ĐặC ĐIểM PHÂN Tử CủA VIRúT CúM A/H5N1 LƯU HàNH TạI MIềN BắC VIệT NAM, 2003-2008 LÊ QUỳNH MAI - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương TóM TắT Virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã được ghi
Trang 1Y học thực hành (764) - số 5/2011 86
Nam Kết quả PCR trên một nhóm gồm 75 bệnh nhân
cho độ nhậy là 92% và độ đặc hiệu là 100% và các
phản ứng PCR trên ADN sinh thiết của một nhóm bệnh
nhân khác gồm 38 bệnh nhân cho độ nhậy là 82% và
độ đặc hiệu là 100% Cặp mồi cagA có thể sử dụng để
phát hiện vi khuẩn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao
TàI liệu tham khảo
1 Marshall, B F and Warren J R (1984) Unidentified
curved bacilli in the stomach of patient with gastritis and
peptic ulceration Lancet, pp 311 - 315
2 Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi
(2001) Sự tồn tại của các chủng Helicobacter pylori
khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân viêm loét
và ung thư dạ dày Việt Nam Đại hội lần thứ hai hội nghị
khoa học hoá sinh y dược năm 2001- Các báo cáo khoa
học Trang106 -113
3.Trần Quỳnh Hoa., Lê Băng Sơn, Nguyễn Thị Thanh
Lợi., Hoàng Tuấn Anh, Nguyễn Thị Nguyệt, Bùi Phương
Thuận, Đặng Đức Trạch và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001) Sự đứt đọan của hai nucleotide ở đầu 5’ của gien
cagA của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt Nam Hội thảo quốc tế về Sinh học Hà Nội- Việt Nam 2-5 tháng
6 / 2001
4.Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003) Xác
định độ nhậy và tính đặc thù của cặp mồi PCR nhằm phát
hiện vi khuẩn Helicobacter pylori (in press)
5 Nguyễn Thị Nguyệt và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003) Tính nhậy và tính đặc thù của của hai cặp mồi
PCR TH1 và TH2 trong phát hiện vi khuẩn Helicobacter
pylori (in press)
6 Lê Băng Sơn và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001) Nghiên cứu vi khuần Helicobacter pylori, chủng Việt Nam
Hội thảo quốc tế về Sinh học Hà Nội - Việt Nam 2-5 tháng 6/2001 Tr 414 - 417
ĐặC ĐIểM PHÂN Tử CủA VIRúT CúM A/H5N1 LƯU HàNH TạI MIềN BắC VIệT NAM, 2003-2008
LÊ QUỳNH MAI - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương
TóM TắT
Virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã được ghi
nhận không chỉ gây bệnh cho gia cầm mà còn gây
bệnh viêm đường hô hấp cấp nguy hiểm cho người
Trường hợp nhiễm virút cúm gia cầm đầu tiên tại Việt
Nam được xác định vào cuối năm 2003 và đến nay đã
có 119 trường hợp được ghi nhận trong đó 59 trường
hợp tử vong Virút cúm gia cầm A/H5N1 có đặc điểm
tiến hóa về di truyền học tương tự các virút cúm A đã
biết Nghiên cứu của chúng tôi trên 23 chủng virút cúm
gia cầm độc lực cao phân lập trên người tại miền Bắc
Việt Nam, 2003-2008 cho thấy hầu hết các phân đoạn
gen của virút cúm A/H5N1 nhóm vào 2 kiểu hình
kháng nguyên là clade 1 và clade 2.3.4 Tuy nhiên gen
NA lại biểu hiện trên 3 kiểu hình kháng nguyên là clade
1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 tương tự với virút cúm gia
cầm A/H5N1 lưu hành trên gia cầm tại Việt Nam và
Trung Quốc trong cùng thời gian
Từ khóa: virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1,
kiểu hình kháng nguyên, gen HA, gen NA
SUMMARY
The highly pathogenic avian influenza (HPAI)
A/H5N1 virus are causing of poultry outbreak as well
as acute severe pneumonia in human The 1 st
