So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao

So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ NHƯ QUỲNH

SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ITRACONAZOL

TRONG CHE PHAM VIEN NANG

BẰNG PHƯƠNG PHÁPVI SINH VÀ

SẮC KI LONG HIEU NANG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2011

trong suốt quá trình em nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo cùng các anh chị kĩ thuật viên

trong Bộ môn Vi sinh , trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để

em có thê hoàn thành khóa luận của mình

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban và bộ môn trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình học tập tại trường và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin phép được dành lời cảm ơn tới cha mẹ, anh chị em, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh, ủng hộ động viên khích lệ em trong học tập, cuộc sống và hết lòng giúp đỡ em thực hiện khóa luận này

Hà Nội, thăng 5 năm 201 1

Sinh viên

Hoàng Thị Như Quỳnh

MỤC LỤC

DANH MUC CHU VIET TAT

DANH MUC CAC HINH

DANH MUC CAC BANG

1.2 Định lượng kháng sinh bằng phương pháp vi sỉnh

1.2.1 Phương pháp đo độ đục - nà sành ehhe

1.2.2 Phương pháp khuêch tán -.<-

1.3 Một số công trình nghiên cứu định lượng kháng sinh bằng

Bloassay HH Hàn HH hen nh kh như chà

CHUONG II : ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị -

2.1.1 Chât chuân và hoá chât -.

2.1.2 Thiết bị - dụng CỤ ch kêu

2.1.3 Mẫu nghiên CỨU c Ăn sài

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phuong phap vI sinh - <<

3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng HPLC

3.2.2 Thâm định phương pháp định lượng 1traconazol

3.3 So sánh kết quả định lượng của 2 phương pháp

Bioassay và HPLC .

KET LUAN VA KIEN NGH]

TÀI LIỆU THAM KHẢO - - << c5 << <<< << s2

chromatography Itraconazol

Relative standard deviation Standard deviation

Sabouraud Dextrose Agar

Don vi hinh thanh

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn

Thạch Sabouraud

Số thứ tự

Đường kính vòng ức chế thử theo sơ đồ 5x1 của ITZ

Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa đường kính vòng ức chế

(mm) va logarit néng d6 (ug/ml) cua ITZ

Sắc kí đồ dung dịch mẫu chuẩn

Sắc kí đồ dung dịch mẫu thử

Sắc kí đồ dung dịch mẫu trắng

Phé hap thu tử ngoại itraconazol

Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

Bảng 2 Ham lượng của ITZ trong các mẫu viên nang Sporal

xác định bằng phương pháp Bioassay (n=6) 19 Bảng 3 Độ tìm lại của ITZ trong thực nghiệm bỗ sung chuẩn

đánh giá độ đúng của phương pháp 20 Bang 4 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC 23 Bang 5 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 24 Bảng 6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC 25 Bảng 7 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày 26 Bảng 8 Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày 27

ĐẶT VẤN ĐÈ

Itraconazol (LTZ) là một tác nhân kháng nắm thuộc nhóm triazol, được

dung nạp tốt và có hoạt tính phổ rộng Hiệu quả điều trị cao của ITZ là do chất chuyển hóa chính của nó là hydroxy-ITZ, cũng có hoạt tính kháng nẫm đáng kế [6] Chế phẩm viên nang ITZ uống, hàm lượng 100mg, có sẵn trên thị trường Việt Nam: sporal (Janssen, Thái Lan), itcon (Sản xuất tại Ấn Độ), Fungex (Liên doanh sản xuất tại Việt Nam), .Khi hàm luong ITZ thap hon

