Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô an pha chymotrypsin

Các yếu tô ảnh hưởng đến chất lượng và độ ổn định của chế phẩm thuốc tiêm đông khô a Các yếu tố thuộc về công thức > Dược chất Giống như các dạng bào chế khác, dược chất là thành phần qu

Thời gian thực hiện

: PGS.TS NGUYÊN VĂN LONG THS TĂNG THỊ DIỆU LINH

: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

X í nghiệp Dược phẩm Trung ương 1 : 7/2004-5/2006

HÀ NỘI - 5/2006

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới:

Thầy giáo PGS TS Nguyễn Văn Long

là người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Dưới sự hướng dẫn của thầy, em đã có điều kiện học tập và sáng tỏ rất nhiều điều trong thực hành cũng như lý thuyết.

Trong quá trình làm thực nghiệm và nghiên cứu, em cũng đ ã nhận được sự giúp

đỡ, tạo điều kiện của các thầy cô giáo, kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế, các anh chị đang công tác tại phòng Kiểm nghiệm và phòng Nghiên cứu phát triển, Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương I, đặc biệt là sự giúp đỡ của Thạc sỹ Tăng Thị Diệu Linh

Em xỉn cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu này.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, giúp đỡ em hoàn thành nhiệm vụ của mình.

Hà Nội, tháng 5 năm 2006

Sinh viên

Dương Thị Hồng Ảnh

Dược điển Việt Nam III khối lượng/khối lượng

Tá dược Dược điển Mỹ vừa đủ

Thể tích/thể tích

Xí nghiệp dược phẩm trung ương 2 a-chymotrypsin

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN 1-TổNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYM a-CHYMOTRYPSIN 2

1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo 2

1.1.2 Tính chất vật lý 2

1.1.3 Các phưcmg pháp định lượng (xác định hoạt tính) 2

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Chỉ định 3

1.1.6 Liều lượng và cách dùng 4

1.1.7 Chế phẩm 4

1.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐÊN HOẠT ĐỘNG, ĐỘ ổN ĐỊNH CỦA ENZYM PROTEIN VÀ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC 4

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưcmg đến hoạt động enzym 4

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưcmg đến độ ổn định của protein 5

1.2.3 Biện pháp làm tăng độ ổn định của protein 7

1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐÔNG KHÔ 8

1.3.1 Khái niệm, ưu nhược điểm của phưoìig pháp đông khô 8

1.3.2 Các giai đoạn trong quá trình đông khô 9

1.4 THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ 10

1.4.1 Khái niệm 10

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng và độ ổn định của chế phẩm thuốc tiêm đông k h ô 10

PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KÊT Q UẢ 16

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Phương tiện thực nghiệm 16

2.1.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 172.2 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN X É T 252.2.1 Nghiên cứu xây dựng công thức thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin

5000 đơn vị ƯSP/lọ 252.2.2 Nghiên cứu xây dựng các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế

thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP/lọ 362.2.3 Kết quả bước đầu nghiên cứu độ ổn định của thuốc tiêm đông khô

a-chymotrypsin 5000 đơn vị USPAọ 382.2.4 Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chế phẩm 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ X U Ấ T 43

ĐẶT VẤN ĐỂ

Viêm là một phản ứng tại chỗ của cơ thể, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân sinh ra Các thuốc chống viêm có cấu trúc Steroid và phi Steroid bên cạnh tác dụng chống viêm còn chứa đựng nhiều tác dụng không mong muốn như gây loét dạ dày tá tràng, suy giảm miễn dịch, dễ chảy máu Vì vậy, hiện nay trên thế giới đã mở ra một hướng mới sử dụng enzym có tác dụng chống viêm như trypsin, Chymotrypsin, papain, seratidopeptidase

a-chymotrypsin là một enzym đã được sử dụng làm thuốc chống viêm rất hiệu quả Tuy nhiên, do bản chất là protein, enzym này rất dễ bị phân huỷ trong quá trình bào chế cũng như quá trình bảo quản Phần lớn các chế phẩm chứa a-chymotrypsin trong nước đều có độ ổn định không cao Nhằm khắc phục nhược điểm này, a-chymotrypsin được bào chế dưới dạng thuốc tiêm đông khô

Ngày nay trên thế giói, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành khoa học công nghệ, ngành dược cũng đang trên đà phát triển mạnh mẽ Các kỹ thuật bào chế mới trong đó có đông khô, đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ bào chế các dạng thuốc Các chế phẩm đông khô không những bền vững, ổn định trong thời gian dài mà còn có tốc độ hoà tan nhanh Đông khô đã được ứng dụng để sản xuất các loại kháng sinh, hỗn hợp các vitamin, vaccin, thuốc chống viêm

Xuất phát từ thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài: ''Nghiên cứu bào

ch ế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsirí’'’ với mục tiêu:

• Xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin

5000 đơn vị USP/lọ

• Bước đầu nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm

• Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chế phẩm

PHẦN 1 - TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ ENZYM a-CHYMOTRYPSIN

1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo

- a-chymotrypsin là enzym thuỷ phân protein, được điêu chế bằng cách hoạt hoá chymotrypsinogen, chiết xuất từ tuyến tuỵ bò [6],[9],[39],[46]

- a-ehymotrypsin có phân tử lượng 21600, được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptid liên kết với nhau bằng các cầu disulfid, số lượng các acid amin là 241 [4],[9]

- a-chymotrypsin thuộc nhóm serin-protease, ưu tiên cắt các liên kết peptid ở gần các acid amin có nhân thcím Trung tâm hoạt động gồm gốc histidin-57 được khu trú giữa gốc aspartic-102 và serin-195 Ba gốc này nối với nhau bằng liên kết hydro tạo thành phức hợp “di chuyển điện tích” [4],[6],[9]

1.1.3 Các phương pháp định lượng (xác định hoạt tính)

Từ năm 1959, Hummel [50] đã đề ra phương pháp định lượng a-chymotrypsin dựa trên tốc độ phản ứng thuỷ phân cơ chất benzoyl-L-tyrosin ethyl ester (BTEE) bởi enzym này ở bước sóng 256 nm Theo đó, 1 đơn vị enzym có khả năng thủy phân 1 ịimol BTEE trong 1 phút ở pH 7,8 và nhiệt độ 25°c

Trong nghiên cứu của N Sperti và cộng sự [35], hoạt tính của a-chymotrypsin được đánh giá qua tốc độ thủy phân cơ chất N-glutaryl-L-phenylalanin-p-nitroanilid (GPNA) bằng cách theo dõi sự tăng độ hấp thụ ở bước sóng 410nm của p-nitroanilin được giải phóng ra, trong điều kiện 25°c và pH 7,75

Theo các dược điển Anh, Mỹ, a-chymotrypsin được định lượng bằng cách so sánh tốc độ thuỷ phân cơ chất N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester (ATEE) của mẫu thử với a-chymotrypsin chuẩn trong cùng một điều kiện:

a) Phương pháp giảm mật độ quang

Tốc độ thủy phân cơ chất ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch cơ chất ở bước sóng 237 nm sau những khoảng thời gian nhất định [47]

Phưcmg pháp định lượng này phù hợp với điều kiện thực tế tại cơ sở và đã được Viện kiểm nghiệm áp dụng Trong phương pháp này, giá trị độ hấp thụ đo được không cần chính xác tuyệt đối mà quan trọng là tốc độ thay đổi độ hấp thụ phải hằng định Tuy nhiên, phương pháp định lượng này yêu cầu điều kiện về nhiệt độ