confirmed A/H5N1 case was recognized in Vietnam in
the end of 2003 and up to now, 119 confirmed cases
were reported, of those 59 deaths The genetic
evolution of HPAI/H5N1 is similar known influenza A
viruses and leaded to antigen changing that caused of
endemic or pandemic so far Our study analyzes 23
strains of A/H5N1 isolated from A/H5N1 patients in the
North of Vietnam during 2003-2008 period by
molecular characterization The results showed that
most of genetic fragments clustered into clade 1 and
clade 2.3.4, however, the NA gen have diverged into
clade 1, clade 2.3.2 and clade 2.3.4 that referred to
poultry isolates in Vietnam and China at same period
Keywords: Highly pathogenic avian influenza
(HPAI) A/H5N1 virus, clade, HA gene, NA gene
ĐặT VấN Đề
Virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI/H5N1)
được biết đến như một tác nhân mới gây viêm đường hô hấp cấp nặng có tỷ lệ tử vong cao Trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 đầu tiên được ghi nhận tại Hồng Kong năm 1997 và xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003 cùng với dịch bùng phát trên đàn gia cầm ghi nhận tại 59/63 tỉnh/thành trong cả nước Đến nay, virút cúm gia cầm A/H5N1 đã thường xuyên xuất hiện trên đàn gia cầm và tiếp tục gây bệnh cho người Tại Việt Nam, 119 người đã được xác định nhiễm virút cúm
A/H5N1 và 59 người tử vong [3]
Virút cúm A với đặc tính tiến hóa nhanh do sự thay
đổi vật liệu di truyền trong quá trình nhân lên đã ảnh hưởng nhiều đến chiến lược sản xuất vaccine toàn cầu, virút cúm gia cầm A/H5N1 cũng mang đặc điểm này Tìm hiểu sự thay đổi về phân tử trong các vật liệu di truyền của virút cúm A/H5N1 phân lập trên người tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2008 nhằm
đánh giá khả năng tiến hóa của virút liên quan đến thay đổi về đặc điểm kháng nguyên và so sánh với các virút cúm A/H5N1 lưu hành trên gia cầm trong cùng thời gian là mục đích nghiên cứu của chúng tôi
VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu
Hai mươi ba (23) chủng virút cúm A/H5N1 phân lập
từ bệnh phẩm đường hô hấp (dịch họng, dịch phế quản, dịch tỵ hầu) của các bệnh nhân nhiễm virút cúm A/H5N1 tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn
2003-2008 (bảng 1)
Toàn bộ quá trình phân lập virút cúm A/H5N1 được thực hiện tại phòng thí nghiệm (PTN) an toàn sinh học cấp độ 3 (BSL-3) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới [4]
Trang 2Y học thực hành (764) - số 5/2011 87
Phương pháp nghiên cứu
Vật liệu di truyền của virút (ARN) được tách chiết từ
nước nổi nuôi cấy tế bào (Tissue Culture Fluid- TCF)
bằng bộ sinh phẩm tách chiết ARN -QIAamp, Qiagen-
Mỹ Quy trình tách chiết thực hiện theo thường quy của
bộ sinh phẩm
- Sử dụng primer U12 (5’-AGCAAAAGCAGG-3’) để
tổng hợp cADN từ ARN theo quy trình của bộ sinh phẩm
SuperScriptTM
III reverse transcriptase (Invitrogen)
- Sản phẩm cADN thu được sẽ được sử dụng để
khuếch đại toàn bộ 8 phân đoạn gen của virút cúm
A/H5N1 (HA; NA; NP; NS1; M; PB1; PB2 và PA) bằng
phương pháp PCR chuẩn khi sử dụng bộ sinh phẩm
ProofStart DNA Polymersase (Qiagen- Mỹ) với DNA
polymerase và các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi phân
đoạn gen của virút cúm A/H5N1
- Sản phẩm PCR được tinh khiết bằng bộ sinh
phẩm MinElute PCR Purification (Qiagen- Mỹ) Hỗn
hợp sequencing bao gồm BigDye@ 3.1 Sản phẩm
