ẢNH HƯỞNG CỦA TỔ HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN SINH KHỐI MÔ SẸO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Vũ Thị Lan1, Quách Thị Liên2, Nguyễn Đức Thành 2 1 Trư
Trang 1ẢNH HƯỞNG CỦA TỔ HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA
ĐẾN SINH KHỐI MÔ SẸO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L.,)
Vũ Thị Lan1, Quách Thị Liên2, Nguyễn Đức Thành 2
1
Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên, 2 Viện Công nghệ Sinh học
TÓM TẮT
Bài báo này trình bày các kết quả nghiên cứu về nuôi cấy thu nhận sinh khối mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung và định tính ancaloit trong các mẫu mô sẹo thu được Mô sẹo sau khi tạo khoảng 50 ngày, được cắt thành các miếng nhỏ có kích thước khoảng 0,7cm x 0,7cm, trọng lượng khoảng 0,35- 0,40 g, cấy lên các môi trường nuôi cấy sinh khối khác nhau có nền môi trường cơ bản là
MS, sucrose 30 g/l, agar 7 g/l, bổ sung kết hợp NAA 2mg/l với BAP ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) hoặc nước dừa ( nồng độ 10; 20; 30; 40 %) Kết quả thu được cho thấy: Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo để thu sinh khối là: SB1(MS + 2 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP) và SB2 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP); SK6 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l kinetin) và SK7 (MS + 2mg/l NAA + 1,5 mg/l kinetin); SN9 (MS + 2mg/l NAA + 10% nước dừa) và SN10 (MS + 2mg/l NAA + 20% nước dừa) Bước
đầu đã định tính phát hiện có ancaloit trong các mẫu mô thu được
Từ khoá: Ancaloit, cây Trinh nữ hoàng cung, môi trường, nuôi cấy, sinh khối mô sẹo
∗ MỞ ĐẦU
Hiện nay, các nhà khoa học đang rất quan tâm
đến các ứng dụng thực tiễn của công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật để tổng hợp các
hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
Những năm gần đây, cây Trinh nữ hoàng
cung (TNHC) đã nhận được sự quan tâm đặc
biệt của các nhà khoa học cả ở trong nước và
nước ngoài vì các tính năng dược học quan
trọng của nó Đó là các tính năng chữa bệnh
như phì đại tuyến tiền liệt ở nam giới và u xơ
tử cung ở phụ nữ, đặc biệt là khả năng chống
ung thư [8], [9], [12] Trinh nữ hoàng cung
đang trở thành cây thuốc rất có giá trị trong
việc điều trị chứng phì đại lành tính tuyến tiền
liệt Vì vậy, nhu cầu về số lượng và chất
lượng nguyên liệu để sản xuất thuốc đối với
cây thuốc này ngày càng tăng
Ở Việt Nam, để tăng nguồn cung cấp nguyên
liệu cho chế biến thuốc ở qui mô công nghiệp,
đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học
ứng dụng phương pháp nuôi cấy in vitro vào
việc nhân giống Trinh nữ hoàng cung và nhận
được những kết quả khả quan, góp phần giải
quyết nhu cầu nguồn nguyên liệu [1], [3]
∗ Tel: 091 4504250, Email: lanvtdhkhtn@gmail.com
Hiện nay, không chỉ các tác giả ngoài nước
mà đã có nhiều công trình khoa học, các bài báo của các nhà khoa học Việt Nam đã nghiên cứu và xác định tương đối đầy đủ về thành phần hoá học của cây Trinh nữ hoàng cung Việt Nam [4], [6], [7], [10],[11] Tuy nhiên, vấn đề nghiên cứu quy trình nuôi cấy
mô tế bào cây Trinh nữ hoàng cung để thu nhận sinh khối và phân tích các chất có hoạt tính sinh học trong mô chưa được quan tâm Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả về ảnh hưởng của sự tổ hợp các chất
điều hòa sinh trưởng và nước dừa đến sinh
khối mô sẹo thu được từ mẫu củ cây Trinh nữ hoàng cung và kết quả ban đầu về định tính ancaloit trong các mẫu mô sẹo thu được bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Cây Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium
L., thuộc họ Thuỷ tiên Amaryllidaceae do Viện Dược liệu cung cấp
Phương pháp
- Phương pháp nuôi cấy sinh khối mô sẹo:
