ĐẬT VẤN ĐỂCây Ô đầu là một cây thuốc quý, các bộ phận dưới mặt đất của nó như củ cái Ô đầu và củ nhánh Phụ tử là những vị thuốc quý, có tác dụng cải tử hoàn sinh đã được sử dụng khá phổ
Trang 1BỘ YTẾ
BÙI LAN PHƯƠNG
NGHIÊN c ứ u THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÁC BỘ PHẬN • • •
TRÊN MẶT ĐẤT CỦA CÂY Ô ĐẦU SA PA
(Aconitum carmỉchaelii Debx.)
Hà N ộ i-2007
\
'¥
Trang 2M ồ i e ả n t đ iL Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô giáo, bạn bè và gia đình.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- TS Phạm Văn Thanh, trưởng khoa Hoá thực vật, Viện Dược liệu.
- Ths Bùi Hồng Cường, công ty Traphaco.
Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đê tài này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Hoà Bình, giảng viên Bộ môn Dược học cổ truyền đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xỉn gửi lời cảm ơn chân thành tới:
- Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và các cô, chú, anh, chị công tác tại khoa Hoá thực vật, Viện Dược liệu.
- Các thầy cô giáo trong Bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội.
- Các cô, chú, anh, chị trong phòng Kiểm tra chất lượng, công tỵ Traphaco.
Là những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ten cha mẹ, bạn bè, người thân đã luôn ủng hộ, động viên đ ể tôi có được ngày hôm nay.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!
Hà Nội tháng 5 năm 2007
Sinh viên Bùi Lan Phương
Trang 31.2.3 Phương pháp kiểm định Alcaloid
1.3 Tác dụng sinh học
1.3.1 Tác dụng sinh học của Phụ tử
9 9
10
10 11
11
11
11
Trang 42.1.3 Phương pháp nghiên cứu 13
Trang 5Diester alcaloidHigh performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệunăng cao)
MethanolMẫu thử Nhà xuất bảnPhụ tử sốngSắc ký lớp mỏngTrung bìnhUltraviolet (tử ngoại)
Trang 6ĐẬT VẤN ĐỂ
Cây Ô đầu là một cây thuốc quý, các bộ phận dưới mặt đất của nó như
củ cái (Ô đầu) và củ nhánh (Phụ tử) là những vị thuốc quý, có tác dụng cải tử hoàn sinh đã được sử dụng khá phổ biến trong y - dược học cổ truyền phưoỉng
Gần đây đã có một số tài liệu nước ngoài công bố nghiên cứu về các bộ
phận trên mặt đất của một số loài thuộc chi Aconitum L cho thấy chúng cũng
có chứa một số thành phần hoá học giống với Phụ tử như các alcaloid, flavonoid Nhưng những công trình nghiên cứu về vấn đề này còn rất ít [17], [18], [19], [21], [22],
Cây Ô đầu đã được trồng ở Việt Nam từ những năm 70 của thế kỷ trước Sau chiến tranh biên giới (1979), cây Ô đầu bị triệt phá và mất giống hoàn toàn Từ năm 1990, chúng đã được nhân dân Sa Pa phục hồi lại.Trong điều kiện sinh thái của vùng Sa Pa thì thành phần hoá học của cây Ô đầu có thể sẽ khác đi Gần đây, một số nhà khoa học của Việt Nam đã nghiên cứu về
một loài Ô đầu ở Sa Pa có tên khoa học là Aconitum carmichaelii Debx Họ
rễ củ, chưa có nghiên cứu nào về các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa
Trang 7Phần 1: TỔNG QUAN1.1 Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L.
1.1.1 Vị trí phân loại [5]
Chi Ô đầu {Aconitum L.) thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ
Hoàng Liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lófp Mộc Lan (Magnoliopsida), ngành Mộc Lan (Magnoliophyta)
1.1.2 Phân loại chi Aconitum L.[16], [25]:
Được sắp xếp thành 3 phân chi:
1.1.3 Phân bố:
Chi Aconitum L có khoảng 400 loài phân bố chủ yếu ở các vùng ôn
đói ấm Bắc Bán cầu, có nhiều nhất ở Trung Quốc (trên 200 loài) [25]
ở Việt Nam , cây Ô đầu có ở Sa Pa (Lào Cai) và một số noi ở tỉnh Hà Giang, Lai Châu [1], [14]
1.1.4 Nguồn gốc cây Ô đầu trồng ở Sa Pa ( Lào C a i) hiện nay:
Tên khoa học của cây Ô đầu ở Sa Pa hiện nay đã được xác định là
Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam hiện nay có xuất xứ nhập nội từ hai nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc, được trồng đầu tiên ở Sa Pa từ những năm 70 của thế kỷ trước, còn được trồng
ở Bắc Hà ( Lào C a i), Sìn Hồ ( Lai Châu ) Nguồn thứ hai do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ và Đồng Văn (tỉnh Hà Giang) tự động nhập giống Ô
Trang 81.1.5 Bộ phận dùng:
Rễ củ: Củ cái gọi là Ô đầu, chỉ được dùng ngoài Củ nhánh gọi là Phụ
tử được chế biến thành Phụ tử chế để dùng trong
1.2 Thành phần hóa học:
Đến nay đã có tới hàng trăm công trình nghiên cứu về thành phần hoá
học của chi Aconitum L., trong đó có ít nhất 96 loài đã được nghiên cứu.