PCR cùng với các cặp mồi thích hợp Phản ứng
Sequencing thực hiện trên máy giải trình tự ABI 3100
(ABI, Foster City, Mỹ) và được kiểm tra trên cả hai đầu
3’và 5’ Trình tự chuỗi nucleotide được sắp xếp và thu
thập bằng phần mềm SeqSpace 2.1 (ABI- Mỹ)
- Cây gia hệ được xây dựng trên các thông số đã
biết được xử lý bằng phần mềm ClustalW và dựng cây
bằng phương pháp Neighbor-Joining (NJ), độ tiến hóa
được ước tính toán theo chỉ số nhân lên của bootstrap
(100 neighbor-joining bootstrap)
KếT QUả NGHIÊN CứU
Toàn bộ 8 phân đoạn gen của 23 chủng virút cúm
A/H5N1 phân lập tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008
đã được phân tích sự tiến hóa về mặt di truyền Các
chủng virút cúm A/H5N1 Việt Nam cũng được so sánh
với các chủng virút A/H5N1 đại diện lưu hành trên thế
giới trong cùng thời gian Cây gia hệ của các phân
đoạn gen đều lấy gốc là chủng virút cúm
A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) Chủng virút cúm
A/H5N1 này phân lập trên ngỗng tại Miền Nam Trung
Quốc được cho là tổ tiên của virút cúm A/H5N1 đang
lưu hành hiện nay [2]
Bảng 1: Các chủng virut cúm A/H5N1 phân lập tại miền Bắc Việt Nam 2003-2008
Tên chủng virut
Ngày thu thập mẫu
Địa chỉ Tình trạng
bệnh nhân
Loại bệnh phẩm A/Vietnam/UT3028/2003 12/2003 Ha Nam Tử vong DPQa
A/Vietnam/UT3028II/2003 12/2003 Ha Nam Tử vong DPQ A/Vietnam/UT3030/2003 12/2003 Nam Định Tử vong DPQ A/Vietnam/UT3035/2003 12/2003 Bac Giang Hồi phục DHb
A/Vietnam/UT3040/2004 1/2004 Bac Ninh Tử vong DTHc
A/Vietnam/UT3040II/2004 1/2004 Bac Ninh Tử vong DPQ A/Vietnam/UT3047III/2004 1/2004 Bac Binh Tử vong DTH A/Vietnam/UT3062/2004 1/2004 Bac Giang Tử vong DTH A/Vietnam/UT30259/2004 7/2004 Ha Tay Tử vong DPQ A/Vietnam/30262III/2004 8/2004 Ha Tay Tử vong DPQ A/Vietnam/UT30408III/2005 2/2005 Thai binh Hồi phục DTH A/Vietnam/UT30850/2005 10/2005 Ha Noi Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31203A/2007 5/2007 Vinh Phuc Hồi phục DTH A/Vietnam/UT31239/2007 6/2007 Thanh Hoa Hồi phục DH A/Vietnam/UT31244II/2007 6/2007 Ha Nam Tử vong DTH A/Vietnam/UT31244III/2007 6/2007 Ha Nam Tử vong DTH A/Vietnam/UT31312II/2007 6/2007 Ha Tay Tử vong DPQ A/Vietnam/31388/2007 12/2007 Son La Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31394II/2008 1/2008 Tuyen Quang Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31412II/2008 2/2008 Hai Duong Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31413II/2008 3/2008 Ninh Binh Tử vong DPQ A/Vietnam/31432/2008 4/ 2008 Phu Tho Tử vong DTH
a: Dịch phế quản; b: Dịch hang; c: Dịch tỵ hầu
Sự tiến hóa về di truyền của virút cúm A/H5N1
được ghi nhận thông qua các kiểu hình kháng nguyên (clade) được hình thành Tại gen HA có 9 clade đã
được hình thành và các virút cúm A/H5N1 phân lập trên người tại Việt Nam tập trung vào clade 1 và 2.3.4 (hình 1) Trên cây gia hệ của gen NA, sự khác biệt của các clade không rõ ràng, tuy nhiên có hai clade chính
là clade 1 và clade 2 cũng được ghi nhận trong đó các virút cúm A/H5N1 của nghiên cứu được nhóm vào clade 1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 (hình 1)
Tương tự như vậy, các gen còn lại M, NS, PB1, PB2., PA và NP, các virút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu cũng tập trung nhóm tại clade 1 và clade 2.3.4 (hình 2,3,4)
2.3.4
2.3.3 2.3.2 2.3.1 2.2 2.5 2.4
2.1
1 9
6
5 7 4
3
0
A/ goose/ Guangdong/ 1/ 96
0.005