so với phi trên nhãn, hóa trị liệu sẽ không đạt hiệu quả điều trị, gây hại cho

sức khỏe bệnh nhân

Phương pháp định lượng ITZ bằng phương pháp vi sinh (Bioassay) có thể cho chúng ta biết các thay đôi nhỏ, tinh vi của được chất, không thể chứng minh được bằng phương pháp hóa lý Bioassay cho phép đánh giá hoạt lực không chỉ của chất mẹ mà cả các chất chuyển hóa có hoạt tính và các được chất khác có trong thành phân, một yếu tố quan trọng trong việc kiểm nghiệm kháng sinh Ngoài ra Bioassay không cần đòi hỏi các trang thiết bị đắt tiền như HPLC Các nghiên cứu định lượng ITZ bằng phương pháp vi sinh (Bioassay) trước đây chủ yếu là xây dựng và thâm định phương pháp định lượng ITZ trong huyết thanh bằng Bioassay và HPLC, chưa thấy có ở chế phẩm viên nang

Để xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có thê áp dụng mô hình đường thẳng song (Parallel-line model) [1, 4, 5, 6ó, 8] và mô hình đường chuẩn Trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thử nghiệm theo mô hình đường chuẩn [2, 3]

Mục tiêu của phương pháp này là xây dựng và thâm định một phương pháp vi sinh để xác định hoạt lực của ITZ trong các chế phẩm viên nang thương mại Các kết quả của phương pháp này được so sánh với các kết quả

định lượng bằng HPLC trên cùng mẫu thử.

1.1.1 Tinh chat vat ly

Theo USP33-2010, itraconazol (ITZ) 14 mét hén hop racemic cua 4 đối

quang với tỷ lệ 1:1:1:1, có céng thirc phan tir C35H3gCl.N3O, va trọng lượng

phân tử 705,63 Itraconazol ở dạng bột trắng hơi vàng, nhiệt độ nóng chảy: 166-170°C, và phải bảo quản ở nhiệt độ phòng, trong lọ kín, tránh ánh sáng

hoặc (+)-1-[(RS)-sec-butyl]-4-[p-[4-[p-[[(2R,4S)-2-(2,4-dichlorophenyl])-2- (1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy ]Jpheny]]-1-

pIperazinyl]pheny]] v 1,2,4-triazolin-5-one)

Itraconazol là kháng sinh kháng nấm vừa có dạng tinh thể và đạng vô định hình, rất ít tan trong nước (1mcg/1ml hoặc ít hơn ở pH trung tính, 4 mcg/ml ở pH = 1), tan ít trong alcol, tan tốt trong dicloromethan, đồng thời là base yếu (pKa 3,7 trong dung dịch methanol) nên không hòa tan ngoại trừ dung môi là dung dịch có pH thấp nhu dich vi [5]

1.1.2 Tac dung duoc ly

Nghiên cứu in vitro cho thấy itraconazol ức chế hệ isoenzym cytochrom P450 3A4 (CYP3A4), là enzym xúc tác quá trình tổng hợp ergosterol, hợp

phần quan trọng của màng tế bào nấm

Itraconazol có hoạt tính phổ rộng ¡n vitro chống lại các nấm lưỡng hình: Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, một số loài cua chi Aspergillus nhu Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, các loài nấm men Candida albicans, va Cryptococcus neoformans Ngoai ra,

Itraconazol cũng có tác dụng chống lại Sporothrix schenckii, va các loài của

chi Trichophyton, Candida krusei, va cac loai khác của Candida

Itraconazol dùng đường uống có tác dụng kháng nấm trên các động vật

thực nghiệm khác nhau bị nhiễm các chủng nấm chuẩn ở các phòng thí

nghiệm Hoạt tính kháng nấm thể hiện rõ đối với các trường hợp nhiễm nấm lan toả gồm: Blastomyces dermatitidis, Histoplasma duboisii, Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii, Trichophyton rubrum va Trichophyton mentagrophytes

Itraconazol dùng đường uống với liều 2,5 mg/kg và 5 mg/kg đã tăng ty

lệ sống sót ở lợn Guinea bình thường và lợn bị ức chế miễn dịch nhiễm Aspergillius fumigafus lan toà Cũng sử dụng 1traconazol đường uống hàng

ngày với liều 40 mg/kg và 80 mg/kg đã làm tăng tỷ lệ sống ở thỏ bình thường

và chuột miễn dịch bị nhiễm Aspergillus fumigafus phối Itraconazol cũng có hoạt tính kháng nấm trên các mô hình động vật khác nhau bị nhiễm Candida albicans va cac loài khác của chi nấm này [Š]

