Hệ nấm m ốc trên các cơ chất có nguồn gốc thực vật.Trên th ế giới việc nghiên cứu nấm mốc và các bệnh do chúng gây ra đã có từ lâu, song thời kỳ phát triển mạnh nhất là sau dấu mốc quan
Trang 1B ộ Y T Ẽ
NGUYỄN ĐÌNH HÒA
NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIẺM NÂM M ố c
LƯU HÀNH TRÊN ĐỊA BÀN CÁC TỈNH HÀ TÂY,
BẮC NINH VÀ HẢI DƯƠNG
Người hướng đẫn: Ths TRAN TRỊNH CÔNG
N ơi thực hiện: BỘ MÔN VI SINH - SINH HỌC
Thời gian thực hiện: 10/2005 " 04/2006
\
\
HÀ NỘI - 5/ 2006
Trang 2j £ ở i e ỏ M i d i t
Çjôt rX'itt bà ụ fil îôttff eảm f)'ft efiâtf ih ittih ftftà't té'l: Çfh s Pettit Çîvhth ^ỗtưẬ, tftih j ĩtã tita íìttíi q jú p ỈĨẼ' lût Ittt'ó'ftfi titnt tồ i hfíiut ihíttth
U hóa iutttt fiftff.
Ç îè i æ in h ỉ i Ị Ị ff) l ỉ ì n q e /t m o'ti t ó i e ite t h m j eö f j i á f í l ù i e ite a t t h e h i
Uậ th u iif o Jh i bộ ntêtt ^ )i sifth - S i ult hfie itñ flifí nt fit đ ĩề n Uiện thiiậti ifí’i eítiị tồ i qtíít trìitít títựe h ỉĩíi đ ề tít ỉ tạ i i)f) tu ĩ) ft.
Çîêi æin lừttỊ it) iỉỉíiíị Of i nt tì ft fâ i lut fi h ỉ oil ạitt đ ì nit i f ũ eò oũf đềit€ị tùỀii tồ i ÌrtìtựỊ q u á frtttlt h ọ e itỊỊi v ù títiửi ítiệtt U háư iíu tn nàụ,,
'Jôft ^Ìltìĩ, ttỊỊÌiỊỊ 2 0 th fu u j 0 5 ft ă m 2 0 0 6
rSàtíi íiỉĩỉi
Q ù ị t t ụ ỉ t t ^ tìtttỉt '3ÔÒU
Trang 3MỤC LỤC
Trang
P H Ẩ N l TỔNG Q U A N 3
1.1 Hệ nấm trên các cơ chất có nguồn gốc thực v ậ t 3
1.2 Đặc điểm hình thái một số chi nấm quan trọ n g 4
1.2.1 Chi Aspergillus M icheli ex F ries 4
1.2.2 Chi Pénicillium Link ex F rie s 8
1.3 Tình hình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên dược liệu ở Việt N a m 11
PHẦN 2 THỰC NG H IỆM VÀ KẾT QUẢ 13 2.1 N guyên vật liệu và phương pháp thực n g h iệ m 13
2.1.1 Vật liệu 13
2.1.2 Phưcíng pháp nghiên c ứ u 14
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 14
2.2.1 Mức độ nhiễm nấm mốc trên các Tĩiãu hạt sen nghiên c ứ u 14
2 2 2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên ý d ĩ 16
2.2.3 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc binh la n g 18
2.2.4 Mức độ nhiẽm nấm mốc trên vị thuốc sa n h â n 19
2.2.5 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc nhục đậu k h ấ u 21
2.2.6 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc táo n h â n 23
2.2.7 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc kha tử 25
2.2.8 Mức độ nhiễm nấm inốc trên vị thuốc ngũ vị t ử 27
2.2.9 Đạc điểm khuẩn lạc và vi học của một số chủng thuộc loài A.flavus phân lập từ hạt sen 29
2.3 Phưcmg pháp xác định nhanh các chủng thuộc loài A.ílavus bằng phương pháp sinh hóa 31
PHẦN 3 k ế t l u ậ n Và đ ể X U Ấ T 33
3.1 K ế tlu ậ n 33
3.2 Một số đề xu ất 34
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỂ
ở nước ta nguyên liệu dùng để bào chế thuốc y học cổ truyền và các chế phẩm đông dược hầu hết có nguồn gốc thực vật [3] Việc trồng và thu hoạch nguồn dược liệu này còn rất phân tán, nhỏ lẻ và chủ yếu là từ các hộ cá thể Phương pháp thu hoạch, chế biến, bảo quản còn đơn giản, lạc hậu, cơ bản vẫn