2 5 ± 0 ,r c và khoảng nồng độ tiến hành phép định lượng khá hẹp từ 12-16 đơn vị USP a-chymotrypsin trong 1 ml

b) Phương pháp phân tích th ể tích

Tốc độ thủy phân cơ chất ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm pH của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian xác định So sánh trong cùng điều kiện với a-chymotrypsin chuẩn [46]

Phương pháp định lượng này cũng yêu cầu duy trì nhiệt độ 25±0,l°c Quá trình chuẩn độ đòi hỏi tiến hành trong bầu khí nitrogen Các dụng cụ cần thiết để tiến hành chuẩn độ phải có yêu cầu đặc biệt như buret chia độ tới 0,005ml, máy đo pH

có khoảng đo rộng

1.1.4 Tác dụng dược lý

- a-chymotrypsin được dùng trong nhãn khoa để làm tan dây chằng mảnh dẻ treo thuỷ tinh thể, giúp loại bỏ dễ dàng nhân mắt đục trong bao và giảm chấn thương cho mắt

- a-chymotrypsin cũng được sử dụng nhằm làm giảm viêm và phù mô mềm do

áp xe và loét, hoặc do chấn thưofng Enzym này còn giúp làm giảm các dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, bệnh phổi và viêm xoang[6],[39]

1.1.5 Chỉ định

- Hỗ trợ trong phẫu thuật đục thuỷ tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng

- Phù nề sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật

- Hỗ trợ bệnh lý viêm đường hô hấp, giảm tiết dịch nhày đờm, ức chế dịch rỉ viêm [6],[39]

1.1.6 Liều lượng và cách dùng

Tuỳ theo từng loại bệnh và các dạng bào chế khác nhau mà xác định liều cho thích hợp Điều trị phù nề sau chấn thương và sau phẫu thuật: tiêm bắp 5000 đơn vị USP 1 lần, ngày 1-3 lần [6],

1.1.7 Chế phẩm

- Bột để pha dung dịch dùng trong nhãn khoa: 300 đơn vị USP

- Bột để pha dung dịch tiêm bắp: 25 microkatal ( hoặc 5000 đơn vị USP)

- Viên nén: 21 microkatal (uống hoặc đặt dưới lưỡi), 4200 đofn vị USP [6],[39]

1.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐÊN HOẠT ĐỘNG, ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA ENZYM PROTEIN VÀ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC

Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có tính đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lófn [4]

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym

Tốc độ giảm hoạt tính của a-chymotrypsin trong dung dịch nước ở pH 7,4 phụthuộc vào nhiệt độ ở nhiệt độ trên 45°c, hoạt tính còn lại của a-chymotrypsin giảm rất nhanh [44]

❖ Tác dụng của pH

Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trưòỉng, mỗi enzym có một trị số pH thích hợp cho sự hoạt động của nó, ở đó tốc độ phản ứng enzym lớn nhất pH có tác dụng vào trạng thái ion hóa của phân tử enzym nói chung và các nhóm hoạt động của enzym nói riêng, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Mặt khác, pH còn ảnh hưởng đến độ bền vững của phân tử enzym [4],[8] ở dạng dung dịch, a- chymotrypsin ổn định nhất ở pH = 3,0 và có hoạt tính tối đa ở pH = 8,0 [39],[46]

❖ Tác dụng của ion kim loại

Một số kim loại ức chế enzym này nhưng lại hoạt hoá enzym khác hay ức chếmột enzym ở nồng độ này nhưng lại hoạt hoá chính enzym đó ở nồng độ khác Tácdụng của ion kim loại đối với enzym rất phức tạp [4],[8]

1.2.2 Các yếu tô ảnh hưởng đến độ ổn định của protein

❖ Thoái hóa về hóa học

- Phẩn ứng thuỷ phân

Phản ứng thuỷ phân protein thường là thuỷ phân liên kết peptid và thuỷ phân nhóm amid Trong môi trường acid mạnh hoặc môi trường acid nhẹ, nhiệt độ cao, protein dễ dàng bị thuỷ phân liên kết peptid [17]

Sự thuỷ phân amid thường diễn ra ở phần glutamin và asparagin còn lại Phần asparagin còn lại bị thủy phân amid qua dạng vòng imid tạo ra acid aspartic và acid iso-aspartic tương ứng, trong môi trưòỉng pH trung tính đến base Phần glutamin còn lại bị thủy phân amid với tốc độ chậm hơn [17],[44]

- Oxy hoá

Các nhóm amino acid, đặc biệt với các nhóm có nhân thơm như methionin, histidin rất dễ bị oxy hoá Tác nhân oxy hoá là phân tử O2, H2O2, ion kim loại [17],[31],[44] Nhiều hormon bị mất hoạt tính sinh học do sự oxy hoá phần methionin còn lại trong phân tử thành sulfoxid tương ứng [17] ở pH 8.0, phần cystein còn lại của a-amylase bị oxy hóa [44]

- Racemỉc hoá và đồng phân hóa

Peptid và protein có chứa phần L-aminoacid còn lại dễ bị racemic hoá tạo dạng đối hình D- do xúc tác base Các phần acid aspartic và serin còn lại dễ bị racemic hoá nhất Sự racemic hoá aminoacid trong phân tử protein có thể sinh ra dạng đối hình D- của aminoacid không chuyển hoá được hoặc tạo liên kết peptid không tới gần được các enzym thủy phân protein [17]

Bên cạnh đó, các peptid và protein có chứa phần acid L-aspartic còn lại có thể

bị đồng phân hóa tạo dạng acid L-iso-aspartic qua vòng imid [44]

- Liên kết chéo qua dạng liên kết disuựid và các tương tác đồng hóa trị khác

Liên kết disulfid ổn định cấu trúc của protein, vì thế khi các liên kết này bị đứt hoặc có sự sắp xếp lại có thể làm thay đổi cấu trúc bậc 3 của protein, do đó ảnh hưcmg đến hoạt tính sinh học của protein [17] Insulin và albumin huyết thanh đông khô bị kết tụ do tạo thành liên kết disulfid trung gian phân tử, sự kết tụ tùy thuộc vào hàm ẩm còn lại của chế phẩm đông khô [44]

Sự tạo thành các liên kết đồng hóa trị khác cũng liên quan đến sự kết tụ của protein Trong quá trình bảo quản, insulin tạo ra các dime đồng hóa trị Thủy phân amid của asparagin A-21 của một phân tử insulin và phần phenylalanin B-1 còn lại của phân tử kia liên quan đến sự tạo thành các loại dime [44],

❖ Thoái hóa về vật lý

- Biến tính

Sự biến đổi cấu trúc bậc 3 hoặc bậc 4 của protein thường gây mất hoạt tính sinh học Hơn nữa, các phần kỵ nước lộ ra khi biến tính thường dẫn đến sự hấp phụ bề mặt, kết tụ và kết tủa Sự biến tính protein thúc đẩy các con đường thoái hóa về hóa học [44]