Clade 2.2
Clade 2.1
Clade 2.3.4
Clade 1
A/ Viet nam/ HN31432M/ 2008 A/ Viet nam/ UT30850/ 2005
Clade 2.3.2
G V Z
Gs/ GD X-series
20 aa deletion
Gs/ GD B C W Z+ (no deletion)
HK/ 97-like 19 aa deletion
A/ African st arling/ England/ 983/ 79 H7N1
0.01
Hình 1 Cây gia hệ gen HA và NA của virút cúm A/H5N1 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008
Trang 3Y häc thùc hµnh (764) - sè 5/2011 88
Clade 1
Aquatic B C V Z Z+
H9N2
X-series Early
Ck/ Bei Gs/ GD
Aquatic W G Early
Early G1
Aquatic
A/ equine/ Prague/ 1/ 1956 (H7N7)
0.02
H9N2 Gs/ GD
B C G W Z Z+ (clade 1)
Aquatic Early
G1
Ck/ Bei X-series
A/t urkey/England/N28/73 H5N2
0.01
H×nh 2 C©y gia hÖ gen PB2 vµ PA cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008
clade 2.3.4
clade 1
B G W V Z Z+
Gs/ GD
H9N2
Outliers
G1
Early Aquatic X-series
Outliers
Ck/ Bei
A/ pi nt ail duck/ ALB/ 628/ 1979(H6N8)
0.02
Clade 2.3.4
Clade 1
G V X-series Z Z+
Aquatic W
G1
B
Gs/ GD C
Ck/ Bei Early Early
Early Aquatic
A/ equi ne/ Prague/1/1956(H7N7)(8)
0.02
H×nh 3 C©y gia hÖ gen PB1 vµ NP cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008
Clade 2.3.4
A/ Viet nam/ HN31432M/ 2008 A/ Viet nam/ UT30850/ 2005
Clade 2.3.2
Clade 1
B C G W V Z Z+
X-series
Gs/ GD
Aquatic Aquatic
Early
G1
Ck/ Bei
A/ equi ne/Prague/1/ 1956(H7N7)(8)
0.02
Clade 2.3.4
Clade 1
B C G W V Z Z+
Early
Aquatic Aquatic
X-series
Ck/ Bei
G1
Gs/ GD
0.05
H×nh 4 C©y gia hÖ gen M vµ NS cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008
Trang 4Y học thực hành (764) - số 5/2011 89
BàN LUậN
Sự tiến hóa về di truyền học của virút cúm A là một
trong những đặc tính quan trọng của virút trong quá
trình duy trì sự tồn tại của mình trên các vật chủ Đặc
tính này đã làm thay đổi đặc tính kháng nguyên giúp
cho virút cúm A trốn khỏi các miễn dịch bảo vệ đã biết
và tạo ra các vụ dịch hoặc đại dịch mới ảnh hưởng lớn
tới sức khỏe cộng đồng Các vụ dịch hoặc đại dịch đã
được ghi nhận trong suốt thế kỷ 20 như đại dịch cúm
Tây Ban Nha 1918, đại dịch cúm Hồng Kông năm
1968… và gần đây nhất là đại dịch cúm A/H1N1/2009
Virút cúm gia cầm A/H5N1 đã vượt qua hàng rào loài
gây bệnh cho một số động vật có vú khác như ngựa,
hổ và người… Các đột biến về di truyền là nguyên
nhân chính giúp virút cúm gia cầm A/H5N1 có thể vượt
qua hàng rào loài và có thể là tiềm tàng của các vụ
dịch/ đại dịch cúm cho người trong tương lai Nghiên
cứu tìm hiểu sự tiến hóa thông qua việc phân tích đặc
điểm vật liệu di truyền của virút cúm A/H5N1 phân lập
trên người tại miền Bắc Việt Nam trong những năm
2003-2008 sẽ phần nào giúp tìm hiểu khả năng tiến
hóa của virút và hiệu quả của vaccine (nếu có) để góp
phần phòng bệnh có hiệu quả
Đặc điểm di truyền học trong kết quả của chúng tôi
đã cho thấy: clade 1 và clade 2.3.4 tương ứng với đặc
tính kháng nguyên là các kiểu gen (genotype) chính
lưu hành trên các virút cúm A/H5N1 gây bệnh cho
người tại miền Bắc cũng như toàn lãnh thổ Việt Nam
Nghiên cứu của Wan và cs [5] trên toàn bộ các virút
cúm gia cầm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam trong giai
đoạn 2001-2007 cho thấy có 9 loại kiểu gen (từ
genotype 1 – VN1 đến genotype 9 – VN9) tương
đương với 6 kiểu hình kháng nguyên (clade 0, clade 1,
clade 2.3.2, clade 2.3.4, clade 3, và clade 5) nhưng chỉ
có clade 1 và clade 2.3.4 được ghi nhận gây bệnh cho
người tại Việt Nam