1.1.3 Dược động học và chuyển hoá

Khi tiêm tinh mach itraconazol (200 mg/ngay/2 lần/ trong 2 ngày, sau

đó 200 mg/ngày/1 lần/ trong 5 ngày), sau đó cho dùng liều uống viên nang

Sporanox cho bệnh nhân nhiễm HIV ở giai đoạn tiến triển cho thấy nồng độ huyết tương ổn định đã đạt được sau 4 liều đối với itraconazol và 7 liều đối với hydroxy-itraconazol (chất chuyển hoá của itraconazol) Nồng độ huyết tương

én định đã được duy trì khi uống Sporanox 200mg/2 lần/ngày Thời gian bán thải trung bình của itraconazol ở trạng thái ổn định (sau khi uống hàng ngày với liều 100-400mg/ngày) là 30-40 giờ Có khoảng 93-101% hydroxypropyl- B-cyclodextrin đã được thải qua nước tiểu ở dạng không chuyển hoá, trong

vòng 12 giờ sau khi uống [5]

Liên kết protein huyết tương cua itraconazol 14 99,8% và của hydroxy- itraconazol là 99,5% Thể tích phân bố của itraconazol trung bình là 796 + 185

lí kg

Itraconazol được chuyển hoá chủ yếu bởi hệ isoenzym cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) và hình thành một số chất chuyển hoá, trong đó chủ yếu là hydroxy-itraconazol Các kết quả lâm sàng cho thấy itraconazol có thể chuyển hoá tối đa khi dùng liều cao Bài tiết qua phân dưới dạng ban đầu thay đổi từ

3-18% liều, qua thận nhỏ hơn 0,03% Khoảng 40% liều được bài tiết dưới dạng các chất chuyển hoá không hoạt tính qua nước tiểu Không một chất chuyển hoá nào được bài tiết vượt tỷ lệ 5% của 1 liều Độ thanh thải huyết

tương toàn phần của itraconazol trung bình 381 + 95 ml/phút Khoảng 80-90% của hydroxypropy]-B-cyclodextrin được thải qua thận [Š]

1.1.4 Chỉ định

Sản phẩm Sporanox dạng tiêm hoặc dung dịch uống được chỉ định cho các bệnh nhân giảm bạch cầu đa nhân trung tính bị sốt do nhiễm nấm Nhưng cần lưu ý rằng trong một thực nghiệm so sánh, tý lệ đáp ứng tổng thể của các

đối tuợng được điều trị bằng itraconazol là cao hơn đối với các bệnh nhân được điều trị bằng amphotericin B Tuy nhiên khi so sánh với các đối tượng được điều trị bằng ạmphotericin B, một số lượng lớn hơn các đối tượng được

điều trị bằng itraconazol phải ngừng điều trị do bị sốt liên tục và phải thay

- Bệnh do Blastomyces dermatitidis (blastomycosis) 6 phéi và ngoài phổi

- Bệnh do Histoplasma capsulatum (histoplasmosis) 6 cdc hang phéi m4n tinh

và phát tán, nhưng không chỉ định cho trường hợp bệnh ở não do 1traconazol không vượt qua được màng não

- Bệnh do Aspergillus (aspergillosis) ở phổi, ngoài phổi ở các bệnh nhân

không dung nạp hoặc không hiệu quả khi điều trị bằng amphotericin B [5] 1.2 Định lượng kháng sinh bằng phương pháp vỉ sinh