- Kết tụ và kết tủa

Kết tụ protein là kết quả của sự liên kết các phân tử protein Sự kết tụ từ các vùng kỵ nước của các monome trung gian tạo dạng dime hoặc oligome lón hơn trong dung dịch, ảnh hưcmg đến hoạt tính sinh học của protein Kết tủa protein là sự tạo thành các hạt protein có thể trông thấy được, làm giảm hoạt tính hoặc thay đổi công thức Trong quá trình lắc dung dịch protein, do oxy không khí, sự biến tính ở

trung gian, hấp phụ vào bình hoặc do các yếu tố hoá học có thể làm cho protein bị kết tụ và kết tủa [17],

- Hấp phụ b ề mặt

Sự hấp phụ của protein và peptid vào bề mặt bao bì trung gian, màng lọc rất quan trọng đặc biệt khi nồng độ của protein trong dung dịch thấp [17],[31],[44] Tương tác giữa protein và bề mặt tăng cùng với sự tăng tính kỵ nước của bề mặt và tính kỵ nước của protein Vì tiệt khuẩn bằng màng lọc là phương pháp tiệt khuẩn duy nhất đối với chế phẩm protein, do đó sự hấp phụ và mất hoạt tính của protein do

bị hấp phụ vào màng lọc là điều lo ngạị Các vật liệu lọc như nitrocellulose và nylon

có khả năng hấp phụ protein cao, polysulfon, cellulose diacetat hấp phụ ít hơn [17]

1.2.3 Biện pháp làm tăng độ ổn định của protein

❖ Thêm vào các chất phụ

Protein thường ổn định nhất trong dung dịch có thành phần giống môi trường

tự nhiên của nó Độ ổn định của p-galactosidase tăng khi có mặt protein sữạ Casein liên kết với để duy trì cấu trúc tự nhiên trong quá trình tinh chế [17]

Các chất diện hoạt được thêm vào chế phẩm protein nhằm ức chế sự kết tụ protein; các muối, các polyol, amino acid và các polyme cũng có tác dụng ổn định cấu trúc ban đầu của protein [17],[31]

Các protein hình cầu cũng đóng vai trò ổn định protein trong dung dịch Albumin được thêm vào chế phẩm protein nhằm ức chế sự hấp phụ protein vì albumin bị hấp phụ vào bề mặt, thay thế protein [17],[31]

lon liên kết với a-chymotrypsin có tác dụng ổn định hoạt tính enzym Tại nồng độ 0,10 M, ion Cấ" làm giảm mạnh phản ứng tự phân huỷ gây mất hoạt tính của a-chymotrypsin ở pH 8,0 [18]

<♦ Bào c h ế dưới dạng đông khô hoặc phun sấy

Hầu hết protein không ổn định khi ở dạng dung dịch do đó phải chuyển sang dạng bào chế đông khô hoặc phun sấỵ Các phương pháp này được dùng để làm khô các phân tử nhạy cảm với nhiệt và do đó, ức chế các phản ứng thoái hóa [17] Phương pháp đông khô được ứng dụng phổ biến hofn đối với các chế phẩm protein [17],[26],[30],[33] Thuốc tiêm a-chymotrypsin dạng biến đổi (hãng Princeton

Separation Inc.) được bào chế dưới dạng đông khô và đượG bảo quản trong lọ thuốc tiêm không có nước cho tới lúc hoà tan thuốc trở lại khi dùng [49].

1.3.1 Khái niệm, ưu nhược điểm của phưong pháp đông khô

a) Khái niệm

Đông khô là quá trình làm khô các thuốc và các chế phẩm sinh học trong điều kiện đặc biệt, trong đó nước được lấy đi bằng cách thăng hoa trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi, không qua trạng thái lỏng trung gian [1],[7],[10],[17],[29]

b) ưu, nhược điểm

Quá trình đông khô có những ưu điểm sau:

- Tiến hành ở nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn lỏng trung gian, do đó hạn chế sự phân huỷ dược chất

- Sản phẩm khô, xốp, có diện tích bề mặt tiếp xúc rất lớn do đó dễ dàng được hoà tan trở lại nhanh chóng, thích hợp với thuốc tiêm và viên giải phóng nhanh

- Thuốc được đóng vào lọ ở dạng dung dịch nên dễ dàng đạt được yêu cầu đồng nhất về mặt hàm lượng trong từng đơn vị sản phẩm hofn so với thuốc đóng dạng bột

- Sản phẩm đạt yêu cầu về độ vô khuẩn, hạn chế sự nhiễm chéo nếu dùng dạng bột đóng vào lọ, các thao tác làm khô sản phẩm và đóng nắp đều được thực hiện trong môi trường chân không, không có sự tiếp xúc với không khí do đó cũng hạn chế được sựoxy hoá [1],[7],[10],[16],[17],[29],[30]

Do những ưu điểm trên nên phưoỉng pháp đông khô đã từ lâu được ứng dụng rất nhiều trong ngành Dược cũng như trong ngành Công nghệ sinh học để sản xuất các chế phẩm kháng sinh, vaccin, enzym [27],[29] Ngoài ra, phương pháp này còn được sử dụng để sản xuất viên nén rã nhanh, giúp cho bệnh nhân khó nuốt viên nén thông thường [20],[37],[42],[43]

Mặc dù vậy, phương pháp đông khô cũng có một vài hạn chế như: quá trình đông khô kéo dài, thiết bị phức tạp, đắt tiền, giá thành sản phẩm tương đối cao [7],[10],[17],[29]

1.3.2.Các giai đoạn trong quá trình đông khô

Quá trình đông khô bao gồm ba giai đoạn; giai đoạn đông lạnh, giai đoạn làm khô sơ cấp và giai đoạn làm khô thứ cấp

❖ Giai đoạn đông lạnh

Giai đoạn đông lạnh là giai đoạn đầu tiên của quá trình đông khô ở giai đoạn này, sản phẩm được đặt vào hệ thống làm lạnh tới nhiệt độ đủ thấp để lấy đi hầu hết nước từ hệ bằng cách hình thành đá và chuyển tất cả dạng dung dịch sang trạng thái rắn Khi dạng nước lỏng chuyển dần thành đá, phần chất tan bị cô lại nằm giữa các tinh thể đá, đến khi chúng kết tinh hoặc đến khi hệ có độ nhớt đủ để biến đổi sang dạng vô định hình Kết thúc giai đoạn này sẽ tạo ra pha kết tinh, vô định hình, hoặc kết tinh kết hợp với vô định hình [7],[10],[16],[30],[31]

Nhiệt độ đông lạnh thường là -40°c Nếu thuốc ở dạng vô định hình thì nhiệt

độ đông lạnh phải nhỏ hơn nhiệt độ chuyển trạng thái T ’g Nếu thuốc ở dạng kết tinh thì nhiệt độ đông lạnh phải nhỏ hơn nhiệt độ eutecti Teu [30]

Thời gian đông lạnh phải đủ để sản phẩm đông rắn hoàn toàn Thời gian này thường là 1 giờ nếu bề dày của lớp dung dịch nhỏ hơn 1 cm, còn nếu bề dày của lófp dung dịch lớn hơn 1 cm thì nên đông lạnh trong thời gian ít nhất là 2 giờ [30]

❖ Giai đoạn làm khô sơ cấp

Sau khi sản phẩm đã đông rắn hoàn toàn, tiến hành hạ áp suất của buồng đông khô xuống dưới áp suất hơi của nước đá, đồng thời cung cấp nhiệt cho giá để nước

đá thăng hoa trực tiếp [7],[10],[16],[17],[30],[31] Nhiệt độ giá thường trong khoảng

từ -30 đến 10°c [16], áp suất buồng đông khô thường duy trì từ 50 đến 200 mTorr

[30], tương ứng với 0,0665 mbar đến 0,2660 mbar (1 mTorr = 1,33 mbar)

Kết quả là trong giai đoạn này, bề dày của lớp đông lạnh giảm đi và bề dày của lófp chất rắn khô tàng lên [17] Đá được thăng hoa dưới dạng hơi nước sẽ di chuyển tới buồng ngưng tụ và kết tinh ở đó [7],[30].

