Nghiên cứu tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 32 123

Khoá luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32.123, - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Bước đầu nghiên cứu l

p m

B Ộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

: PGS.TS Cao Văn Thu : Bộ môn Vi sinh- Sinh học

HÀ NỘI, THÁNG 05/ 2006

m

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VÂN Đ Ể 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng s in h 2

1.1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh .2

1.1.3 Khái niệm về tính kháng kháng sinh 2

1.1.4 Phân loại kháng s in h 3

1.1.5 Sơ đồ mô tả quy trình sản xuất một kháng sin h 4

1.2 Đặc điểm về xạ khuẩn {Actinomycetes) 5

1.2.1 Đặc điểm c h u n g 5

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5

1.2.3 Phân loại Streptomyces 7

1.3 Cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh KS 7

1.3.1 Mục đích 7

1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8

1.3.3 Đột biến cải tạo giống 8

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn 9

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sin h 9

1.4.1 Khái niệm lên men 9

1.4.2 Các phưoỉng pháp lên men 9

1.5 Chiết tách và tinh ch ế 11

1.6 Một số nghiên cứu gần đây về vi sinh-kháng sin h 13

1.6.1 Sự tinh khiết và đặc tính của enzym sinh tổng hợp Cephalexin từ chủng Gluconobacter oxydans 13

1.6.2 Sản xuất KS Retamycin từ quá trình lên men có bổ sung chủng Streptomyces olỉndensis 14

1.6.3 Quá trình hấp phụ liên tục acid clavulanic .15

PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 21

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 28

2.2.1 Hình thái và phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32.123 28

2.2.2 Khả năng sinh tổng hợp KS của Streptomyces 32.123 trên 7 MT 30

2.2.3 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 31

2.2.4 Kết quả đột biến cải tạo giống 32

2.2.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp KS 34

2.2.6 Sự ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của K S 35

2.2.7 Chiết bằng dung môi hữu cơ 36

2.2.8 Trao đổi ion chiết xuất KS 36

2.2.9 Sắc ký lớp mỏng 38

2.2.10 Kết quả thử độ bền nhiệt của KS 39

PHẦN III; KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 40

3.1 Kết luận 40

3.2 Đề xuất 40

: Dung dịch

: Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn tính theo milimet

: Escherichia coli ATCC 25922

: (The International Streptomyces Project) Chương trình Streptomyces quốc tế

: Kháng sinh : Môi trường

: Pseudomonas aeruginosa VM 201 : Proteus mỉrabỉlis B V 108

: Salmonella typhỉ DT 220 : Shigella flexneri D T 122 : Sarcina lutea ATCC 9314 : Staphylococcus aureus A T C C 1228

: Vi sinh vât

ĐẶT VẤN ĐỂ

Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra tác dụng kháng sinh đầu tiên

của Penicillium notatum đối với Staphylococcus aureus Năm 1939, penicillin

được sản xuất thành công Kể từ đó, kháng sinh luôn được coi là thẩn dược, là thứ vũ khí vô cùng lợi hại trong cuộc chiến chống lại bệnh nhiễm trùng Thế giới nhanh chóng phát triển ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh Ngày càng nhiều kháng sinh mới được tạo ra và có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, nó cũng như con dao hai lưỡi Chính do việc sử dụng không hợp lý và lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến vi khuẩn ngày càng trở nên kháng thuốc Hơn nữa, bên cạnh lợi ích không thể không cảnh giác với những độc tính của nhiều kháng sinh có thể dẫn đến thương tật và tử vong Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải đẩy mạnh việc nghiên cứu, sản xuất nhiều kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng thuốc

Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới Vì vậy, tỉ lệ bệnh nhiễm trùng rất cao Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà nước ta vẫn chưa có điều kiện để phát triển ngành công nghiệp kháng sinh, mới chỉ dừng lại ở nghiên cứu cơ bản Nước ta có thuận lợi là hệ vi sinh vật rất phong phú, trong đó đáng

chú ý là xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Đó là một nguồn sinh kháng sinh

lớn vì trong số hơn 8.000 kháng sinh hiện nay thì có đến 80% từ xạ khuẩn,

trong đó hơn 50% là từ chi Streptomyces.