Nguồn nguyên liệu, phương pháp tạo mô và môi trường tạo mô sẹo được công bố theo
Trang 2Quách Thị Liên và cs, 2005 [5] Mô sẹo được
cắt thành các miếng nhỏ có kích thước
khoảng 0,7 cm x 0,7 cm và trọng lượng
khoảng 0,35 - 0,4g cấy lên các môi trường
nuôi cấy mô sẹo khác nhau với nền môi
trường cơ bản là MS, đường sucrose 30 g/l,
agar 7 g/l và bổ sung thêm các chất điều
hòa sinh trưởng (ĐHST) với các nồng độ
khác nhau
- Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Các môi trường nuôi cấy thu nhận sinh khối
được kí hiệu từ SB1-SN12, chia làm 3 nhóm:
kí hiệu SB1 - SB4: MS bổ sung 2 mg/l NAA
kết hợp với BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l); kí
hiệu SK5 - SK8: MS bổ sung 2 mg/l NAA kết
hợp với kinetin (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l); kí
hiệu SN10 – SN12: MS bổ sung 2mg/l NAA
kết hợp với nước dừa (10; 20; 30; 40%)
Mỗi công thức môi trường tiến hành theo dõi
trên 10 bình tam giác 250 ml Mỗi bình cấy 4
mẫu mô Nuôi cấy trong phòng tối Sau
khoảng thời gian 120 ngày thu sinh khối, cân
trọng tươi của mô (g/bình) Mô sẹo sau khi
thu được sấy khô ở 40 - 50 0C đến trọng
lượng không đổi
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng
Định tính alcaloid trong mô sẹo bằng phương
pháp sắc kí lớp mỏng theo Bùi Thị Bằng [2] Khảo sát dịch chiết: Hoà tan mẫu nghiên cứu trong dung môi chiết Dùng mao quản hút mẫu chấm lên bản mỏng tráng sẵn Silicagel DC- Alufoluen 60 F254 (Merck 5554) Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Đưa vào hệ dung môi CHCl3: MeOH (9:1) để sắc kí Hiện kết quả trên bản mỏng bằng thuốc thử Dragendof
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả nghiên cứu tạo mô sẹo từ củ Trinh nữ hoàng cung của tác tác Quách Thị Liên và cộng
sự cho thấy hai loại auxin nghiên cứu là NAA
và 2.4D đều có tác dụng tốt tới khả năng tạo mô
sẹo và sự sinh trưởng phát triển của mô sẹo [5] Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy sự có mặt của 2,4D trong môi trường kích thích sự nhân nhanh và kéo dài tế bào lại ít kích thích sự sản xuất các chất trao đổi thứ cấp bằng IAA và NAA Mặt khác, 2,4D là chất có khả năng gây ung thư nên được hạn chế dùng hoặc dùng với lượng rất nhỏ
Bảng 1 Ảnh hưởng của tổ hợp các chất ĐHST và nước dừa đến đặc điểm hình thái
và sinh trưởng, phát triển mô sẹo cây TNHC
Môi
trường
NAA
(mg/l)
BAP (mg/l)
Kinetin (mg/l)
Nước
Hầu hết các mô tạo rễ to
xanh nhạt Một số mô tạo nhiều rễ nhỏ
nhạt, rắn chắc Một số mô tạo rễ to
Trang 3Các thí nghiệm được chúng tôi bố trí trên nền
môi trường cơ bản: MS + 30 g/l sucrose + 7%
agar + 2mg/l NAA và bổ sung kết hợp với các
chất ĐHST là BAP hoặc kinetin hoặc nước
dừa ở các nồng độ khác nhau Kết quả thu
được trình bày ở bảng 1 và 2
Kết quả thu được cho thấy: hầu hết các môi
trường nuôi cấy bổ sung kết hợp 2 mg/l NAA
với BAP hoặc kinetin hoặc nước dừa mô sẹo
đều sinh trưởng và phát triển tốt, khối mô to,
rắn chắc, có màu xanh lục, vàng nhạt hoặc
trắng sáng ngà Quá trình sinh trưởng và phát
triển của mô sẹo có sự liên quan mật thiết với
sự phân hóa và phát sinh hình thái rễ Ở
những môi trường mô sẹo không tạo rễ, khối
mô sẹo thường nhỏ, sinh trưởng chậm và
nhanh già, thâm đen Điều này hoàn toàn phù
hợp vì nuôi cấy mô sẹo thường có xu hướng
biệt hoá cơ quan tạo rễ hoặc chồi
Hình thái mô sẹo cây TNHC được chia làm
ba loại sau:
a) Mô sẹo màu xanh lục, khối mô to, xốp, và
phân hoá nhiều rễ to Loại mô này đặc trưng
cho các môi trường bổ sung kết hợp với BAP
(SB1 và SB2)
b) Mô sẹo có màu vàng nhạt hoặc trắng sáng ngà, khối mô sẹo to, rắn chắc, có nhiều rễ nhỏ Loại mô này đặc trưng cho các môi trường bổ sung kết hợp với kinetin (SK5, SK6)
c) Khối mô sẹo to, dạng hạt, rắn chắc, có màu xanh lục và ít tạo rễ Loại mô này đặc trưng cho các môi trường bổ sung kết hợp với nước dừa (SN9, SN10)