❖ Giai đoạn làm khô thứ cấp

Làm khô thứ cấp là lấy đi lượng nước còn lại trong hệ, lượng nước không đông lạnh, bằng cách phản hấp phụ

Mục đích của giai đoạn này là giảm hàm ẩm của chế phẩm đông khô đến mức tối thiểu (thường nhỏ hơn 1%) để đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo quản Do đó, giai đoạn này đòi hỏi thời gian tương đối dài trong quá trình đông khô Trong suốt giai đoạn này, nhiệt độ giá được nâng lên để làm tăng tốc độ phản hấp phụ nhằm đạt hàm ẩm thấp nhất có thể [7],[10],[16],[17],[30],[31].

lA TH U Ố C TIÊM ĐÔNG KHÔ

1.4.1 Khái niệm

Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm dạng bột vô khuẩn được pha thành dung dịch hoặc hỗn dịch ngay trước khi tiêm, được bào chế bằng phương pháp đông khô[I],m,[i0].

1.4.2 Các yếu tô ảnh hưởng đến chất lượng và độ ổn định của chế phẩm thuốc tiêm đông khô

a) Các yếu tố thuộc về công thức

> Dược chất

Giống như các dạng bào chế khác, dược chất là thành phần quan trọng quyết định tác dụng điều trị hay phòng bệnh trong công thức Dược chất dùng để pha thuốc tiêm phải đạt độ tinh khiết về mặt vật lý, hóa học và sinh học cao hơn so với cùng dược chất đó nhưng dùng trong các dạng bào chế khác

Đối với các dược chất không ổn định về tính chất vật lý và hoá học khi ở dạng

dung dịch hoặc hỗn dịch, phải bào chế dưói dạng thuốc tiêm đông khô nhằm làm giảm tối thiểu thời gian tiếp xúc với pha nước [1 ],[?],[ 10]

Khi thiết kế công thức thuốc tiêm đông khô, các yếu tố như độ tan, độ ổn định, các dẫn chất khác nhau của dược chất đều ảnh hưởng đến việc xây dựng công thức [17] Đối với dược chất có bản chất là protein thường không bền vững, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố đã nêu ở mục 1.2

> Dung môi

Dung môi dùng để pha thuốc tiêm đông khô thường là nước cất Đối với các dược chất ít tan trong nước hoặc dược chất dễ bị thủy phân, người ta phối hợp nước

với các dung môi đồng tan với nước để tạo thành hỗn hợp dung môi Một số dung môi đồng tan với nước như ethanol, propylen glycol, polyethylen glycol, glycerin [1],[7],[10] Việc sử dụng các dung môi khan nước này nhằm thay thế một phần hoặc toàn bộ lượng nước trong dung dịch, hạn chế đáng kể sự thuỷ phân dược chất [2].Tert-butanol được dùng làm dung môi pha chế thuốc tiêm đông khô nhằm tạo

ra sản phẩm có bề mặt tiếp xúc lớn, dó đó giảm sự cản trở của bánh thuốc đối với sự chuyển khối của hơi nước và làm tăng tốc độ thăng hoa Hơn nữa, tert-butanol có độc tính thấp Thường dùng tỷ lệ teit-butanol và nước ít nhất là 20% (v/v) [12],[14],[38]

> Tá dược độn

Tá dược độn đóng vai trò là khuôn để dược chất phân tán vào trong đó Việc sử dụng tá dược độn rất quan trọng trong trường hợp dược chất có nồng độ thấp[7],[10],[16],[31]

Tá dược độn dạng kết tinh được sử dụng với ỉượng ít nhất lớn hơn 1/3 tổng nồng độ các thành phần còn lại Tuy nhiên, nồng độ tá dược độn cao quá sẽ tạo ra lớp chất rắn khô có hàm lượng chất rắn cao, cản trở hơi nước được lấy đi trong quá trình làm khô, do đó kéo dài thời gian sấy Các tá dược độn dạng kết tinh hay dùng

là manitol và glycin Manitol là tá dược độn tạo ra cấu trúc đóng bánh đẹp, bề mặt mịn, thời gian hoà tan trở lại nhanh nhưng rất dễ gây vỡ lọ nếu dùng với nồng độ cao Glycin cũng là tá dược độn tạo ra sản phẩm đẹp, hoà tan trở lại nhanh, không gây vỡ lọ như khi dùng manitol nhưng bánh thuốc tạo ra dễ bị vỡ hcfn [23],[25],[31]

Tá dược độn dạng vô định hình cũng có thể được dùng làm tác nhân độn, nhưng hầu hết có nhiệt độ phá vỡ cấu trúc vật lý thấp Khi dùng các tá dược này làm tác nhân độn trong công thức, đòi hỏi nhiệt độ làm khô thấp và thời gian làm khô kéo dài Sorbitol có nhiệt độ phá vỡ cấu trúc vật lý thấp (-45°C); lactose cũng có nhiệt độ gãy vụn thấp (-31°C), hơn nữa, lactose lại là đường đơn nên có phản ứng hóa học với nhóm chức amin của protein; tinh bột hydroxyethyl hóa có nhiệt độ phá

vỡ cấu trúc vật lý khá cao, có thể làm khô trong thời gian ngắn hơn nhưng bánh thuốc bị nứt trong quá trình làm khô, sản phẩm không đẹp [31]

> pH

pH của một dung dịch thuốc tiêm trước hết ảnh hưởng đến độ ổn định của dược chất, vì các dược chất khác nhau sẽ tồn tại bền vững trong dung dịch nước ở một khoảng giá trị pH thích hợp khác nhau, cả trong quá trình pha chế, tiệt khuẩn chế phẩm ở nhiệt độ cao, cũng như trong quá trình bảo quản chế phẩm cho đến khi sử dụng, ở khoảng giá trị pH này, dược chất ít bị thuỷ phân, hoặc ít bị oxy hoá nhất.Nếu tại pH mà dược chất ổn định nhất nhưng dược chất lại không tan, phải áp dụng các biện pháp làm tăng độ tan như; dùng hỗn hợp dung môi, chất trung gian tạo phức dễ tan hay sử dụng các chất diện hoạt

Đối với một chế phẩm thuốc tiêm, pH không chỉ ảnh hưởng đến sự ổn định dược chất mà còn ảnh hưởng đến sự kết tủa dược chất tại vị trí tiêm, gây đau hoặc gây kích ứng khi tiêm Sự kết tủa dược chất tại vị trí tiêm có thể dẫn tới những thay đổi về mặt dược động học Những vấn đề này thường xảy ra khi pH của thuốc tiêm khác xa với pH sinh lý [1],[7],[10],[22]