Trong số đó thì chủ yếu các công trình nghiên cứu về phần rễ củ (Ô đầu, Phụ tử), chỉ có ít công trình nghiên cứu về bộ phận trên mặt đất của một số loài
Aconitum spp ĩửin Aconitum vulparia [23], Aconitum napellus [18], [19], Aconitum leaveỴll].
Thành phần hoá học chính trong chi Aconitum L là alcaloid, flavonoid,
ngoài ra cũng có một số chất thuộc nhóm polysaccharid, glycosid
1.2.1 Thành phần hoá học của rễ củ ( Ô đầu, Phụ t ử ):
Các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhưng độc tính cao thuộc nhóm alcaloid, trong đó được quan tâm nhiều nhất là các alcaloid diterpenoid Một số tác giả đã phân lập được một số alcaloid thuộc các nhóm khác, đặc biệt là l-benzyl- tetrahydroisoquinolin và aporphin là những alcaloid có hoạt tính sinh học mạnh [16]
a Alcaloid diterpenoid.
Là nhóm alcaloid đặc trưng của chi Aconitum L và cũng là nhóm tạo
ra độc tính cao Căn cứ vào cấu trúc của khung diterpenoid, các tác giả đã chia
Diterpenoid alcaloid [16]
Gần đây, một số tác giả bổ sung thêm 2 khung ít gặp hơn: Cjg- Diterpenoid alcaloid [26] và khung Bisditerpenoid alcaloid [20]
Trang 9Căn cứ vào số liên kết ester vào khung diterpenoid, nhóm alcaloid này lại được chia thành 3 nhóm [15]:
- Nhóm 2: phân tử có 1 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid (monoester alcaloid) như benzoylaconin, benzoylmesaconin,
mesaconin,
b Alcaloid khác.
Là các alcaloid không có cấu trúc diterpenoid đặc trưng của các loài Ô
đầu, chúng bao gồm các isoquinolin (higenamin, N-demethyl-colletin và O-
methyl-armepavin) và các amin [16]
Vói các tài liệu thu thập được, đã có khoảng 400 alcaloid được phân lập
từ 80 loài thuộc chi Aconitum L [7].
* Hàm lượng alcaloid trong rễ củ của một số loài Aconitum L.
Hàm lượng alcaloid toàn phần, nhóm diesteralcaloid cũng như các
alcaloid trong chi Aconitum L khác nhau, tuỳ thuộc vào loài, thời kỳ thu hái,
bộ phận dùng , vùng trồng, nhiệt độ môi trưcmg trồng [16]
Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số alcaloid chính
Trang 10Bảng 1.1 Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số alcaỉoid chính trong củ của một số loài thuộc chi Aconitum L.
Tên, bộ
Alctp(%)
Diester
Tàiliệu
deoxyaconitin (0,013%), Aconitin (0,003%)
1,04-1,1
(0,14-0,16%), hypaconitin
16
Nhật Bản, Honshu
1.32
Trang 11A kusnezojfii Reichb.
Bắc Ô
1,3
- Polysaccharid: Tomoda và cs (1986) đã phân lập được 4
Debx có tác dụng hạ glulose huyết [30]
- Glycosid: Fuzinosid, Yokonosid glucosid [16]
1.2.2 Thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu
Các công trình nghiên cứu thành phần hoá học của phần trên mặt đấtcủa cây Ô đầu không nhiều Một số tác giả đã phân lập được một số Alcaloid diterpenoid và Flavonoid glycosid từ phần trên mặt đất (thân, lá, hoa ) của một
số loài Aconitum spp., chưa thấy có nghiên cứu nào về phần hạt.
I.2.2.I Alcaloid diterpenoid.