Hình 1 Mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung
(a) Rễ to; b) Rễ nhỏ; c) Không tạo r ễ )
Kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy sinh khối
mô sẹo thu được trên cả ba nhóm môi trường
bổ sing tổ hợp các chất ĐHST khác nhau đã
có sự khác biệt nhau rõ rệt Tỉ lệ NAA/ BAP
và NAA/ nước dừa khác nhau có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển mô sẹo,
do vậy sinh khối mô sẹo thu được có sự dao
động lớn từ 4,26 g/bình đến 31,66 g/bình sau
120 ngày nuôi cấy
Bảng 2 Ảnh hưởng của các chất ĐHST và nước dừa đến sinh khối mô sẹo cây TNHC
Môi trường
Trọng lượng tươi của mô (g/ bình)
Trang 4Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp
2mg/l NAA với BAP (môi trường từ SB1 đến
SB4): Mô sẹo sinh trưởng và phát triển rất tốt
và đồng đều ở giai đoạn đầu, sau đó tốc độ
sinh trưởng của các môI trường mới có sự
chênh lệch nhau Sau 120 ngày nuôi cấy, sinh
khối mô sẹo đạt cao ở môi trường SB1và
SB2, lần lượt đạt 26,57 và 31,66 g/bình tăng
17,1 và 18,96 so với ban đầu Sinh khối mô
sẹo giảm dần ở các môi trường SB3 và SB4
Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp
2mg/l NAA với kinetin (môi trường từ SK5
đến SK8): Mô sẹo sinh trưởng và phát triển
tương đối tốt, tuy nhiên giữa các môi trường
khác nhau trọng lượng mô sẹo thu được có sự
chênh lệch nhau Sau 120 ngày nuôi cấy, sinh
khối mô sẹo đạt cao và tương đương nhau ở
môi trường SK6 và SK7, lần lượt đạt 22,58 và
22,48 g/ bình tăng 16,14 và 15,36 lần so với
ban đầu
Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp
2mg/l NAA với nước dừa (môi trường SN10
–SN12): Mô sẹo đều sinh trưởng tốt ở giai
đoạn đầu, sau đó mới có sự khác biệt giữa các
môi trường Môi trường SN9 và SN10, mô
sinh trưởng và phát triển khá tốt, trọng lượng
mô đạt được sau 120 ngày nuôi cấy lần lượt
là: 23,26g và 24,30g
Định tính alcaloid trong mô nuôi cấy
Sinh khối mô sẹo sau khi thu, được sấy khô
và bảo quản để tiến hành các phân tích định
tính ancaloit
Quy trình chiết alcaloid như trình bày ở phần
phương pháp Sau khi chiết, chúng tôi tiến
hành chạy sắc kí lớp mỏng (SKLM) với hệ
dung môi CHCl3: MeOH (9:1) đối với 12
mẫu sẹo thu được từ các thí nghiệm nuôi cấy
sinh khối
Sắc kí đồ SKLM của các môi trường SB1-
SN12 trên hình 2 cho thấy: hầu hết các mẫu
mô đều có 1 phân đoạn màu da cam đậm
tương đương với Rf của mẫu chuẩn (Rf =
0,6) Điều này chứng tỏ các mẫu mô sẹo nuôi
cấy đều có chứa các hợp chất ancaloit Ngoài
ra, các mẫu mô sẹo còn có nhiều hơn từ 2-3 phân đoạn có Rf khác nhau nhưng do chưa
được tinh sạch nên chưa tách biệt rõ ràng và ở
dạng vết mờ
Hình 2 Sắc ký đồ SKLM, C: mẫu chuẩn; kí hiệu
từ 1-12 là thứ tự các công thức SB1- SN12 Chúng tôi vẫn đang tiếp tục nghiên cứu để lựa chọn môi trường nuôi cấy đặc hiệu và tìm ra phương pháp tinh sạch nguyên liệu cho phương pháp SKLM đạt kết quả tốt hơn KẾT LUẬN
Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo để thu sinh khối từ củ cây Trinh nữ hoàng cung là:
- Môi trường SB1(MS + 2 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP) và SB2 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP)
- Môi trường SK6 (MS + 2 mg/l NAA + 1,0 mg/l kinetin) và SK7 (MS + 2mg/l NAA + 1,5 mg/l kinetin);
- Môi trường SN9 (MS + 2mg/l NAA + 10% nước dừa) và SN10 (MS + 2 mg/l NAA + 20% nước dừa)
Phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (9:1) thích hợp cho việc
định tính alcaloid trong mô cây Trinh nữ
hoàng cung nuôi cấy in vitro Bước đầu đã
định tính phát hiện có alcaloid trong các mẫu
mô thu được
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].Tạ Như Thục Anh, Phạm Văn Hiển (1998), ” Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Dược
liệu, 3 (1), tr.13 – 16