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trong hầu hết
các phân đoạn gen của virút cúm A/H5N1 đều nhóm
vào 2 nhóm chính là clade 1 và clade 2.3.4 Tuy nhiên
tại gen NA các virút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu lại
nhóm vào 3 phân nhóm chính là clade 1, clade 2.3.2
và clade 2.3.4 Kiểu hình 2.3.2 cùa virút cúm A/H5N1
trong nghiên cứu này được ghi nhận tại các virút phân
lập trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc trong
cùng thời gian, kết quả trên cho phép nghĩ đến sự đột
biến, trao đổi và tích hợp giữa virút cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh cho người và gia cầm vẫn đang tiếp tục, khả năng tiềm tàng xuất hiện một kiểu hình kháng nguyên mới là có thể [1] Vì vậy, việc theo dõi, kiểm soát sự tiến hóa của virút cúm gia cầm A/H5N1 là một công việc cần thiết trong hoạt động phòng chống cúm gia cầm tại Việt Nam
KếT LUậN
- 7 phân đoạn gen (HA, NP, M, NS, PB1, PB2 và PA) của virút cúm A/H5N1 đều thuộc 2 kiểu hình kháng nguyên là clade 1 và clade 2.3.4
- Phân đoạn gen NA virút cúm A/H5N1 biểu hiện trên 3 kiểu hình kháng nguyên là clade 1, clade 2.3.2
và clade 2.3.4 tương tự với virút cúm gia cầm A/H5N1 lưu hành trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc trong cùng thời gian
TàI LIệU THAM KHảO
1 Nguyen TD, Nguyen TV, Vijaykrishna D, Webter
RG, Guan Y, Peiris MJS and Smith GJD (2008), “ Multipe sublineages of influenza A virus (H5N1), Vietnam, 2005-2007”, Emerg Infect Dis, 14, pp 632-636
2 Wallace RG, Hodac H, Lathrop RH, Fitch WM (2007), “A statitistical phylogeography of influenza A H5N1”, Proc Natl Acad Sci USA, 104, pp 4473-4478
3 World Heath Organization (WHO) Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO, 16 March 2011 Available: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/ca ses_table_2011_03_16/en/index.html Accessed 2011 March 18
4 World Heath Organization (WHO) Recommendations and laboratory procedures for detection of avian influenza A (H5N1) virus in specimens from suspected human cases Available: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/ RecAIlabtestsAug07.pdf Accessed 2011 March 17
5 Xiu-Feng Wan, Tung Nguyen, C Todd Davis, Catherin B Smith, Zi-Ming Zhao, Margaret Carrel, Kenjiro Inui, Hoa T.Do, Duong T.Mai, Samadhan Jadhao, Amanda Balish, Bo Shu, Feng Luo, Micheal Emch, Yumiko Matsuoka, Stephen e Lindtrom, Nancy J Cox, Cam V Nguyen, Alexander Klimov, Ruben O Donis (2008), “Evolution of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza Viruses in Vietnam between 2001 to 2007”, PloS ONE, 3 (10), e3462
NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM VI KHUẩN HọC ở Đờm và dịch rửa Phế quản
qua nội soi Phế quản ống mềm ở bệnh nhân giãn phế quản
lý tuấn hồng - Bệnh viện 354
đặt vấn đề
Nước ta là một nước nông nghiệp, khí hậu nhiệt đới
gió mùa, đang trong giai đoạn phát triển, tỷ lệ trẻ suy
dinh dưỡng còn cao Vấn đề bụi, khí thải công nghiệp,
chất thải của bệnh nhân (Bn) và người lành mang mầm
bệnh, chất thải bệnh viện, cũng như ý thức phòng bệnh
của đại bộ phận người dân còn hạn chế nếu không
muốn nói là còn kém Do đó nhiễm khuẩn hô hấp, bệnh lao phổi, giảm không đáng kể, hậu quả là giản phế quản (GPQ) không giảm [1],
Các nước kém phát triển trong đó có vùng Tây – Nam Thái Bình Dương và Đông Nam á, GPQ còn là nguyên nhân nhập viện, tàn phế và tử vong không