Một số Alcaloid diterpenoid được phát hiện từ hoa và phần trên mặt đất ( thân, lá, h o a ) của một số loài:
Aconitum napellus [18].
Aconitum racemulosum Franch var pengzhouense [31].
Trang 12Aconitum tanguticum [32].
+ Hàm lượng alcaioid: Có nghiên cứu về hàm lượng alcaloid toàn phần trong thân, lá của Aconitum episcopale Lévl ở Vân Nam (Trung Quốc) là 0,58%, alcaloid chính là delavaconitin chiếm 0,43% [16]
I.2.2.2 Flavonoid
Một số flavonoid glycosid được phân lập từ phần trên mặt đất ( thân, lá,
h o a ) và hoa của một số loài:
+ Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10].
1.2.3.2 Định lượng alcaloid toàn phần.
Bằng phương pháp acid - base [3], [29]
Tiêu chuẩn về hàm lượng alcaloid toàn phần: Trong Ô đầu phải chứa ít nhất 0,3% alcaloid toàn phần tính theo aconitin [3] Trong Xuyên ô chế, Thảo
ô chế phải chứa ít nhất 0,2% alcaloid toàn phần tính theo aconitin [29]
1.2.3.3 Định lượng diester alcaloỉd
Bằng phương pháp đo độ hấp thụ [29]
Trang 13Giói hạn diester alcaloid trong Xuyên ô chế, Thảo ô chế không được vưọt quá 0,15% tính theo aconitin [29].
I.2.3.4 Định lượng aconitin.
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10]
+ Giới hạn aconitin trong Phụ tử chế không được vượt quá 0,017% [3],[29]
a Aconitin rất độc, LD50 trên chuột nhắt trắng là l,8g/kg thể trọng
(đường uống) và 0,12-0,55g/kg thể trọng (đường tiêm) [16]
b Khi thủy phân aconitin thành benzoylaconin hoặc aconin có độc tính
thấp hơn Trên chuột nhắt trắng, LD50 của belzoylaconin cao gấp 200 lần
c Phụ tử sống: LDgo của Phụ tử sống Trung Quốc là 5,49g/kg thể trọng (đường uống) và 0,49-0,7 Ig/kg thể trọng (đường tiêm) [16]
Trang 14d Phụ tử chế: Bạch phụ Trung Quốc LD50 =45,00g/kg thể trọng; Phụ tử
diester alcaloid, các biểu hiện ngộ độc như ngộ độc aconitin: ban đầu là cảm
giác ngứa ran ở lưỡi, miệng và ngón tay' sau đó cơ thể mất cảm giác, tê liệt,
chảy dãi, buồn nôn, nôn, miệng, tứ chi và toàn thân tím tái, mạch chậm,
choáng váng, hồi hộp, tụt huyết áp, đại tiểu tiện không tự chủ, thân nhiệt hạ,
loạn nhịp tim, suy hô hấp, sốc và hôn mê [1], [15]
1.3.2 Tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu:
Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô
đầu hiện nay còn rất ít
+ Tác dụng chống oxy hoá: Flavonoid glycosid trong hoa của một số
loài Aconitum spp như A.napellus, A.paniculatum, A.vulparia [17] và
+ Tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase: của alcaloid trong phần
trên mặt đất của Aconitum laeve [27].
1.4 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền:
1.4.1 Phụ tử sống
dưới dạng cồn Ô đầu, dùng để chữa đau dây thần kinh ngoại biên, viêm phế
Trang 151.4.2 Phụ tử chế:
- Tính vị, quy kinh: vị cay, ngọt, tính rất nóng, rất độc, quy vào 3 kinh tâm, thận, tỳ [14], [29], vào cả 12 kinh [2]
- Công năng, chủ trị:
+ Hồi dương cứu nghịch: dùng trong trường hợp tứ chi lạnh, mồ hôi tự
+ Bổ hoả trợ dương: dùng trong trường hợp tâm thận dương hư, liệt dương [29]
+ Khứ hàn, giảm đau: dùng trong các chứng phong hàn, đau nhức xương khớp, chân tay lạnh [14]
+ Ấm thận hành thủy: dùng trong trường hợp viêm cầu thận mạn tính, hoặc chức năng thận kém, lưng gối đau lạnh [14]
+ Kiện tỳ vị: dùng trong trường hợp tỳ vị hư hàn, đau bụng tiêu chảy do hàn tà nhập lý [14]
+Kiêng kỵ: những người âm hư, dương thịnh; trẻ em; phụ nữ có thai, đang cho con bú không dùng [14] Không dùng chung vói Bán hạ, Bạch cập, Bối mẫu, Qua lâu nhân [3], [29]
1.4.2 Phần trên mặt đất:
Rất ít tài liệu đề cập đến việc sử dụng phần trên mặt đất của cây Ô đầu làm thuốc chữa bệnh
Dược điển Trung Quốc 2005 có chuyên luận “Thảo ô diệp” (Folium
Aconiti kusnezoffii) là lá khô của cây Bắc Ô đầu {Aconitum kusnezoffii
- Công năng: thanh nhiệt, giải độc, giảm đau
- Chủ trị: chứng sốt nóng, đau bụng ỉa chảy, đau đầu, đau răng
Trang 16Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ2.1 Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu.