Do vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 32.123”

Chủng Streptomyces 32.123 do Bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại

học Dược Hà Nội phân lập Khoá luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau:

- Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 32.123,

- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh,

- Bước đầu nghiên cứu lên men ở qui mô phòng thí nghiệm,

- Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh

1.1.2 Cơ chê tác dụng của kháng sinh [3]

Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào v s v làm biến đổi các phản ứng đó Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau Có 6 kiểu chủ yếu:

- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào,

- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất,

- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN,

- Tác dụng lên sự tổng hợp protein,

- Tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp,

- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.3 Khái niệm vê tính kháng kháng sinh [2]

Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh

Về mặt sinh học người ta có các kiểu kháng thuốc khác nhau:

- Kháng thuốc nhiễm sắc thể: bao gồm kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc do đột biến

- Kháng thuốc ngoài nhiễm sắc thể: bao gồm khái niệm đa kháng thuốc

do nhân tố -R và các cơ chế di truyền như tải nạp, biến nạp, tiếp hợp

Ngoài ra còn khái niệm kháng chéo ở các vi khuẩn có cơ chế kháng như nhau đối với các chất kháng sinh có cấu trúc hóa học gần giống nhau.

Để hạn chế hiện tượng kháng kháng sinh cần phải tìm hiểu rõ về cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn, theo 3 cơ chế chủ yếu:

- Thay đổi vị trí đích tác dụng,

- Thay đổi cấu trúc thành tế bào,

- Tiết ra những enzym phân hủy thuốc

1.1.4 Phân loại kháng sinh [2], [4]

Có nhiều cách phân loại KS như; theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hoá học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hoá học là khoa học nhất, KS được chia thành các nhóm sau:

1.1.5 Sơ đồ mô tả quy trình sản xuất một kháng sinh [10]

Hình 1: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất một KS

1.2 ĐẶC ĐIỂM VỂ XẠ KHUẨN (ACTINOMYCETES)

1.2.1 Đặc điểm chung [ 6 ], [7]

> Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi

trong tự nhiên Đa số thuộc nhóm Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty) Xạ khuẩn có khả năng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, một số vitamin và acid hữu cơ Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật và cây trồng

> Đặc điểm cấu tạo tế bào:

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn khoảng từ 0,2 - 3 |Lim,

- Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 1 0 -2 0 nm ,

- Màng nguyên sinh chất dày khoảng 7,5 - 10 nm bao gồm 2 thành phần phospholipid và protein,

- Tế bào phân chia theo kiểu vô tính

> Sơ bộ phân loại xạ khuẩn:

- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách khỏi môi trường nuôi cấy + Hệ sợi của khuẩn lạc: khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.

- Khuẩn ty cơ chất; mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố: có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ

- Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử

+ Chuỗi bào tử có rất nhiều hình dạng khác nhau như: thẳng, sóng (hơi cong), móc câu, xoắn

+ Bào tử trần:

- Được hình thành do sự phân cách của sợi bào tử, là cơ quan sinh sản

chủ yếu của xạ khuẩn,

- Bào tử trần có thể có hình cầu, hình elipsoid, hình que hoặc hình trụ Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi từ 3 - 50 bào tử hoặc nhiều hơn,

- Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha)

> Đặc điểm sinh lý:

+ Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao Để phát triển

chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit

+ Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu của

chúng thường là 25- 30 °c, một số loài có thể mọc tốt ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu thường từ 6,8 - 7,5

+ Khả năng tạo sắc tố: sắc tố được tạo thành từ Streptomyces được chia

làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid

1.2.3 Phân loại Streptomyces [10], [16]

Có nhiều khóa phân loại Streptomyces khác nhau Tại hội nghị vi sinh vật

học thế giới lần X (tổ chức tại Mexico vào năm 1970), khóa phân loại của Shirling và Gottlieb được chọn làm khóa phân loại chính để phân loại chi

Streptomyces và đặt tên là ISP (The International Streptomyces Project) Khóa

phân loại ISP dựa trên các đặc điểm:

- Khả năng tạo sắc tố hòa tan,

- Khả năng tạo sắc tố melanoid,

- Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon

1.3 CẢI TẠO VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN s i n h KS [2], [9] 1.3.1 Mục đích

Các v s v thuần chủng dược phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn đất, nước, các mô thực vật ) thường có hoạt tính kháng sinh thấp và hiệu suất sinh tổng hợp không cao Do vậy một trong những nhiệm vụ hàng đầu của công nghiệp sẩn xuất kháng sinh là cải tạo giống vi sinh vật nhằm các mục đích sau:

+ Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

+ Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt hơn,

+ Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn,+ Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới tạo ra các liên kết mới, nhóm chức mới