là các phương pháp truyền thống phơi sấy theo kinh nghiệm Điều đó đã làm cho các được liệu, các vị thuốc đông dược thường rất dẽ bị mốc, nhất là trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta Khi nấm mốc xâm nhiễm và phát triển, ngoài việc làm giảm chất lượng dược liệu như làm giảm hàm lượng vitamin, lipid, protid, tinh bột và các loại hoạt chất khác (do đa số nấm là các sinh vật hoại sinh), chúng còn sinh ra các độc tố (được gọi chung là mycotoxin) gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng Trong số hàng trăm mỵcotoxin mà con người đã biết, đáng lưu ý nhất là các aflatoxin, một nhóm các hợp chất có khả năng gây ung thư cho người và động vật [1,25,28] Nhóm độc tố này chủ yếu do hai loài nấm Aspergillus ịỉaviis và A
parasiticus sinh ra và đã được các nhà nghiên cứu nấm và độc tố phát hiện
thấy ở tỷ lệ cao trên các nông sản, đặc biệt là ngô và lạc [1,22] Bên cạnh đó,
ở góc độ quản lý nhà nước còn thiếu một hệ thống giấm sát chặt chẽ chất lượng của các nguồn dược liệu từ cơ sở nuôi trồng, thu hoạch, chế biến, bảo quản cho tới tận tay người tiêu dùng, nhất là xét về phưcmg diện nấm mốc
và độc tố nấm mốc như đã nói ở ưên
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài '"Nghiên cứu
m ức độ n h iễm n ấ m m ốc trên m ột số vị thuốc đôn g dược đang lưu hành trên địa bàn các tỉnh H à Tây, B ắc N in h và H ả i D ư ơ n g ” với hai mục tiêu
sau:
Trang 51 Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm nấm mốc thuộc 2 chi Aspergillus và
Pénicillium trên các vị thuốc đông dược: binh lang, ngũ vị tử, sa nhân, nhục
đậu khấu, hạt sen, táo nhân, ý dĩ và kha tử.
2 Xác định nhanh các chủng thuộc hai loài A fla vu s và A parasiticus
bằng phương pháp sinh hóa
Trang 6PHẦN 1: TỔNG QUAN1.1 Hệ nấm m ốc trên các cơ chất có nguồn gốc thực vật.
Trên th ế giới việc nghiên cứu nấm mốc và các bệnh do chúng gây ra đã
có từ lâu, song thời kỳ phát triển mạnh nhất là sau dấu mốc quan trọng của vụ
dịch làm 100 ngàn con gà tây bị chết ở một trang trại của nước Anh do ăn phải khô dầu lạc bị nhiễm loài nấm Aspergillus flavus.
Dựa vào các đặc điểm sinh thái của nấm và đặc biệt là hàm lượng ẩm mà chúng yêu cầu, Christensen và Kaufmann 1974 đã chia các ỉoài nấm nhiẽm trên các cơ chất thực vật thành 2 loại: các loài nấm nhiễm trên cây trồng đang sống được gọi chung là hệ nấm ngoài đồng (field fungi) và nấm nhiễm trên
các bộ phân của cây như quả hạch, thân, lá, củ và rễ đã thu hoạch được gọi
chung là hệ nấm bảo quản (storage fungi)
Hệ nấm ngoài đồng bao gồm các loài nấm nhiễm trên hạt, quả, củ, lá, thân, cành của cây trước khi thu hoạch hoặc vào giai đoạn thu hoạch Chúng yêu cầu một hàm ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối (RH) từ 90-100% và đại
đa số chúng không sinh độc lố và có vai trò nhỏ trong việc gây hư hỏng thực
phẩm Các chi nấm ngoài đồng thường gặp đó là Alternaría, Cỉadosporium,
H eỉm inthosporìum và Fusarium.