Phương pháp vị sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh khả năng ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi

là chủng chỉ thị) bởi những độ pha loãng đã biết của kháng sinh thử (chưa biết hoạt lực) với khả năng ức chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã biết rõ hoạt lực) Sự tăng hay giảm hoạt tính sinh học của

kháng sinh được thê hiện trên chủng chỉ thi, nén rất khó có thê phát hiện bằng

phương pháp hóa học Vì vậy định lượng kháng sinh bằng phương pháp vi sinh có một vai trò quan trọng trong việc kiêm nghiệm kháng sinh

Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm kháng sinh

là phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng

1.2.1 Phương pháp do quang

- Pha các dung dịch của mẫu chuẩn và mẫu thử: Dung dịch chuẩn và thử được pha trong dung môi thích hợp và được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho từng trường hợp riêng Có thể thiết kế thử

nghiệm theo mô hình đường thẳng song song hoặc theo mô hình đường chuẩn Với mô hình đường thăng song song phải pha 3 nồng độ chuẩn và 3 nồng độ thử Với mô hình đường chuẩn phải pha 5 nồng độ chuẩn va 1 nồng

độ thử (còn được gọi là mô hình thử 5x1)

- Pha hỗn dịch để cây truyền: tùy theo từng kháng sinh mà chọn chủng chỉ thị

để nuôi cây và pha hỗn dịch cấy truyên cho thích hợp

- Tiến hành: Các ống nghiệm được xếp thành từng nhóm, mỗi nhóm 3-5 ống, thêm vào mỗi ống Iml của các nồng độ dung dịch chuẩn hoặc thử Đặt các ống nghiệm vào giá theo qui tắc ngẫu nhiên theo khối hoặc hình vuông latinh

Trong mỗi giá có 2 ống nghiệm dùng kiểm tra, một ống cho 1ml hỗn hợp

dung môi và đệm phosphat pha loãng kháng sinh (mẫu trăng) và một ống cho 1ml hỗn hợp trên và 0,5 ml formaldehyd 12% (tt/tt)

Thêm vào mỗi ống 9ml môi trường canh thang đã cấy truyền hỗn dịch

vi sinh vật chỉ thị Đặt giá ống nghiệm đã chuẩn bị xong vào tủ âm hoặc nồi

đun cách thủy ở nhiệt độ thích hợp (tùy thuộc vào kháng sinh và chủng chỉ thị) trong thời gian 3-4h Sau khi ủ, làm ngừng sự phát triển của vi vi sinh vật bằng cách thêm vào mỗi ống 0,5ml dung dịch formaldehyd (trừ ông kiểm tra

đã thêm formaldehyd từ trước), hoặc nhúng giá ống nghiệm đã ủ vào nước sôi Xác định độ truyền qua hoặc độ hấp thụ của các nồng độ kháng sinh bằng máy đo quang ở bước sóng 530 nm,

- Đánh giá hoạt lực: tùy vào mô hình thiết kế thực nghiệm để đánh giá hoạt

lực của mẫu thử theo phụ lục 13.10 [2]

1.2.2 Phương pháp khuếch tán

- Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: tương tự phương pháp đo độ đục, định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán có thê được thiết kế theo mô hình đường thắng song song và mô hình đường chuân Với mô hình đường thẳng song song, để xác định hoạt lực kháng sinh, dùng 3 liều khác

13

nhau của chất chuẩn mang so sánh với 3 liều khác nhau của mẫu thử, có hoạt

lực được coi như chất chuẩn Nông độ các dung dịch được pha theo cấp số

ức chế sắc nét nhất tương ứng với các liều lượng của kháng sinh Với chủng

vi sinh vật không sinh bào tử, thường phải cây vào môi trường thạch đã đun

chảy hoàn toàn và để nguội 45-50°C Trường hợp hỗn dịch chủng là bào tử,

nhiệt độ cho phép cấy tối đa là 65-70°C Dùng một lượng thích hợp môi trường đã cây chủng chỉ thị, rót một cách vô khuẩn vào đĩa Petri hoặc khay kính (đã có lớp thạch nền hoặc không tùy theo yêu câu của từng kháng sinh)

để được một lớp môi trường có độ dày thích hợp Khay kính hoặc đĩa Petri được giữ ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng

- Tiến hành thử: Đối với thử nghiệm 3 liều, dùng 6 ống trụ vô khuẩn, đặt lên mặt thạch đã chủng vi sinh vật chỉ thị Có thê thay các ống trụ băng cách đục các giếng thạch có đường kính 6mm, hoặc các khoanh giấy tâm kháng sinh Cho các dung dịch kháng sinh thử và chuẩn vào các ống trụ hoặc các giếng thạch theo sơ đồ bố trí thí nghiệm đã chọn Bồ trí các ống trụ, khoanh giấy hay các giếng thạch sao cho các vùng ức chế không bị trùm lên nhau Nếu dùng khoanh giấy phải tiêu chuân hóa trước thể tích chính xác chất lỏng cho mỗi khoanh giấy Giữ các hộp Petri hoặc khay ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1-4h, tùy theo đặc tính của mỗi kháng sinh Sau đó các đĩa hoặc khay được ủ

ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Ðo đường kính vùng ức chế bằng thước kẹp palme, với độ chính xác tối thiêu 0,1mm

- Đánh giá hoạt lực: Tiến hành kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính

hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 10.13 [2]

1.3 Một số công trình nghiên cứu định lượng kháng sinh bằng Bioassay

- Vaucher L C và Cs (2006) đã nghiên cứu xây dựng và thấm định được phương pháp định lượng telithromycin bằng phương pháp vi sinh Bằng việc

áp dụng phương pháp khuếch tán, sử dụng các ống trụ đặt trên các đĩa thạch, theo thiết kế thử nghiệm 3 liều, dải nồng độ nghiên cứu 0,25-1,0ug/ml và ching vi sinh vat kiém dinh 14 Micrococcus luteus ATCC 9341 da cho thay: các đồ thị đáp ứng của dung dịch chuẩn và dung địch thử đều song song và tuyến tính với hệ số tương quan r = 0,9987, độ chính xác khác ngày - 2,67%, các giá trị tìm lại dao động trong khoảng 96,75-100,91% Bước đầu nghiên cứu độ ôn định cho thấy, phương pháp vi sinh là đặc hiệu đối với việc xác định telithromycin trong sự có mặt các sản phẩm phân hủy của dược chất này Phương pháp cho phép định lượng telithromycin trong các chế phẩm được và

có thê được dùng cho việc phân tích được chất trong kiểm soát chất lượng thuốc thường qui [15]

- Queiroz K M., và Cs (2009) cũng đã xây dựng và thâm định được phương pháp định lượng fluconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh Các tác giả đã sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch, chủng vi sinh vật kiểm định Candida albicans ATCC 18804, thực nghiệm thiết kế theo

mô hình đường chuẩn Kết quả thâm định phương pháp đã cho thấy đường chuẩn đảm bảo yêu cầu về độ tuyến (r” = 0,9995) Độ chính xác (4,0% - trong ngày và 4,5% - khác ngày) và độ đúng (độ tìm lại trung bình 102,9%) thỏa mãn yêu cầu của phương pháp định lượng Phương pháp HPLC được chọn đê

so sánh cho thấy: kết quả xác định hàm lượng của 2 phương pháp đối với 4 mẫu viên nang, có mối tương quan mạnh, được xác định bởi giá trị hệ số tương quan Pearson (r=0,9884) Các tác giả đã kết luận: Bioassay là một

15

phương pháp thích hợp cho cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu và sản xuất

chế phẩm fluconazol [9]

- Với thiết kế thử nghiệm 3 liều, áp dụng phương pháp khuếch tán trên thạch,

sử dụng chủng chỉ thi Candida albicans ATCC 10231, Staub I va cong su (2005) da xay dung va thâm định được việc định lượng ketoconazol trong các chế phẩm dược và dầu gội bằng phương pháp vi sinh Kết quả thâm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ tuyến tính (r = 0,9982), độ chính xác (R.S.D = 2,57%) và độ đúng Các kết quả đạt được bằng 2 phương pháp (Bioassay & HPLC) đã được đánh giá thống kê, bằng việc phân tích biến ANOVA, cac két qua dat duoc cho thay khéng có sự khác nhau có ý nghĩa giữa 2 phương pháp này [12]