1 3 2 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

Các v s v có sự biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, tạo ra các biến chủng khác nhau trong đó có biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 10 - 20% những biến chủng khác Cần phải chọn lấy các biến chủng có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp

1.3.3 Đột biến cải tạo giống

Các chủng xạ khuẩn mới phân lập, kể cả các chủng sau chọn lọc ngẫu nhiên thường có hoạt tính KS thấp và hiệu suất sinh tổng hợp không cao Do

đó để nâng cao năng suất sinh tổng hợp KS của các chủng này người ta thường dùng các tác nhân đột biến vật lý, hóa học hay sinh học gây đột biến nhân tạo

> Tác nhân đột biến:

+ Những tác nhân hóa học: hydroxylamin, nitrosoguanidin, acid nitrơ + Những tác nhân vật lý: tia rơnghen, tia nofron nhanh, ánh sáng tử ngoại

Các tác nhân trên khi sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các v s v , những cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi ở NST làm thay đổi tính trạng dẫn tới mất khả năng tạo KS (đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp KS (đột biến dương tính)

Đột biến bằng ánh sáng u v được sử dụng phổ biến trong di truyền chọngiống v s v Ánh sáng u v tác dụng chủ yếu lên acid nucleic, mạnh nhất là ở vùng 260 nm, dẫn đến hiện tưcmg dimer hóa timin, ở đây hai timin gần nhau được liên kết cộng hóa trị với nhau ở nguyên tử c số 5 và 6 Hậu quả là sao chép bị sai lầm vì ADN - polymerase dễ lắp một nucleotid không chính xác vào vị trí trên Do tác dụng của ánh sáng u v , trên sợi ADN cũng xuất hiện một dimer pyrimidin khác nhau gọi là quang sản phẩm 6 - 4, ở đây Q của pyrimidin 5’ (tymin hoặc cytosin) được liên kết của C4 của pyrimidin 3’ (thường là cytosin) Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên của ánh sáng u v

Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng gây chết và tần số phát sinh đột biến:

- Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi ba tham số là thời gian chiếu, khoảng cách chiếu và độ pha loãng bào tử Thường thì đột biến dương sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1 - 1%, còn đột biến

âm thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn

- Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng ánh sáng u v , nếu đem chiếu ánh sáng thường (bước sóng 320 - 480 nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50 - 80%

tế bào được phục hồi do tác dụng của men photolyase Hiện tượng này được gọi là quang phục hoạt

- Các yếu tố khác: ngoài các yếu tố trên thì nhiệt độ, pH, thành phần môi trường, trạng thái sinh lý của v s v đem đột biến cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiếu ánh sáng u v

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Nhiệm vụ của công tác bảo quản giống v s v là thực hiện các thao tác kỹ thuật cần thiết để cho giống v s v có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các v s v lạ

Hiện nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để giữ giống v s v Tùy theo các trang thiết bị và loại v s v cần giữ mà chúng ta có thể sử dụng phương pháp nào Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm đơn giản nhất

có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong tủ lạnh

1.4 LÊN MEN SINH TổN G HỢP KHÁNG SINH [2], [9], [11], [12] 1.4.1 Khái niệm lên men:

Lên men là quá trình nuôi cấy v s v trong các điều kiện thích hợp nhằm tạo ra những sản phẩm trao đổi chất từ chính các v s v Điều kiện lên men quyết định hiệu suất của quá trình sản xuất KS

1.4.2 Các phương pháp lên men:

Có 2 phương pháp lên men chính:

> Phương pháp lên men bề mặt:

Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy v s v trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay lỏng, v s v hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt của môi trường dinh dưỡng Vì vậy yêu cầu của công nghệ lên men bề mặt là bề mặt lên men phải rộng và lớp chất dinh dưỡng không quá sâu ( 2 - 1 0 cm), trong quá trình lên men cần quạt để tăng độ thoáng khí đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (có trường hợp 90 - 100%) để tránh khô bề mặt môi trường

- ư u điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp

- Nhược điểm: đòi hỏi mặt bằng lớn, khó cơ giới hóa và tự động hóa, hiệu suất thấp, giá thành cao do đó trong công nghiệp kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ sử dụng trong các phòng thí nghiệm để chọn giống

> Phưcmg pháp lên men chìm:

- Lên men chìm là kiểu lên men mà v s v phát triển trong không gian ba chiều của môi trường lỏng

- Giống v s v dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng

đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất

Vì vậy trước khi lên men cần có giai đoạn tạo giống Giống v s v được tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau

Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100 ml/500 ml), Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 501,

Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5 m^

- Tỷ lệ giống trong môi trường lên men: 1 - 10% Trong khi lên men có thể phải cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật ), chất điều chỉnh pH hay đệm pH nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men Tùy thuộc vào sản phẩm mà thời gian lên men có thể từ 5 - 120h, tuy nhiên hiệu qủa lên men tăng khi thời gian lên men được rút xuống

- ư u điểm: sử dụng triệt để môi trường dinh dưỡng, hiệu suất cao, tiết kiệm mặt bằng, dễ cơ giới hóa và tự động hóa.