Hệ nấm bảo quản bao gồm các loài nấm nhiễm trên hạt, quả, củ, lá, thân trong quả trình bảo quản sau thu hoạch và chúng yêu cầu một ham ẩm cân bằng với độ ẩm tưcmg đối 65-90% Hầu hết chúng có thể phát triển khi không có nước tự do và trên các môi trường có áp suất thẩm thấu cao Hệ nấm bảo quản đóng vai trồ chủ đạo trong việc làm giảm chất lượng các sản phẩm sau thu hoạch như gạo, ngô, lạc, dược thảo và sinh các độc tố (mycotoxin)trên các sản phẩm này ở các nước có khí hậu nhiệt đới như Việt Nam các loài
thuộc chi Aspergillus là các loài nấm bảo quản chủ đạo và các loài của chi
Peniciỉỉium giữ vai trò thứ yếu Theo Christensen [11] thì hệ nấm bảo quản có
Trang 7khoảng 12 loài của chi Aspergillus và một số loài thuộc chi Peniciỉỉium và
nấm men Chúng có mặt ở tất cả các nơi trên th ế giới, nhiễm và phát triển trôn tất cả các loại hạt lưcmg thực, hạt giống có hàm ẩm cao hơn 18% và nhiệt độ 30-32^C Đây là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển và sinh độc tố
cùa các loài nấm bảo quản Trong đó loài A ỷỉavus và sự hình thành aflatoxin
là vấn đề đáng quan tâm nhất ở vùng khí hậu nhiệt đới
Sự phân biệt hệ nấm ngoài đồng và hệ nấm bảo quản cũng chỉ mang tính
chất tưcmg đối, bởi m ột số loài nấm bảo quản trong đó có loài Ạ fla vu s đã
được phát hiện nhiều trên lạc, ngô trước khi thu hoạch (Pitt & Hocking, 1991)
1.2 Đặc điểm hình thái của một sò chi nấm quan trọng.
1.2.1 Chi Aspergillus M icheli ex Fries.
Chì Aspergiỉỉus do Micheli mô tả năm 1729, sau đó năm 1832, Fries chấp
nhận chi nấm này của Micheli và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi
Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus M icheli ex Fries.
Các loài của chi Aspergiỉỉus nhiễm khá phổ biên trên các cơ chất khác
nhau, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, các ỉoài của chi này có
tần suất xuất hiện cao hoti so với các loài của PenicilỉÌLim Một số loài đã gây
được sự chú ý đặc biệt do khả năng gây bệnh cho người và động vật hoặc khả
năng sinh độc tố của chúng Đáng quan tâm nhất là các loài A flavus, A
parasiticus tạo độc tố gây ung thư gan aflatoxin [18,25,28],
Một số khác, đặc biệt ỉà loài A oryzae đã được dùng rộng rãi trong công
nghệ lên m en truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam (làm lương), Trung Quốc, Nhật Bản [21] Hiện nay, công nghê
sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài A
niger, A, oryzae trong công nghệ sản xuất enzyme, công nghệ chế biến thực
phẩm, sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic [22,23],
Trang 8v ề mặt phân loại học chi Aspergillus có một số đặc điểm sau:
Hê sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong m ột số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của khuẩn lạc Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ một tế bào đường kính lớn hcfn, màng dày hcm các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân
- food cell) Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của scd nấm, gần như thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc ít có vách ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chuỳ, hình elip, hình gần cầu hay hình cầu Bọng hữu thụ này mang các thể bình Các thể bình này hoặc song song và họp
thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hmh tia sát nhau trên toàn bộ bề
mặt bọng Thể bình hoặc chỉ có một lẩng hoặc có hai tầng Trong trường hợp sau, mỗi thể bình cấp m ột (cũng gọi là cuống thể bình-m etula) mang một cụm
gồm 2-3 (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai ở phần đỉnh Các bào tử trần được
tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thé bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở gần miệng bao giờ cũng non nhất, càng xa càng già), không phân nhánh Bào
tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài tuỳ tùng loài Tất cả các chuỗi bào lử trần lạo thành từ các thể bình của bọng đỉnh giá họp thành khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head) Khối bào tử trần đỉnh bỏng có thể có hình cột, hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn Một
số loài có bào tử túi (ascosporum) trong các ihể quả kín (clcitothecium),
Dưới đây xin nêu một số đặc điểm sinh học quan trọng của một số loài của chi:
- Đặc điểm sinh học của 2 loài A.ỷìavỉis link ex fr và A parasiticus speare: hai loài A fla v u s và A parasiticus có mối quan hệ gần gũi (cùng thuộc nhóm loài A fla v u s, chi Aspergillus), sống hoại sinh trên các cơ chất có nguồn
gốc thực vật, đặc biệt là các cơ chất chết nguồn gốc từ các cây lương thực, thực phẩm và trong đất Hai loài này phân bố ở khắp mọi nơi trên thế giới,
nhưng phổ biến nhất là ở các nước có khí hậu nhiệt đới như ở nước ta, nơi có
Trang 9lượng mưa, nhiệt độ và độ ẩm cao Các loài thuộc chi Aspergillus có đặc trưng
là các coniđiophore không có vách ngăn Đặc điểm này của conidiophore là
khác biệt với các sợi nấm và chúng được phình lên ờ đình để tạo ihành bọng
(vesicle) Từ bọng hình thành các tế bào sinh conidi (spore-producing cell) đặc biệt gọi là thể bình (phialide) Thể bình này hoặc được sinh ra trực tiếp từ bọng gọi là thể bình m ột lớp (uniseriate) hoặc được sinh ra trên các cuống ngắn (m etulae) xuất phát từ bọng gọi là là thể bình 2 lớp (biseriate) Trong một số trường hợp việc xác định các lớp thể bình là rất khó khăn do lớp đầu tiên (lớp metulae hay cuống thể bình) rất bé và dễ bị che khuất bởi các bào tử (conidi) và lớp thứ cấp (lớp thổ bình hay lớp phialide)( ảnh 1) Khuẩn lạc của
loài A fla v u s lúc đầu thường có màu vàng-xanh sau chuyển sang xanh-vàng
hoặc xanh trên môi trường Czapek Loai này thể bình 2 lớp là phổ biến,
thường xuất hiện hạch nấm (scleroíia) màu nâu-đỏ Conidi thường khá ráp hay có mấu nhỏ (finely roughened or echinulale), thường thay đổi về kích thước và có hình dạng từ ovan cho tới hình cầu Khuẩn lạc của loài
A parasiticus có màu xanh tối trên môi trường Czapek và thường vẫn giữ
nguyên màu xanh cho tới lúc già Thể bình thường một lớp (uniseriate), hạch nấm thường không có- Conidi ihường có mấu thô, đồng nhất về hình dạng và gai (ảnh 2) [2 8 ,3 0 \
Ảnh 1: Phần đỉnh của conidiophore hình thành bọng có các thể bình sắp xếp kiểu phóng xạ (các m ũi tên chỉ) X 1000
Trang 10Ảnh 2: Thể bình và các chuỗi conidi phát triển hướng gốc
(các mũi tên chỉ) của loài A parasiticus.
Các conidi non nhất ở gốc chuỗi gần thể bình nhất X 3000 [28]
Loài Aspergillus fla va s Link ex Fres khi nuôi cấy Irên môi trường Czapek
ở TỈ^C, 10 ngày tuổi, khuẩn lạc có đường kính 6,0 - 8,0 cm, bề mặt dạng len,
mặt trước có màu lục vàng, mặt sau không màu hoặc nâu hồng, có giọt tiết hoặc không, không có sắc tố hoà tan xung quanh Gía bào tử trần có bề mặt ráp hoặc nhẩn, chiều dài 100 ” 150 p.m có khi lên đến 500 - 800 lum, đường kính 1 5 - 2 0 p.m Khối bào tử trần có hình tia toả tròn hoặc hình cột, đưòíng kính 300 “ 500 p.m, bọng đỉnh giá có hình cầu hoặc hình chuỳ, đường kính 25
- 40 Ịim, có hoặc không có cuống thể bình, đường kính 5,0 - 10,0 |im Thể bình có kích thước 6,5 - 12,0 X 3,0 - 6,0 |im Bào tử trần có dạng hình cầu hoặc hình trứng bề mặt có gai, đường kính 3,0 ” 6,0 [22],
Loài Aspegiỉỉiis parasiticus Link ex Fres khi nuôi cấy trên môi trường
Czapek ở 27°c, 10 ngày tuổi, khẩn lạc có đường kính 3,0 ~ 5,5 cm, bề mặt dạng len, xốp nhẹ, mặt trước có màu lục vàng, xanh lục, mặt sau có màu kem hay nâu nhạt, không có sắc tố hoà tan quanh khẩn lạc, không có giọt tiết Giá bào tử trẩn có bề mặt ráp hoặc nhẩn, chiều dài 300 - 700 ỊLim Khối bào tử trần
có dạng hình cầu hoặc hình tia toả tròn, đường kính khoảng 300 - 450 ^im
Trang 11Bọng đỉnh giá có dạng gần cầu, đường kính 2 0 - 35 fj,m, không có cuống thể bình Thể bình có kích thước 7,0 - 9,0 X 3,0 - 4,5 |j.m Bào tử trần có dạng hình cầu, bề mặt ráp hoặc có gai, đường kính 3,5 - 5,5 |um [22J.