- Souza M J E và cộng sự (2007) đã xây dựng và thâm định được phương pháp định lượng thuốc bột tiêm natri ceftiofur (một kháng sinh cephalosporin phố rộng thế hệ 3) bằng Bioassay Sử dụng phương pháp khuếch tán (dùng các ống trụ đặt trên bề mặt thạch), với chủng chỉ thị Micrococcus lufeus ATCC 10240, thiết kế theo thử nghiệm 3 liều (với khoảng nồng độ khảo sát 2,0-8,0ug/mI) Kết quả thâm định đã cho thấy phương pháp đạt độ tuyến tính tốt (r= 0,999§8), độ chính xác cao (R.S.D trong ngày đạt 0,8%; khác ngày 1,0%) Phân tích phương sai và đánh giá S/wdenf”s t-test cho thay két qua 2 phương pháp Bloassay và HPLC không khác nhau có ý nghĩa [I I]

- Bằng việc áp dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (các ống trụ đặt trên

mặt thạch), thiết kế thử nghiệm theo mô hình song song (trên dải nồng d6 8,0-

32,0ug/ml) voi chung chi thi la Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Schmidt và cộng sự (2008) đã xây dựng và thầm định được phương pháp định lượng ceffazidim trong bột thuốc tiêm (một kháng sinh ho cephalosporin, nhóm ÿ-lactam) với hệ số tương quan tuyến tính r” = 0,999998, độ chính xác trong ngày RSD = 1,11%%, độ chính xác khác ngày RSD = 1,37%, và độ chính

xác khác người phân tích là 1,41% Đồng thời phương pháp đã đáp ứng tốt yêu cầu về độ đúng Độ đặc hiệu của Bioassay cũng được đánh giá bằng việc phân tích các mẫu phân hủy ở 50°C và các kết quả được so sánh với một phương pháp sắc ký lỏng của được điển ở các mốc thời gian 0, 24, và 48h Kết quả đã cho thấy tính hợp lý của phương pháp xây dựng, cho phép định lượng chính xác ceftazidim trong chế phẩm dược, và có thể sử dụng như một phương pháp thay thế hữu ích để phân tích ceftazidim trong việc kiểm soát chất lượng thông thường [10]

- Để tối ưu hóa định lượng terbinafin (một kháng sinh khang nam) bang phương pháp vi sinh, Cardoso S G và cộng sự (2000) đã áp dụng phương pháp khuếch tán, bằng việc sử dụng các ống trụ đặt trên bề mặt thạch, với thiết kế theo thử nghiệm 3 liều (khoảng nồng độ khảo sát 0,125-0,5Iip/m]) và chủng vi sinh vật chỉ thị là Aspergillus flavus ATCC 15546 Kết quả các tác giả đã xây dựng và thâm định được phương pháp định lượng terbinafin trong chế phẩm viên nén và kem (tablets and creams): phương pháp đạt yêu câu về

độ tuyến tính (r= 0,9999), độ chính xác (trong ngày: CV = 0,48% đối với viên nén, và 0,43% đối với dạng kem; khác ngày: CV = 0,98% đối với viên nén, và 0,64% đối với dạng kem) và độ đúng Phương pháp cũng cho thấy các kết quả xác nhận độ chính xác, khác nhau không có ý với các kết quả của phương pháp HPLC và phương pháp đo quang Nhóm các tác giả đã kết luận: Bioassay là phương pháp thích hợp cho việc định lượng hoạt tính kháng nấm

in vitro của terbinafin [3]