- Nhược điểm: yêu cầu phải có thíêt bị chuyên dùng do đó chi phí đầu tư lớn, có nguy cơ bị nhiễm trùng toàn bộ

Tuy nhiên chính do có những ưu điểm vượt trội mà tuyệt đại đa số KS ngày nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên men chìm

Lên men chìm được chia làm 4 kiểu chính:

- Lên men gián đoạn (lên men mẻ, lên men có chu kỳ): quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín Tại thời điểm ban đầu, ta cấy giống v s v vào môi trường lỏng trong bình lên men, rồi tiến hành lên men trong điều kiện sinh lý tối ưu, trong suốt thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì, ngoài cấp oxy (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), chất điều chỉnh pH Trong quá trình lên men các thành phần trong dịch lên men biến đổi không ngừng Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong sản xuất acid amin, các KS,

- Lên men có bổ sung: thực chất là kỹ thuật chu kỳ phát triển của v s v

khi ta cho thêm MT mới vào dịch lên men một cách ổn đinh, thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra

- Lên men liên tục: quá trình lên men, môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời cùng lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men Quá trình này được xem như một hệ mở

- Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men việc rút bớt dịch lên men

và bổ sung MT dinh dưỡng không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định

1.5 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHÊ [2], [5]

KS là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men

KS có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men đồng thời có thể có

nhiều thành phần KS và các tạp chất khác, vì vậy phải chiết tách để lấy KS tinh khiết.

> Giai đoạn chiết xuất sản phẩm:

+ Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đofn hay hỗn hợp) để tách một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu

+ Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn được vào nhau

+ Các phương pháp chiết lỏng - lỏng: chiết đơn (chiết 1 lần), chiết lặp (chiết nhiều lần), chiết ngược dòng

> Giai đoạn tách sản phẩm:

+ Định nghĩa: là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng từng chất

+ Phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay dùng là:

Phương pháp chuyển pha: để chuyển một chất hay một số chất từ pha này sang một pha khác, người ta thường dùng một dung môi thích hợp Trong nhóm này có các phương pháp: chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký.Sắc ký: là nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Quá trình sắc ký thường gồm ba giai đoạn chính đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh, phát hiện ra các chất

Một số phương pháp sắc ký thường dùng trong sinh tổng hợp KS:

+ Sắc ký lớp mỏng:

Nguyên tắc: là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ

(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở

đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi

+ sắc ký trao đổi ion:

Nguyên tắc: dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng

1.6 MỘT SỐ NGHIÊN c ứ u GẦN ĐÂY VỂ VISINH-KHÁNG SINH:

1.6.1 Sự tinh khiết và đặc tính của enzym sinh tổng hợp Cephalexin từ

chủng Gluconobacter oxydans [13].

Cephalexin là một KS Cephalosporin nhóm ß-lactam Phương pháp thông

thường để sản xuất các KS này là gắn phân nhóm acyl vào vòng nhân, acid 7- amino-3-deacetoxycephalosporanic(7-ADCA) bằng con đường tổng hợp hoá học Phương pháp hóa học có nhược điểm là: qua nhiều giai đoạn, phải bảo vệ nhóm amin của tác nhân acyl và nhóm carboxyl của vòng nhân, loại bỏ yếu tố bảo vệ sau khi gắn ngoài ra còn gây ô nhiễm môi trường Những nghiên cứu

về việc sử dụng enzym đã mở ra một hướng đi mới khắc phục được các nhược điểm trên Một số enzym như: enzym sinh tổng hợp cephalexin (CSE), enzym thủy phân nhóm acyl của ampicillin, enzym thủy phân este của các a-amino acid xúc tác cho phản ứng gắn mà không cần bảo vệ các nhóm phản ứng.Bài viết này đề cập đến sự tinh khiết và các đặc tính của CSE sinh tổng hợp