2.1.1 Nguyên liệu:
Các mẫu nghiên cứu được lấy từ các bộ phận của cây Ô đầu Sa Pa có
2.1) do công ty cổ phần dược phẩm TRAPHACO cung cấp bao gồm:
- Thân được thu vào tháng 9-2004
- Hoa được thu vào tháng 9-2004
- Hạt được thu vào tháng 10-2004
- Lá được thu vào tháng 9-2004
- Phụ tử sống được thu vào tháng 9-2004
2.1.2 Phương tiện nghiên cứu
- Máy cân đo độ ẩm Prerisa (Thụy Sỹ)
- Máy quang phổ tử ngoại - khả kiến U-2010 (Hitachi) - Nhật Bản
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merck - Hitachi D7000
- Bản mỏng Silicagel 60P254 (Merck)
- Buret định lượng chính xác
- Các dụng cụ thí nghiệm hoá học
b Hoá chất nghiên cứu:
Hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật TPHCM
cung cấp
- Aconitin chuẩn của hãng Latoxan - Pháp
- Các hóa chất và thuốc thử khác ở Khoa Hoá thực vật- Viện Dược liệu
và phòng Kiểm ta chất lượng, công ty TRAPHACO
Trang 17Hình 2.1 Cây Ô đầu Sa Pa
Trang 182.1.3 Phương pháp nghiên cứu
M ẫu nghiên cứu: Thân, lá, hoa, hạt và phụ tử sống
5g bột dược liệu, thêm 20ml ether dầu hỏa, đun hồi lưu cách thủy trong 30
phút Lọc, thu dịch lọc, bay hơi dung môi đến đậm đặc được dung dịch A
- Định tính chất béo: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch A lên tờ giấy lọc, sấy khô
nếu thấy để lại vết dầu mỡ thì phản ứng dương tính
Kết quả: phản ứng dương tính vói Phụ tử và hạt
ứng dương tính khi thấy có màu xanh nâu
Kết quả: Phản ứng dương tính với thân, lá, hoa, hạt
- Định tính sterol: dịch A cô đến cắn, hòa tan cắn trong 2ml chloroform,
chỗ giáp giói xuất hiện màu xanh lục Lắc nhẹ, màu xanh khuếch tán lên trên
thì phản ứng dương tính
Kết quả: Phản ứng dưofng tính với Phụ tử, lá, hoa
Trang 19• Định tính flavonoid: lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 150ml, thêm 50ml cồn 90°, đun sôi cách thủy 15 phút, lọc:
+ Riêng với bột lá: dịch lọc đem bốc hơi trên cách thuỷ đến cắn,hoà tan cắn với 30ml nước nóng, lọc, bốc hơi dịch lọc tới cắn, hoà tan cắn với 30ml cồn 90°
- Phản ứng cyanidin: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho 5 giọt HCl đặc Đun sôi cách thủy trong vài phút Phản ứng dưofng tính khi dung dịch xuất hiện màu hồng hay đỏ
Kết quả: Phản ứng dương tính vói lá, hoa
- Phản ứng với FeClg 5%: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết, thêm 1-2 giọt dung dịch FeClj 5% Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch xuất hiện màu xanh đen
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu
- Phản ứng với kiềm: nhỏ một giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc rồi để cho khô Quan sát dưói ánh sáng thường không thấy có màu hoặc màu vàng
nhạt Hơ nhẹ lên miệng lọ NH4OH đặc Phản ứng dưoỉng tính khi thấy màu
chuyển sang vàng đậm hơn
Kết quả; Phản ứng dưcmg tính vói lá, hoa, hạt
+ ống 2: thêm vào đó vài giọt thuốc thử diazo mới pha Phản ứng
màu vàng nhạt
Kết quả: Phản ứng dương tính với cả 5 mẫu
• Định tính coumarin: lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 150ml, thêm 50ml cồn 90°, đun sôi cách thủy 15 phút, lọc:
Trang 20+ Riêng với bột lá: dịch lọc đem bốc hơi trên cách thuỷ đến cắn, hoà tan cắn với 30ml nước nóng, lọc, bốc hơi dịch lọc tới cắn, hoà tan cắn với 30ml cồn 90°.