> Hệ đệm

Mặc dù pH của công thức thuốc tiêm đã được điều chỉnh trong quá trình pha chế nhưng cũng có thể bị thay đổi trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân:

do sự biến đổi của dược chất, do sự xâm nhập khí từ môi trường bên ngoài qua bao

bì vào thuốc [1],[17] Khi pH của thuốc tiêm thay đổi sẽ làm giảm độ ổn định của dược chất trong chế phẩm Do vậy, phải dùng hệ đệm để duy trì pH của thuốc tiêm ở giá trị thích hợp Tiêu chuẩn lựa chọn hệ đệm là khoảng pH và dung lượng đệm Với một công thức thuốc tiêm, dung lượng đệm cao có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân dược chất, đồng thời khó điều chỉnh pH sinh lý của cơ thể, dẫn đến gây đau và gây kích ứng mạnh chỗ tiêm [1],[7],[10],[17],[22]

Việc sử dụng hệ đệm trong quá trình đông khô có thể làm thay đổi pH đáng kể của chế phẩm Đệm natri phosphat làm giảm pH khoảng 3-4 đơn vị do kết tinh của thành phần base Na2ÍIP04 [11] [21] [31] [45] Hiện tượng thay đổi pH này cũng gặp trong hệ đệm succinat Biện pháp khắc phục tốt nhất là dùng hệ đệm ít làm thay đổi

pH trong quá trình đông khô như hệ đệm citrat, histidin với nồng độ thấp [16],[30] Thêm vào đó, việc sử dụng hệ đệm còn ảnh hưởng đến các đặc tính kết tinh của tá dược và thay đổi nhiệt độ chuyển trạng thái [11] [23]

> Chất bảo vệ

Các công thức thuốc có bản chất là protein nói chung cần có chất bảo vệ protein không bị phá huỷ trong quá trình đông khô Có hai giả thuyết giải thích vai trò của chất bảo vệ Giả thuyết “thay thế nước” hay giả thuyết “tương tác đặc hiệu” cho rằng khi nước được lấy đi trong giai đoạn làm khô sẽ dẫn tới sự mất ổn định nhiệt động học Chất bảo vệ tạo liên kết hydro ở phần đặc hiệu trên bề mặt protein, thay thế nước bị lấy đi Giả thuyết thứ hai về “động lực tinh thể” cho rằng tác nhân

ổn định tạo một hệ cứng rắn, bất động trong đó các phân tử protein bị phân tán vào

đó Sự chuyển động trong hệ bị hạn chế, các tương tác lưõfng phân tử và các thoái hóa của protein cần có sự chuyển động trở nên rất chậm trong hệ cứng rắn gắn chắc với protein [13],[16],[26],[31] Các chất bảo vệ thường dùng: đường (glucose, saccarose [25],[32],[33],[40],[41],[48]); các polyme (dextran [28], maltodextrin [36]), các amino acid (glycĩn [11],[41])

> Chất điểu chỉnh đẳng trương

Trong một số trưòíig hợp, công thức thuốc tiêm đòi hỏi phải đẳng trương nhằm hạn chế gây đau, tổn thương, hoặc hoại tử tổ chức tại nơi tiêm Để đẳng trương thuốc tiêm, người ta có thể sử dụng một số chất điều chỉnh đẳng tniofng như: manitol, natri clorid Chất điều chỉnh đẳng trưoỉng thường được cho vào dung môi hoà tan trở lại thuốc tiêm đông khô [1],[7],[10],[16],[17]

> Chất diện hoạt

Chất diện hoạt được thêm vào công thức thuốc tiêm nhằm làm tăng tính thấm của dược chất, hạn chế sự hấp phụ bề mặt của thuốc đóng liều thấp Hơn nữa, chất diện hoạt còn có tác dụng ổn định protein trong quá trình đông khô Cơ chế làm tăng

độ tan của chất diện hoạt là hấp phụ dược chất vào các micell Đồng thời, cơ chế này cũng bảo vệ dược chất khỏi tác dụng của acid hay base-tác nhân xúc tác quá trình thủy phân [1],[7],[17],[22],[31]

> Bao bì đóng gói trực tiếp

Bao bì đóng thuốc tiêm đông khô không chỉ có vai trò bảo vệ thuốc trong quá trình bảo quản, sử dụng và vận chuyển mà còn là hàng rào tốt ngăn cản hơi nước xâm nhập vào bên trong chế phẩm Do đó, bao bì đóng thuốc tiêm đông khô phải là

thuỷ tinh hoặc kim loại (kim loại được dát mỏng dạng lá), có tốc độ thấm hơi nước thấp [7],[10],[22] Bao bì bằng thủy tinh còn có khả năng giữ được chân không trong

lọ thuốc trong quá trình bảo quản [1] Đối với loại bao bì này, kích thước lọ và thể tích dung dịch cho vào lọ ảnh hưởng đến tốc độ làm khô Nếu thể tích dung dịch cho vào lọ lớn và hàm lượng chất rắn cao, sự cản trở đối với việc thoát hơi nước sẽ lớn [15],[31],[37]

Nút cao su có ảnh hưởng lớn đến hàm ẩm của chế phẩm và do đó ảnh hưởng đến độ ổn định của chế phẩm [1],[7],[10],[17]

b) Các yếu tô thuộc về quy trình

> Giai đoạn pha c h ế

Trong quá trình hoà tan protein, không nên khuấy mạnh dung dịch vì sẽ gây ra bọt, ngoài ra còn tạo bề mặt ranh giới không khí-nước lớn Đây là yếu tố thuận lợi thúc đẩy sự biến tính, kết tụ và có thể gây kết tủa protein [17] Hơn nữa, do thuốc có bản chất là protein, rất dễ bị hấp phụ vào bề mặt bao bì trung gian, màng lọc trong quá trình pha chế [ 17], [31 ], [44]

> Giai đoạn đông lạnh

Giai đoạn này ảnh hưởng đến chất lượng của các chế phẩm không ổn định như protein, liposome Khi sản phẩm được đông rắn hoàn toàn, hầu hết nước được tách

ra khỏi chất tan để tạo thành đá Một môi trường khác so với ban đầu được tạo ra Các yếu tố như lực ion, pH thay đổi, các tương tác kỵ nước giúp ổn định dạng ban đầu của protein giảm hoặc mất dần vì nước được lấy đi [23],[30],[31]

Tốc độ đông lạnh phải đủ nhanh Nếu đá kết tinh chậm sẽ kéo dài thời gian protein tồn tại trong trạng thái lỏng cô đặc với nồng độ protein cao, các tương tác lưỡng phân tử giữa protein-protein tăng, có thể gây kết tụ protein Mặt khác, nếu đông chậm có thể gây phân chia pha, dẫn đến phân chia protein và các tác nhân bảo

vệ, ảnh hưẻmg đến sự ổn định của protein Hơn nữa, số lượng các tinh thể đá cỡ nhỏ

sẽ tăng, làm cho bề mặt ranh giới giữa nước và đá càng lớn Sự tiếp xúc của protein với bề mặt ranh giới này có thể gây biến tính protein [16],[30] Tuy nhiên, tốc độ đông lạnh quá nhanh có xu hưófng tạo ra sức cản lớn hcm trong lớp chất rắn khô [17], hoặc dẫn đến tình trạng lạnh không đồng đều giữa các lọ cũng như trong một lọ [30] Vì vậy, tốc độ đông thường khoảng l “C/phút [30],[31]

> Giai đoạn làm khô sơ cấp

Trong suốt giai đoạn làm khô, các phân tử nước được lấy đi Do đó, nếu chế phẩm thuốc có bản chất protein không có tác nhân bảo vệ thích hợp thì có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của protein [16],[17],[31]