từ chủng Gluconobacter oxydans 9324 Enzym này đã được tinh khiết đến 940

lần ở hiệu suất 12% Việc bổ sung D-phenylglycin vào môi trường lên men

chủng Gluconobacter oxydans ờ nồng độ tối ưu 3,5 (mg/ml) làm tăng nồng

độ CSE lên gấp 3 lần CSE có cấu trúc đơn phân tử Trên SDS-PAGE, enzym này đồng thể, hoạt tính là 440U/mg, phân tử lưcmg 68 kDa và trên cột sàng lọc

gel Superdex 200 là 70 kDa CSE trung tính, có điểm đẳng điện pl=7,l Hoạt

tính enzym cao nhất ờ khoảng pH 6,0-6,5 và ổn định nhiệt đến 40*^c, đánh giá qua việc định lượng cephalexin bằng phương pháp HPLC Enzym này chỉ xúc tác khi tiền chất có một nhóm a-amino tự do và nhóm carbonyl hoạt động,

như D-phenylglycin methyl este Dạng đồng phân hỗn hợp và dạng tả tuyền làm giảm khả năng xúc tác của enzym này.

Tuy nhiên: một nhược điểm nổi bật của các enzym gắn là có thể thủy phân nhóm acyl của sản phẩm mới tạo thành Kiểm soát được vấn đề này sẽ

mở ra khả năng áp dụng sản xuất công nghiệp các KS P-lactam theo con đường enzym đạt hiệu suất cao

1.6.2 Sản xuất KS Retamycin từ quá trình lên men có bổ sung chủng

Streptomyces olindensis [14]

Retamycin là một hỗn hợp KS anthracyclin có tác dụng chống khối u, hiệu quả trong điều trị bệnh bạch cầu cấp, tương tự dunorubicin và doxorubicin Hỗn hợp retamycin có dạng bột màu đỏ, ít tan trong nước, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ (methanol, cloroform) và được sinh tổng hợp

từ quá trình lên men chìm chủng Streptomyces olindensis.

Phương pháp lến men gián đoạn- bổ sung có ưu điểm là kiểm soát được tốc độ sinh trưởng riêng (|ix) trong từng giai đoạn nếu tiến hành bổ sung theo

tốc độ lũy thừa Qúa trình lên men chủng Streptomyces olỉndensỉs sinh tổng

hợp Retamycin gồm 3 mẻ Do KS là sản phẩm chuyển hoá thứ cấp nên tốc độ sinh trưởng riêng ảnh hưởng đến nồng độ KS tạo thành Hiệu suất của quá

trình đạt cực đại khi tiến hành tốc độ bổ sung theo luỹ thừa ở ịi^ thấp Tại mẻ 1: giá trị ỊLix dao động ở 0,03 (10% |Lix max) trong suốt quá trình bổ sung từ

21 đến 47h của lên men thì nồng độ KS đạt 3,0 đơn vị hấp phụ Hai mẻ sau do cao hơn làm giảm nồng độ KS Mẻ 2: |Lix=0,10 h ‘ trong giai đoạn bổ sung

từ 14-24h, nồng độ là 2,4 Đến mẻ 3: ỊLix =0,16 h'^ gần đạt giá trị tối ưu 0,17 h‘‘ thì nồng độ chỉ còn 0,7 Trong từng giai đoạn lên men, nghiên cứu còn quan sát đến sự biến đổi hình thái Có 4 hình dạng: bó, hạt, dạng sợi phân nhánh và không phân nhánh Kết thúc 2 mẻ đầu, tế bào phát triển chủ yếu ở dạng bó (khoảng 90% dạng bó và 10% dạng sợi) Đến mẻ 3 ở nồng độ KS thấp hơn, dạng bó giảm còn 75% và dạng sợi là 25% Điều này chứng tỏ bên cạnh tốc

độ phát triển tối ưu ảnh hưởng đến nồng độ sản phẩm, sự khác biệt về hình thái cũng có ảnh hưởng.