Trang 5[2] Bùi Thị Bằng (2006), Các phương pháp sắc
ký, Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, CI, Phần IV:
Các phương pháp hoá lý ứng dụng trong phát
triển và kiểm nghiệm dược liệu, NXB khoa học và
kỹ thuật, tr.493 – 607
[3] Nguyễn Văn Bằng, Vũ Đoan Trang, Nguyễn
Thị Thu Hằng (1997), ”Bước đầu nghiên cứu cây
Hoàng cung trinh nữ (Crinum Latifolium L) - Một
cây thuốc có khả năng chữa bệnh ung thư”, Tạp
chí Dược học, số 3, tr 7-9
[4] Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ,
Ngô Vân Thu, Delome Frederic Daniel F, Michel
Bechi (1999),”Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.,
Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật sắc kí ghép với khối
phổ (GC- MS)”, Tạp chí Dược học, Số 4, tr.9-11
[5] Quách Thị Liên, Vũ Thị Lan, Lê Thị Vân
Anh, Nguyễn Đức Thành (2005),”Nuôi cấy mô
sẹo cây Trinh nữ hoàng cung”, Tạp chí Công nghệ
Sinh học, số 3 (3), 353-362
[6] Nguyễn Thị Minh, Trần Bạch Dương, Nguyễn
Tuấn Anh, Phan Tống Sơn (1997), ” Đóng góp
vào việc nghiên cứu các alcaloid của cây Tỏi lơi lá
rộng (Crinum latifolium L.) của Việt Nam, Tạp
chí HH & CNHC, số 3, tr 13 - 16
[7] Mai Đình Trị, Nguyễn Công Hào (2005), Phenylpropanoit và flavonol glycosides được cô lập từ lá tươi Trinh nữ hoàng cung (Crinum
Latifolium L.)”, Tạp chí Hoá học, 43(2), 162-164
[8] Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Kamenarska Z,, Bankova V., Popop S., Zvetkova E., Katzarovo E.,
Lê Mai Hương (2001),“ Hoạt tính gây độc tế bào
của các phân đoạn alcaloid từ cây Trinh nữ hoàng
cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae)”, Tạp
chí Dược học, số 11, 21 -23
[10] Trần Văn Sung, Trịnh Phương Liên (1997),
“Một số kết quả ban đầu về nghiên cứu thành phần
hoá học cây Trinh nữ hoàng cung”, Tạp chí Hoá
học, Số 1, 64-65
[11] Elgorashi E.E., Drewes S.E., Johannes Van Staden (1999), “Alcaloids from Crinum
bulbispermum”, Phytochemistry, 52, pp.533-536
[12] Ghosal S., Sain K.S., Razdan S (1985),
“Crinum alcaloids: their chemistry and biology”,
Phytochemistry, 24(10), 2141-2156
[9] Phan Tống Sơn, Trần Bạch Dương, Phan Minh Giang, Nguyễn Thị Minh, Walter C Taylor
(2001), Nghiên cứu các alcaloid từ củ cây náng lá
rộng (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) của
Việt Nam“, Tạp chí Hoá học, Số 3, 83-88
SUMMARY
EFECT OF GROWTH REGULATOR COMBINATION AND COCONUT MILK
ON CALLUS BIOMASS OF (Crinum latifolium L.,)
Vu Thi Lan1∗, Quach Thi Lien2, Nguyen Duc Thanh 2
1 College of Sciences - TNU, 2 Institute of Biotechnology
Nowaday, scientists are interested in the practical aspects of plant tissue culture technology in
order to biosynthesis of variety of natural compounds or bioactive compounds In this paper, the results on callus biomass culture of Crinum latiffolium L are presented Callus formation affer 50
days having certain size and weight was used for callus biomass culture experiments Callus pieces were cultured on MS medium containing 30 g/l sucrose, 7 g/l agar and added 2,0mg/l NAA in combination with BAP, kinetin and coconut milk Affter 120 culture days, the obtained results indicated that the suitable media for callus biomass cultures were SB1and SB2 medium (MS added 2,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l or 1,0 mg/l BAP); SK6 and SK7 medium (MS added 2,0 mg/l NAA + 1,0mg/l or 1,5mg/l kinetin); SN9 and SN10 medium (MS added 2,0 mg/l NAA + 10% coconut milk or 20% coconut milk) The method of thin layer chromatography used with solvent system CHCl3: MeOH (9:1) was suitable for qualification of alkaloid and early qualitative results showed that the alkaloid was presented in callus tissue biomass
Key words: Alcaloid, callus biomass, culture, Crinum latifolium L., medium
∗ Tel: 091 4504250, Email: lanvtdhkhtn@gmail.com