Các thông số của quá trình cũng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Áp suất buồng đông khỗ càng thấp, quá trình thăng hoa càng nhanh Tuy nhiên, nếu áp suất buồng thấp quá có thể gây ra sự không đồng đều trong quá trình truyền nhiệt, dẫn đến sự không đồng đều về nhiệt độ giữa các lọ [30]

Nhiệt độ sản phẩm càng cao, quá trình làm khô càng nhanh Cứ tăng nhiệt độ lên l°c, thời gian làm khô sơ cấp giảm đi được 13% [17],[30],[41] Tuy nhiên, nhiệt

độ sản phẩm càng cao thì nguy cơ phá vỡ cấu trúc vật lý càng lớn [17],[34] Điều này có ý nghĩa đặc biệt với các sản phẩm ở dạng vô định hình sau quá trình đông lạnh, khi nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ phá vỡ cấu trúc của sản phẩm, dung dịch đông lạnh cô đặc sẽ chảy và mất cấu trúc vật lý đã được thiết lập trong giai đoạn đông Hiện tượng phá vỡ cấu trúc vật lý này có thể quan sát được từ sự co lại không đáng kể của bánh thuốc đến mất hẳn cấu trúc bánh thuốc [7],[17]

> Giai đoạn làm khô thứ cấp

ở giai đoạn đầu làm khô thứ cấp, hàm ẩm của sản phẩm vô định hình lớn, do

đó nhiệt độ chuyển trạng thái thấp Nhiệt độ giá trong giai đoạn này được nâng lên một cách từ từ, vì nếu nâng lên nhanh quá, bánh thuốc dễ bị phá vỡ cấu trúc vật lý [30]

Thời gian làm khô thứ cấp sẽ quyết định hàm ẩm của sản phẩm Do đó, nếu thời gian này không đủ sẽ ảnh hưỏfng đến hàm ẩm của chế phẩm Đây là một đặc điểm quan trọng liên quan đến độ ổn định của sản phẩm đông khô, đặc biệt với chất rắn vô định hình Hàm ẩm của chế phẩm lớn làm giảm nhiệt độ chuyển trạng thái

Do đó, hàm ẩm lớn sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định về trạng thái vật lý của bánh thuốc như bánh thuốc bị co lại hay bị phá vỡ cấu trúc vật lý, hoặc tăng tốc độ phản ứng hoá học làm cho chế phẩm mất ổn định Điều này cũng liên quan tới nhiệt độ bảo quản, vì chế phẩm đông khô phải được bảo quản ở nhiệt độ dưới nhiệt độ chuyển trạngthái[7],[16],[17],[30],[31]

PHẦN 2 - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiêm

15 N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester Thụy Sỹ Tinh khiết hóa học

17 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

18 Lọ thuỷ tinh, nút cao su, nút

2.1.2 Phương tiện thực nghiệm

- Máy đông khô LSL SECFROID

- Máy quang phổ SHIMAZU u v 1700

- Máy lọc màng SARTORIUS

- Máy đo pH: pH Mettler Toledo, Eutech 510

- Các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong bào chế và phân tích

- Tủ sấy, bình hút ẩm

- Tủ vi khí hậu

- Tủ lạnh

2.1.3 Nội dung nghiên cứu

• Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưcmg đến việc xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotiypsin 5000 đơn vị ƯSPAọ

• Bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của chế phẩm

• Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của chế phẩm

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu

khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP/Iọ

Bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin với sự thay đổi các yếu tố trong công thức và các thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô, từ đó tìm ra công thức

- Bao bì đóng gói trực tiếp

• Nghiên cứu các thông s ố kỹ thuật trong quá trình đông khô bao gồm:

- Nhiệt độ và thời gian đông lạnh

- Nhiệt độ buồng ngưng, thời gian làm khô sơ cấp

- Nhiệt độ và thời gian làm khô thứ cấp

a) Quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP/lọ

❖ Xử lý lọ thuỷ tinh, nút cao su, nút nhôm

Trước khi pha chế, phải tiến hành xử lý bao bì gồm: lọ thuỷ tinh, nút cao su, nút nhôm theo quy trình như sau:

Hình 2.1: Sơ đồ xử lý lọ thuỷ tinh, nút cao su, nút nhôm

Chon lưa Rửa nước thường Rửa nước thường .

Rửa nước thưòfng Rửa nước xà phòng Rửa nước xà phòng

Rửa nước xà phòng Rửa nước thưòfng Rửa nước thường

Rửa nước cất 1 lần Tráng silicon Sấy khô 110°C/3 giờ

TRửa nước cất 2 lần đã Sấy khô

Tiệt khuẩn bằng nhiệt

160°C/3 giờ Rửa nước cất 2 lần đã lọc

❖ Pha c h ế thuốc tiêm đông khô

Thuốc tiêm đông khô a-chymotiypsin được pha chế theo quy trình sau đây:

Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt quy trình bào c h ế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin

5000 đơn vị USP một lọ

Điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl 10% hoặc dung dịch NaOH 0,1M Với những công thức dùng hỗn hợp dung môi, các tá dược tan trong dung môi nào thì hòa tan trong dung môi đó, sau đó phối hợp và hòa tan dược chất.

Mổ tả:

+ Hoà tan tá dược vào khoảng 80% thể tích dung mồi có trong công thức Đun nóng nhẹ nếu eần để tá dược tan hoàn toàn Để nguội Khuấy nhẹ để hoà tan dược chất Điều chỉnh pH nếu cần, sau đó thêm dung môi cho đủ thể tích Tiệt khuẩn dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước lỗ xốp 0,20 ụm

+ Đóng chính xác từng thể tích 1 ml dung dịch đã tiệt khuẩn vào lọ thuỷ tinh

đã xử lý, đậy hờ bằng nút cao su có xẻ rãnh ở phần dưới của nút Lọ được đặt vào khay inox đã được làm lạnh từ trước, sau đó chuyển khay vào buồng đông lạnh của thiết bị đông khô để dung dịch đóng băng ở -40°c trong 2 giờ

+ Khi sản phẩm đã đông rắn hoàn toàn, tiến hành hút chân không để giảm áp suất hơi của buồng đông khô xuống dưới áp suất hơi của nước đá đồng thời cung cấp nhiệt cho giá để tạo năng lượng cần thiết cho sự thăng hoa Dưới những điều kiện này, nước sẽ bay hơi trực tiếp từ trạng thái rắn tạo ra sản phẩm khô xốp

+ Tiếp theo, cung cấp một nhiệt lượng từ bên ngoài để làm khô bánh thuốc một cách kỹ lưõfng

+ Khi sản phẩm đã khô hoàn toàn, bộ phận nén tự động sẽ đẩy các nút cao su đóng khít vào đúng vị trí Sản phẩm được lấy ra khỏi buồng đông khô và tiếp tục đóng nắp nhôm, xiết chặt, hoàn thiện sản phẩm

b) Đánh giá chất lượng chế phẩm

❖ C h ế phẩm thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP phải đạt được các chỉ tiêu về:

- Cảm quan (hình thức bánh thuốc)

- Độ trong, thời gian ổn định độ trong của dung dịch sau khi pha lại

- pH của dung dịch sau khi pha lại

- Mất khối lượng do sấy khô

- Hoạt tính a-chymotrypsin

• Phương pháp định lượng a-chymotrypsỉn trong c h ế phẩm thuốc tiêm đông khô

Để xác định hoạt tính của a-chymotrypsin trong các chế phẩm thuốc tiêm đông khô, chúng tôi sử dụng phưotìg pháp giảm mật độ quang theo USP 29