dịch chiết Ống 1 thêm Iml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Đun cách thủy cả 2 ống đến sôi, để nguội Quan sát thấy ống 1 có màu vàng, ống 2 không thay đổi Thêm vào mỗi ống 2ml nước cất, thấy ống 1 vẫn có màu vàng nhưng nhạt hơn, còn ống 2 trở nên đục trắng Sau đó cho vào 2 ống một vài giọt HCl đặc Thấy ống 1 mất màu vàng và trở nên đục trắng giống ống 2 thì phản ứng dương tính
Kết quả: Phản ứng dương tính với cả 5 mẫu
- Phản ứng diazo hóa:
+ Chuẩn bị thuốc thử: hòa tan 0,9g acid sulfanilic trong 3ml HCl đậm đặc, pha loãng vói nước đến lOOml Lấy lOml dung dịch ngâm trong nước đá
phút Lắc đều , ngâm trong nước đá 15 phút
+ Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết dược liệu, kiềm hóa
thuốc thử diazo mới pha, phản ứng dương tính khi thấy dung dịch trong ống có màu vàng cam
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu
cồn, nhỏ thêm 1 giọt NajCOj Hơ nhẹ cho khô Lấy 1 miếng kim loại che đi một nửa vết, sau đó soi đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm, thấy phát huỳnh quang xanh Bỏ miếng kim loại ra, thấy nửa còn lại sáng dần lên cho đến khi bằng bên không che thì phản ứng dương tính
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu
Trang 21• Định tính tanin: lấy 5g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 30ml nước cất, đun sôi vài phút rồi lọc, thu dịch lọc được dung dịch B:
- Phản ứng vói FeClg: cho vào ống nghiệm Iml dịch B, thêm 1-2 giọt FeClj 5% Phản ứng dương tính khi thấy dung dịch trong ống có màu xanh đen
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho vào ống nghiệm Iml dịch B,
bông xuất hiện
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu
• Định tính acid hữu cơ: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch B ở trên và vài
Kết quả: Phản ứng dương tính vói cả 5 mẫu
• Định tính đường tự do: cho vào ống nghiệm 2ml dịch B ở trên, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A; 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun cách thủy 15 phút, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa đỏ gạch
Kết quả: Phản ứng dương tính với cả 5 mẫu
• Định tính acid amin: Lấy 2ml dịch B ở trên cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 0,5% đun cách thủy sôi 15 phút, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu xanh tím
Kết quả: Phản ứng dưofng tính với cả 5 mẫu
• Định tính glycosid tim:
+ Cho khoảng lOg bột dược liệu vào một bình nón dung tích 250ml,
thêm lOOml cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Gạn dịch lọc vào
cốc có mỏ dung tích lOOml, thêm vào dịch lọc 3ml dung dịch chì acetat 30% khuấy đều, để lắng tủa, lọc qua giấy lọc.Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống
Iml chì acetat vào dịch chiết, khuấy đều, lọc Kiểm tra tiếp cho tới khi dung
Trang 22dịch không còn tủa với chì acetat Chuyển dịch lọc trên vào bình gạn dung tích 250ml Chiết hỗn hợp glycosid bằng 25ml chloroform (chia làm 3 lần: lOml, lOml, 5ml) Lắc đều, gạn lấy lớp chloroform Gộp dịch chiết vào trong cốc có
mỏ, lắc đều Chia dịch chiết vào các ống nghiệm đã sấy khô, bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô cắn còn lại được tiến hành làm các phản ứng sau:
cắn ở trên 0,5ml anhydric acetic, lắc đều để thuốc thử hòa tan hết cắn Đặt
thành ống nghiệm Dịch lọc trong ống nghiệm được chia thành 2 lớp (lớp
chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá cây
Kết quả: Phản ứng dương tính với phụ tử, hoa, lá
90, lắc đều cho cắn được hòa tan hết Thêm vài giọt dung dịch sắt III chlorid
đặc theo thành ông nghiệm Phản ứng dương tính khi thấy ở mặt tiếp xúc giữa
2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá cây
Kết quả: Phản ứng dưofng tính với phụ tử
Kết quả: Phản ứng âm tính với cả 5 mẫu