1.6.3 Quá trình hấp phụ liên tục acid clavulanic [15]

Acid clavulanic là một KS ß-lactam được sinh tổng hợp từ chủng

Streptomyces clavuligerus, có hoạt tính kháng khuẩn yếu nhưng lại kháng

được enzym ß-lactamase tránh sự phân huỷ vòng ß-lactam, giảm sự đề kháng của VK và mở rộng phổ tác dụng KS này được chiết từ dịch lọc ở dạng acid trong dung môi hữu cơ không đồng tan với nước hoặc hấp phụ qua cột trao đổi

anion Tuy nhiên KS không có nhóm kị nước mạnh, kém ổn định ở pH<5 và

>7, tốc độ phân hủy cao khi nhiệt độ tăng dẫn đến làm giảm hiệu suất trong quá trình tinh chế

Chu trình hấp phụ liên tục acid clavulanic có thể khắc phục được những nhược điểm trên Quá trình này có thể làm giảm trở kháng chuyển khối, hạn chế sự phân hủy KS thông qua giảm thời gian tiếp xúc bằng cách thu hồi KS liên tục Hơn nữa, quá trình lên men tiến hành trong bình khuấy tốt tránh được sự biến thiên nhiệt độ và pH, giảm đáng kể sự phân hủy sản phẩm so với các cột thông thường Ngoài ra, do quá trình liên tục cần lượng nhựa ít hơn nên giảm được chi phí

Động học hấp phụ và hệ số cân bằng của acid clavulanic trên nhựa trao đổi ion Amberlite IRA 400 trong chu trình clorid được sử dụng để đưa ra mô hình mẫu của một quá trình hấp phụ liên tục Mô hình này cho phép dự đoán được các thông số về hiệu suất, nồng độ và tinh chế So sánh giữa kết quả thực nghiệm và tính toán theo mô hình mẫu thì không thấy có sự khác biệt đáng kể, thấp hơn 17% Mô hình mẫu này cùng với các thông số thực nghiệm chủ chốt

sẽ trở thành công cụ hiệu quả góp phần tối uu hóa và nâng cấp quá trình tinh chế

Giống xạ khuẩn Streptomyces 32.123 đã qua phân lập, do Bộ môn Vi

sinh - Sinh học trường Đại Học Dược Hà Nội cung cấp

Bacillus cereus ATCC 9946

Sarcỉna lutea ATCC 9341

(E.coli) (P.mirabilis) (S.flexneri) (S.typhi) (P.aeruginosa)

(S.aureus)

(B.subtỉlis)

(B.pumilus) (B.cereus) (S.luteà)

> Các môi trường nuôi cấy:

Chú thích: - Đơn vị tính theo gam

- Tiệt trùng môi trường bằng hơi nước ở 121°c /20 phút

* Các môi trường lên men (MTdd): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch.

Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy vsv kiểm định

^ ^ ^ T l i à n h phần

MT

NaCl(%)

Cao thit (% )'

Pepton(%)

* Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trương ISPl đến ISP9),

Dung dịch muối vi lượng của ISP: FeS0 4.7H20 0,0Ig, MnCl2.4H20 0,lg, ZnS0 4.7H2Ơ 0,lg, nước cất vừa đủ lOOOml, pH = 7,0-7,2.

IS P l: Trypton 5,0g, cao nấm men 3,0g, nước cất 1000 ml, pH=7,0-7,2 trước khử trùng

ISP2: Cao nấm men 4,0g, dịch chiết Malt 10,Og, glucose 4,0g; nước cất 1000 ml;

+ Dung dịch A: pepton 20,Og; sắt amoni citrat 0,5g; Na2S2Ơ3 0,08g; K2HPO4

l,Og, nước cất vừa đủ 1000 ml

+ ISP6: Dung dịch A 36,Og; cao nấm men l,Og; nước cất vừa đủ 1000 ml, thạch 15g, pH = 7,0-7,2

ISP7: Glycerin 15,Og; L- tyrosin 0,5g; L-asparagine l,Og; K2HPO4 0,5g; MgS0 4 7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4.7H20 0,0Ig, dung dịch muối vi lượng

1,0 ml, thạch 20,Og; nước cất 1000 ml; pH=7,2-7,4

ISP9:

+ Các nguồn đường đã tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal (A)

1 D - glucose 4 D - manitol 7 Raffinose

2 Inositol 5 D - fructose 8 Rhamnose

3 D - xylose 6 L - arabinose 9 Saccarose

+ Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B) CUSO4 5H2O 0,69g; FeS0 4.7H20

> Dụng cụ và hóa chất:

• Máy móc thiết bị:

+ Tác nhân gây đột biến;

- Ánh sáng u v 254 nm nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V,

+ Máy lắc Taitec Bio - Shaker BR 300 Lf,

+ Tủ ấm Trung Quốc 30°c, 37°c, tủ ấm Đức,

+ Tủ lạnh,

+ Kính hiển vi điện tử (Viện vệ sinh dịch tễ TW),