng ở phía ngoài và ông mỗi trường

MRS lỏng ở phía trong (lưu ý: không để môi trường chạm vảo nút bông) giữa

2 ngón tay cải vả ngón tay trỏ, lòng bản tay hướng lên trên

- Dùng tay phải xoay lỏng các nút bông

- Tay phải cảm que cây và vô khuẩn trên ngọn lửa đèn côn,

- Kẹp nút bông giữa các ngón tay vả giữ như vậy đến khi đóng các nút bông lại

- Đốt miệng của 2 ông nghiệm trên ngọn lửa đèn côn.

- Đưa que cây vào ông thạch đứng và lấy một ít thạch có vi khuẩn rồi cho vào

ống môi trường MRS lỏng Lưu ý: không đẻ đầu que cấy chạm vào thành các

ống nghiệm

- Rút que cấy ra, đốt miệng ông nghiệm và nút bông rồi đậy lại

- Đề các ông nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cần và đẻ lại vị trí cũ

- Nuôi cây trong tủ âm CO; trong 24 giờ, sau đó cây vào một ông thạch đặc khác

1.2.4 Phương pháp nhân giống

Trong tủ cấy vô khuẩn đỗ nhẹ nhàng ông nghiệm chứa L.GG đã hoạt

hóa băng 10mi MRS (ống giống vi khuẩn ở dạng lỏng) vào bình nón đựng IDml mỗi trường lỏng MRS đã tiệt trùng Hơ nhẹ miệng hình nón qua ngọn

lira, day lai bang nut béng roi dé vao th am 37°C, 5% CO:, nuôi cay trong

những khoảng thời gian thích hợp

Thu sinh khôi băng ly tâm (8000 vòng/phút, 5 phút, 4”C)

2.2.5 Khảo sát thời gian nuôi cấy để thu được sinh khối tối đa

Thí nghiệm này được thực hiện theo các bước sau day:

- Chuẩn bị 10 ống nghiệm được đánh số thử tự lần lượt từ I đến 10, mỗi ống

có Ìml mỗi trường MRS lòng tự pha

- Các ông nghiệm được đem hắp tiệt trùng

- Sử dụng phương pháp nhân giếng: lấy Iml ông giống vi khuân ở dạng lông

cho lin lượt vào từng ông nghiệm trên

- Sau các khoảng thời gian nuôi cấy 6 giờ; 12 giờ; 18 giờ; 24 giờ; 30 giờ; 36

giờ; 42 giờ; 48 giờ; 54 giờ; ó0 giờ lần lượt lẫy ông nghiệm từ I đến 10 cất vào

tủ lạnh đề làm ngưng quá trình sinh trưởng vả phát triển của vi khuẩn

- Ly tâm (8000 vòng/phút, 5 phút, 4'C) thu cắn, phân tán cắn này vào 10ml

HạO cất Trộn đều hỗn dịch trén bang cach dung pipet hút lên hút xuống vải lan roi đo độ đục ở bước sóng 600nm bằng máy đo mật độ quang UV-VIS.