Do không thể điều chỉnh độ hấp thụ của hỗn hợp gồm 0,2 ml HCl 0,0012N và 3,0 ml dung dịch chất nền ở 237 nm đạt giá trị 0,200, nên chúng tôi đã thay bước này bằng cách dùng một mẫu trắng là hỗn hợp gồm 0,2 ml dung dịch HCl 0,0012N

và 3,0 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,0 và khử về giá trị độ hấp thụ bằng 0 Phưcfng pháp này tạm gọi là phương pháp đo quang cải tiến Các bước tiến hành được đề xuất như sau:

• Chuẩn bị

- Dung dịch đệm phosphat pH 7,0:

Hoà tan 4,54 g KH2PO4 với nước cất thành 500 ml dung dịch Hoà tan 4,73 g

Na2ĨỈP04 khan với nước thành 500 ml dung dịch Trộn 38,9 ml dung dịch KH2PO4 với 61,1 ml Na2ĨỈP04 Điều chỉnh tới pH 7,0 bằng cách thêm dung dịch Na2ỈỈP04 (nếu cần)

- Dung dịch cơ chất:

Hoà tan 23,7 mg ATEE trong khoảng 50 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,0, đồng thời làm ấm dung dịch Khi dung dịch nguội, pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,0 đến 100 ml (Lưu ý: dung dịch cơ chất có thể bảo quản trong tủ lạnh và sử dụng sau khi làm tan đá, nhưng phải được bảo quản ngay sau khi pha)

Lấy chính xác 0,2 ml dung dịch a-chymotrypsin vào cốc đo 1 cm khác, thêm chính xác 3,0 ml dung dịch chất nền, lắc đều và đặt cốc đo vào máy, bắt đầu tính thời gian.

Đọc độ hấp thụ 30 giây 1 lần trong vòng ít nhất 5 phút Tốc độ thay đổi độ hấp thụ hằng định trong thời gian không dưới 3 phút và tốc độ này nên trong khoảng 0,008- 0j012 Lặp lại quy trình với cùng điều kiện Giá trị độ hấp thụ không quan trọng bằng hằng số tốc độ thay đổi hấp thụ Nếu tốc độ thay đổi độ hấp thụ không hằng định như với yêu cầu thì sử dụng dung dịch thử có nồng độ thấp hem

Xác định tốc độ thay đổi mức độ hấp thụ ánh sáng trung bình trong 1 phút, chỉ lấy những giá trị trong vòng 3 phút mà tại đó tốc độ thay đổi độ hấp thụ là hằng định

Một đofn vị USP a-chymotrypsin là hoạt tính làm thay đổi độ hấp thụ 0,0075 trong 1 phút dưới những điều kiện quy định trong phép định lượng này

Tính kết quả theo công thức;

0,0075 xT X M

trong đó:

X: % so với lượng ghi trên nhãn

Aj! độ hấp thụ đầu đoạn thẳng

Aịi độ hấp thụ cuối đoạn thẳng

T: khoảng thời gian giữa A2 và Ai (phút)

M: số đơn vị USP a-chymotrypsin có trong 0,2 ml dung dịch chất thử theo hoạt tính a-chymotrypsin ghi trên nhãn

0,0075: tốc độ thay đổi độ hấp thụ tương đương 1 đơn vị a-chymotrypsin ở điều kiện trên

Phương pháp định lượng được đề xuất trên đây không làm ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả định lượng Vì thay đổi mẫu trắng nên giá trị độ hấp thụ đo được sẽ thay đổi Nhưng nguyên tắc của phép định lượng vẫn dựa trên sự thay đổi tốc độ hấp thụ, do đó giá trị độ hấp thụ đo được không quan trọng

• Phương pháp xác định hàm ẩm của bột đông khô

Dùng phương pháp xác định mất khối lượng do sấy khô

- Sấy trong tủ sấy ở 105°c trong 3 giờ ở áp suất thường

- Để nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có vôi bột là chất hút ẩm, sau

- Làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.

a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP

• Lão hoá cấp tốc

Các mẫu thuốc tiêm được bảo quản trong tủ vi khí hậu, ở điều kiện nhiệt độ

40±2°c, độ ẩm tương đối 75±5% nhằm tăng nhanh tốc độ phân huỷ, rút ngắn thời

gian theo dõi đánh giá

• Đ ể ồ điều kiện thực

Bảo quản các mẫu thuốc tiêm đông khô trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ 15-

35°c, độ ẩm 65-95% Kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm sau những khoảng thời gian nhất định

• Đê ở điều kiện lạnh

Các mẫu thuốc tiêm đông khô được bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ 2-8°C Sau những khoảng thời gian nhất định, đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm, so sánh với các mẫu bảo quản ỏ điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc

• Đánh giá một s ố ch ỉ tiêu chất lượng của c h ế phẩm thuốc tiêm đông khô

(theo mục 2.1.4.1 phần b)

khô a-chymotrypsin 5000 đoti vị USP

Tiến hành dự thảo các tiêu chuẩn về vật lý (tính chất cảm quan, độ trong, độ ổn định độ trong), hoá học (pH, định tính, định lượng), vi sinh (thử độ vô khuẩn, chất gây sốt) Trong phạm vi tiến hành thực nghiệm, chỉ khảo sát một số chỉ tiêu như sau:

Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

- Tính chất cảm quan: Bột đông khô được đóng trong lọ thuỷ tinh trung tính

được đậy kín bằng nút cao su đã tráng Silicon và chụp nắp nhôm bên ngoài Bột thuốc màu trắng, kết thành bánh

Cách thử; Thử bằng cảm quan

- Mất khối lượng do sấy khô: không được lófn hơn 3% (kl/kl).

Cách thử: Theo phương pháp như mục 2.1.4.1 phần b

- Độ trong của dung dịch sau khi pha lại: Dung dịch sau khi pha lại để tiêm

phải trong và không có tạp cơ học

Cách thử: Hoà tan bột thuốc trong lọ với 2 ml dung dịch NaCl 0,9% Xoay tròn nhẹ nhàng lọ thuốc tiêm Quan sát qua dụng cụ soi tiểu phân Dung dịch phải đạt độ trong theo quy định ghi trong Dược điển Việt Nam III

- pH của dung dịch sau khi pha lại: dung dịch có chứa khoảng 5000 đofn vị

USP a-chymotrypsin trong 2 ml dung dịch NaCl 0,9% phải có pH trong khoảng từ3,0-5,0 Cách thử: Hoà tan bột thuốc trong lọ với 2 ml dung dịch NaCl 0,9%, đo pH bằng máy đo pH

- Định lượng: Hoạt tính a-chymotrypsin trong mỗi lọ thuốc phải đạt từ 90,0-

120,0% so với lượng ghi trên nhãn Tiến hành theo phương pháp ghi ở mục 2.1.4.1 phần b

cơ sở đó tìm ra công thức bào chế thích hợp.