- Dé xây dựng phương pháp định lượng ketoconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh, Lima P M A và cộng sự (2009) đã sử dụng

kỹ thuật khuếch tán trên thạch, với chủng vi sinh vật kiếm định là Candida albicans ATCC 18804 và dai nồng độ khảo sát 9,77-156,25ug/ml Kết quả thâm dinh cho thay phuong pháp đã đáp ứng yêu cầu về độ tuyến tính (rˆ >

17

0,99), độ chính xác (RSD = 2,42% đối với độ chính xác trong này, và 2,69% đối với độ chính xác khác ngày) và độ đúng (giá trị thu hồi trung bình = 103+1%) Đánh giá thống kê bằng Student’s t-test cho thay su khdc nhau không có ý nghĩa giữa các kết quả của Bioassay và HPLC (P < 0,05) Các kết quả về hàm lượng thu được của 3 mẫu viên nang, bằng 2 phương pháp cho thay có mối tương quan mạnh, được minh chứng qua giá trị của hệ số Pearson (r = 0,9998), đồng thời cũng là bằng chứng về sự tương hợp giữa 2 phương pháp nghiên cứu [6]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Chất chuẩn và hóa chất

- Itraconazol: Chuan nha san xuat, ham lượng: 99,53%; Độ âm: 0,21%

- Acetonitril (HPLC), Kali dihydrophosphat, Dikali hydrophosphat, Kali hydroxyd Nuéc cat 2 lan, Dimethylsulfoxid (DMSO) tiéu chuan phan tich, Trung Quéc

- Ching nam kiém dinh: Candida albicans ATCC 10231, mua tại Viện kiém nghiệm thuốc Trung ương

- Môi trường SDA 2% với thành phân cho một lít như sau:

- Can phan tich: Mettler — Toledo AB204; d 0,1 mg

- Cân kỹ thuật: Sartorius TE412; d 0,01g

- Máy đo pH, máy lắc siêu âm, máy lọc nước, các loại bình định mức và pipet loại A

2.1.3 Mẫu nghiên cứu

- Viên nang Sporal (100 mg 1traconazol/viên)

- SDK: VN-10211-05 Số lô: 043008 NSX:26/08/10 HD: 26/08/13

- Sản xuất tại: OLIC (THAI LAND) LIMTED

19

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với 3 nội dung sau:

- Xây dựng và thâm định phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang sporal bằng phương pháp vi sinh

- Xây dựng và thâm định phương pháp định lượng itraconazol trong chế pham viên nang sporal bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- So sánh kết quả định lượng của 2 phương pháp

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phuong phap vi sinh (Bioassay)

Pha dung dịch chuẩn:

Dung dịch chuân gốc 160ug/ml: cân chính xác 8,0mg chất chuẩn tham chiếu, pha vào bình định mức 50ml bằng DMSO Pha tiếp bằng DMSO để được dung dich 16 pg/ml Từ dung dịch này pha loãng bằng nước cất tiệt trùng để có dung dịch 1,6 ug/ml, được dùng để pha loãng gấp đôi kế tiếp tới 0,1 ug/ml

Cac dung dich chuẩn có nồng độ: 1,6 (S1); 0,8 (52); 0,4 (R: nồng độ tham chiếu); 0,2 (S4) và 0,1 (S5) ug/ml

Pha dung dịch thử gốc của viên nang 160 ug/ml tương tự chuẩn tới nồng độ 0,4 ug/ml (tương tự nồng độ tham chiếu R) Các nồng độ chuẩn va thử được pha ngay trước khi thử

Ching vi sinh vat kiém định: Candida albicans ATCC 10231 được nuôi cây trên môi trường thạch nghiêng SDA 2%, bảo quản ở 4°C Trước khi sử dụng, cây truyền chủng sang môi trường thạch nghiêng SDA mới, ủ ở 37°C, trong 24h Sau giai đoạn này một lượng nhỏ nắm men được chuyên vào dung dịch nước muối sinh lý đã tiệt trùng và độ truyền qua (trên máy quan phô UV-VIS 1900) được hiệu chỉnh tới 85%, ở A 520nm (tương duong 1-5x10° CFU/ml)