Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene

Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 2.1 Khái niệm về gốc tự do Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào q

2 Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa

2.1 Khái niệm về gốc tự do

Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung

cấp cho mọi hoạt động sống của con người

Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) 1,2

Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O2•–), đây là gốc

tự do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxyde (O2•–) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2 2,10,18

Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể 2,10

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy 9,10

2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể Nếu được kiểm soát, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm

trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt 2

2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc 2,38

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất

bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá

vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được 2,38

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên

ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng 1,2 Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân,

Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS)

sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis) Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress) Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa 5,38

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa

đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu Dưới đây chúng tôi xin giới thiệu một

số phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã được

sử dụng rộng rãi trong thực tế

2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH•

là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam 3,5,8,19,23,36,51

Ngày nay DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và

dễ ổn định

Nguyên tắc

Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

Hình 1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH

2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO

Trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên, vai trò của NO rất quan trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ thể, điều khiển cân bằng nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển quá trình tư duy và trí nhớ 2,33,39

NO được sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hưởng lên trương lực cơ bản của mạch não và góp phần điều hòa vận mạch khi bị kích thích Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não như bệnh: Alzeimer, thiếu máu não, đột quỵ 22

NO có một vai trò vô cùng quan trọng đối với cơ thể là tác nhân góp phần điều hòa huyết áp, ngoài ra NO còn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh Nếu quá nhiều NO được sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và ngược lại, nếu lượng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tượng tăng huyết áp 18

Sự rối loạn con đường chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ

NO tạo ra Những sự rối loạn này thường dẫn đến một số bệnh như: chứng tăng huyết áp, tiểu đường, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thương mạch máu Ngoài ra, khi lượng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành

N

N

NO2

O2N

NO2

NH

NO2

O2N

NO2

AH

DPPH

hhoa

DPPHH

chất nội độc tố và khi đó NO còn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ gốc tự do ONOO-, là gốc nitrite gây hại cho cơ thể 2,7,9,18

NO• + •O2- ↔ ONOO

-4NO• + O2 + H2O ↔ NO2- + H+

Nguyên tắc

NO phản ứng với oxi tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, hoạt chất ức chế NO sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm nitrit tạo thành trong dung dịch nước và nồng độ nitrite trong dung dịch nước được xác định bằng phương pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss Trong đó, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững và

có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành, ta tính được khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên %

ức chế) 5,8,33,39

Hình 2 Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss

Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong môi trường H3PO4 Cơ

N H 2

N O 2- H2O

NED NHCH2CH2NH2

 =540 nm

2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA

MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào

Nguyên tắc

MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm, phản ứng được thực hiện ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100oC trong thời gian từ 10 đến 15 phút Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức ta tính được khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu 3,5

Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:

Hình 3 Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric

Malonyl dialdehyd Acid thiobarbituric Phức

Trimethin

HN N

O

S H O

HN

N

O

H

N O

S N O H

-2 H2

t

o

2.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity)

Nguyên tắc:

Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Khi cho ion Fe2+ tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có cực đại hấp thu tại bước sóng  = 562nm 5,7,28

Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại ở dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin

2.4.5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 2.4.5.1 Giới thiệu

Xanthine oxidase (XO) là một loại enzyme giữ vai trò quan trọng trong quá trình thoái hóa của purine, nó đóng vai trò là chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine thành acid uric 5,7,38,51

2.4.5.2 Cấu tạo

Enzyme XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lượng là 300000 Da, trong đó mỗi monomer của protein tổ chức gồm 3 phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe2S2, một phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavin adenine dinucleotide (FAD) Trong đó phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe2S2 và FAD đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa được xúc tác bởi enzyme 21

2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO

Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase) Enzyme XO xúc tác cho

sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát:

RH + H2O ROH + 2H+ + 2e─

Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), và trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành được chuyển tới các tâm nhận electron trong enzyme 21

Với chất nền là xanthine, cơ chế phản ứng hydroxygen hóa dưới sự hiện diện của XO được các nhà khoa học đề nghị như sau 21:

Hình 4 Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric

2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO

Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2● Acid uric

có bước sóng cực đại hấp thu tại 290 nm Nếu mẫu thử có khả năng kháng

O

S

N

N N N

O

O H

H H

H

O

O

glu126

Mo S S O

O SH N N

N N O

O

H

H , e

Mo S S O

O S N N

N N O

O H

H H

HO , H e

Mo OH S

O S S

+

HN NH

NH N

O

O

OH

HN NH

NH NH

O

O

O Xanthine

Acid uric

VI

VI

Mo

S

S O

2

3 4

5 6 7

8 9

enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm giá trị mật độ quang

Hình 5 Phản ứng tạo acid uric Các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng như kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này được gọi là các chất kháng oxy hóa Chúng có thể được sinh ra từ cơ thể như hệ thống kháng oxy hóa có bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp như glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả như các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9

3 Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào

3.1 Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư ruột kết người DLD-1 được thu từ bộ sưu tập tế bào American Type và được nuôi cấy trong môi trường McCoy’5A có bổ sung các thành phần dinh dưỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trường CO2

5% tại 37oC Tế bào phục vụ cho thí nghiệm được rửa bằng PBS và tách khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2%

HN

O

NH N

+ H2O + 2 O2 XO HN

NH NH O

O+ 2O2 + 2 H