a) Ảnh hưởng của dung môi

❖ Kết quả sử dụng nước cất làm dung môi

a-chymotrypsin tan được trong nước Do đó, chúng tôi đã sử dụng nước cất làm dung môi hoà tan a-chymotrypsin và tá dược Tiến hành đông khô theo các bước ghi trong mục 2.1.4.1 phần a Nhận xét về khả năng hoà tan, pH và độ trong dung dịch trước khi lọc Sau khi đông khô, kiểm tra độ trong của dung dịch pha lại với 2 ml dung dịch NaCl 0,9% Kết quả được ghi lại ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Độ trong và pH của dung dịch a-chymotrypsin pha với nước cất

Khả năng hoà tan, độ trong và thời gian ổn định độ trong pHManitol sô 1 số 2 Lactose Trước khi lọc Sau khi pha lại

Ghi chú: độ trong của dung dịch giảm theo thứ tự: (++) > (+) > (-) > (— )

Kết quả thử nghiệm cho thấy các mẫu dùng nước cất làm dung môi để hoà tan a-chymotrypsin có giá trị pH khác nhau, hầu hết các mẫu đều tan chậm tạo thành dung dịch hơi đục Dung dịch tạo thành sau khi pha lại với 2 ml dung dịch NaCl0,9% có thời gian ổn định độ trong khoảng 15 phút Điều đó chứng tỏ nước cất có thể được sử dụng làm dung môi hoà tan a-chymotrypsin, nhưng lại không phải là

môi trường bền vững cho sự tồn tại của protein Từ nhận xét đó, chúng tôi đã tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi theo 2 hướng: hoặc là thay thế một phần nước bằng tert-butanol để hạn chế sự thuỷ phân, hoặc là sử dụng nước cất làm dung môi nhưng điều chỉnh về pH 3,0 để tăng độ ổn định.

Kết quả sử dụng hỗn hợp dung môi nước cất và tert-butanol

Theo một số tài liệu, hỗn hợp dung môi tert-butanol và nước được dùng để tăng nhanh tốc độ hòa tan trở lại của bột đông khô vì nó tạo ra bề mặt tiếp xúc lớn sau khi đông khô Vì thế, chúng tôi đã sử dụng hỗn hợp dung môi này với các tỷ lệ khác nhau để pha chế các dung dịch theo công thức 1.2 và 1.3 Tiến hành đông khô theo quy trình ghi trong mục 2.1.4.1 phần a Kiểm tra sản phẩm như thí nghiệm trên Kết quả được ghi lại trong bảng 2.3

Bảng 2.3: Độ trong và pH dung dịch a-Chymotrypsin pha bằng hỗn hợp dung

môi nước cất và tert-butanol

Dung môi Khả năng hoà tan, độ trong

c r Manitol Nước cất

(%)

Teit-butanol(%) Trước khi lọc Sau khi pha lại

pH

Ghi chú: độ trong của dung dịch giảm theo thứ tự: (++) > (+) > (-) > (— )

Sản phẩm đông khô của công thức 1.2 và 1.3 đều có hình bánh thuốc đẹp, bề mặt mịn Tuy nhiên, các lọ bột đông khô sau khi bơm 2 ml dung dịch NaCl 0,9% đều khó tan, đục Trên cơ sở kết quả thí nghiệm thu được, chúng tôi không sử dụng

hệ dung môi này để pha chế thuốc tiêm đông khô

❖ Kết quả sử dụng dung dịch HCl 0,001 N làm dung môi

Tiến hành pha chế dung dịch để đông khô với các tá dược: manitol, tá dược số

1, số 2, sorbitol và glucose, dùng dung dịch HCl 0,00 IN làm dung môi pha chế Một

số công thức có pH>5 được điều chỉnh trong khoảng 3,0-5,0 bằng dung dịch HCl 10% Các tá dược sử dụng được ghi vào bảng 2.4

Bảng 2.4: Tá dược sử dụng cho thuốc tiêm đông khô a-Chymotrypsin

sử dụng dung dịch HCl 0,001 Nlàm dung môi

CT

Tá dượcManitol TD số 1 TD số 2 Sorbitol Glucose

Cl Khả năng hoà tan, độ trong và thời gian trong pH

Trước khi lọc Sau khi pha lại1.4 Tan nhanh, (+) Tan nhanh, (+), 20 phút 3,63

8.1 lần 2 Tan nhanh, (++) Tan nhanh, (++), 20 phút 3,00

11.1 Tan nhanh, (++) Tan nhanh, (++), 30 phút 3,40

12 Tan nhanh, (+) Tan nhanh, (+), 20 phút 3,50

13 Tan nhanh, (+) Tan nhanh, (+), 15 phút 3,50

15 lần 2 Tan nhanh, (++) Tan nhanh, (++), 15 phút 3,48

Kết quả ở bảng trên cho thấy a-chymotrypsin hoà tan rất tốt trong dung dịch HCl 0,00 IN Sản phẩm tạo thành có hình thức đẹp, bề mặt mịn Dung dịch tạo thành tan nhanh, trong và ít bọt Từ kết quả đó, chúng tôi đã sử dụng HCl 0,00 IN làm dung môi để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác

b) Ảnh hưởng của tá dược

❖ Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại tá dược

Tiến hành bào chế thuốc tiêm đông khô sử dụng các tá dược độn khác nhau: manitol, tá dược số 1, tá dược số 2, sorbitol, glucose, saccarose và lactose, dùng

riêng hoặc phối hợp, nhằm đánh giá ảnh hưcmg của các tá dược này tới chất lượng thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin (bảng 2.6).

Bảng 2.6: Các tá dược trong thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin

Bảng 2.7: Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các tá dược khác nhau đến chất

lượng thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin

Độ trong của dung dịch Thòi gian ổn

định độ trong (phút)

Hoạt tính a-chy (%)

Trước khi lọc

Sau khi pha lại

Nhân xét:

- Về mặt cảm quan: các chế phẩm đông khô theo công thức 1.4, 8 và 16 đều có bánh thuốc đẹp, bề mặt mịn Bột đông khô tan nhanh Điều đó chứng tỏ, khả năng tạo bánh của manitol tốt hơn so với các tá dược khác

- Về độ trong của dung dịch trước khi lọc: sự có mặt của tá dược số 1 trong công thức đã làm tăng độ tan của a-chymotrypsin, điều đó thể hiện ở độ trong của

dung dịch pha theo công thức 8 trước khi lọc

- Về độ trong của dung dịch sau khi pha lại: dung dịch pha theo công thức 5 rất trong với thời gian ổn định độ trong lâu nhất (30 phút) Kết quả này bước đầu cho thấy vai trò bảo vệ protein của tá dược số 2

- Về hoạt tính a-chymotrypsin: các chế phẩm đông khô đều đạt tiêu chuẩn về hoạt tính enzym Riêng bột đông khô theo công thức 5 hoạt tính quá thấp (81,0%),

do enzym này không hoà tan hoàn toàn ngay từ khi pha chế

Kết quả trên bước đầu cho thấy vai trò làm tăng độ tan của tá dược số 1 và vai trò bảo vệ protein của tá dược số 2 Đồng thời kết quả trên còn cho thấy khả năng tạo bánh rất tốt của manitol

❖ Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ manỉtol và tá dược s ố 1

Nhằm tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tá dược số 1 đến độ trong của dung dịch a-chymotrypsin, chúng tôi đã sử dụng hỗn hợp của manitol và tá dược số 1 với các tỷ lệ khác nhau trong thành phần của thuốc tiêm đông khô (bảng 2.8)

Bảng 2.8: Tỷ lệ manitol và tá dược s ố 1 trong một s ố công thức

thuốc tiêm đông khô