- Đặc điểm của loài Aspergillus niger: khi nuôi cấy trôn môi trường
Czapek ở 27^ c , 10 ngày tuổi, khuẩn lạc có đường kính 4,5 - 7,5 cm, màu đen Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau hình tia toả tròn hoặc tách thành các cột có đường kính 700 - 800 ^m, đôi khi có các khối bào tử trần nhỏ màu nâu đen Giá bào tử trần nhẵn, dài 1,5 " 3,0 cm Bỏng đỉnh giá hình cầu, đường kính 45 - 75 |um Cuống thể bình phần lớn 5,0 - 6,0 X 20,0 - 30,0 |um, đôi khi 6,0 - 10,0 X 60,0 - 70,0 p.m Thể bình 3,0 - 3,5 X 8,0 - 10,0 |um Bào tử trần hình cầu, phần lớn có đường kính 4,0 - 5,0 Ịim, ráp hoặc có gai không đều thành chuỗi góc non [22]
- Đặc điểm loài Aspergillus versicolor: nuôi cấy trên môi trường Czapek
ở 27° c , 10 ngày tuổi, khuẩn lạc có đường kính 2,0 - 3,0 cm, màu trắng, sau
vàng, vàng da cam, lục vàng, lục tuỳ từng chủng Khối bào tử trần thường chỉ
có một loại hình cầu, hình tia toả tròn, đường kính 100 - 125 |im Giá bão tử trần nhẩn, không màu hoặc có màu nhạt Bọng đỉnh giá có dạng từ gần cầu tới elip, đường kính 1 2 - 1 6 ^m, mang cuống thể bình và thể bình Thể bình phần lớn 5,5-8,0 X 2,5-3,0 ^m Cuống the bình 2,0-2,5 X 5,0-7,5 Ịiin Bào tử trần hình cầu, đường kính 2,0 - 3,5 |im, có gai Đôi khi có tế bào Hulle [221
1,2.2 Chi Peniciỉlỉum Link ex Fries.
Chi Penicilỉium thuộc họ M oniliaceae, bộ M oniliaỉes, lớp Nấm bất toàn
trong hệ thống phân loại hình thái Saccardo ỉ 886
Chi Peniciỉlium đặc trưng bỏi các đặc điểm sau:
Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng M ặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các
Trang 12sắc tố hoà tan tương ứng Khuẩn Ịạc có hoặc không có vết khía xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc không có giọl tiết.
Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đồi khi có màu sẫm
Bộ máy mang bào tử trẩn (còn gọi là “chổi” , penicillus) (Ảnh 3) hoặc chỉ
gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo ỉ vòng,
monoverticillate) hoặc gồm giá bào tử trần với 2 đến nhiều cuống Ihể bình (metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình có các thể bình (cấu tạo 2 vòng, biverticillate) Trường hợp các giá bào tử trần mang một hoặc nhiều nhánh ở phần ngọn giá, sau đó các nhánh mang các cuống Ihể bình và các cuống thể bình lại mang các thổ bình cũng được coi là cấu tạo hai vòng Khi các cuống thể bình xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo 2 vòng
đó được coi là cấu tạo 2 vòng đối xứng Trường hợp các cuống thể bình xếp không đều đặn trên phần ngọn giá hoặc có nhánh, cấu tạo này được coi là cấu tạo 2 vòng không đối xứng Trường hợp giá bào lử trần mang nhiều nhánh và các nhánh này cùng với các cuống thể bình, các thể bình xếp đều đặn và sát nhau, đây là bộ máy mang bào tử trần có cấu lạo nhiều vòng (polyverticiỉlate).Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau
và khuẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinale) Giá bào tử trần có thể là nhánh của các sợi nấm khí sinh, khuẩn lạc trong trường hợp này có dạng len hoặc xốp bông (lanate, floccose) Trường hợp các giá bào tử trần là các nhánh của
bó sợi hoặc bản thân chúng tụ lại với nhau thành các bó giá, khuẩn lạc đặc trưng bởi các bó sợi (funiculose) hoặc của các bó giá (fasciculate)
T ế bào sinh bào tử trần của các loài ihuộc chi Penicỉỉỉium là các thể bình
Thể bình của nhiều loài của chi nấm này có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ đần, phần đỉnh này thường có đường kính khoảng 1/3 đường kính phần ihân Một
Trang 13số loài thuộc nhóm loài Biverticillata-Symmetrica có thể bình hình mũi dáo (thể bình có phần đỉnh tương đối dài và thon nhỏ dần).
Bào tử trần của các loài thuộc chi PeniciỊìium thuộc tip phialoconidi (tip
cơ bản euconidi), không có vách ngăn, hình cầu, gần cầu, hình trứng, elip đôikhi hình trụ Bào tử trần thường không màu hoặc màu nhạt khi đứng đcfn độc,khi tụ họp thành đám thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám Các bào tử trần tạo thành chuỗi dài trên miệng thể bình
M ặt ngoài của bào tử trần, giá bào tử trần, các nhánh, cuống thể bình, thểbình có thể ráp, nhẩn, có gai hoặc sần sùi hay gồ ghề
Ảnh 3: Bộ máy mang bào tử trần của chi PenÌciUium.
Trang 141.3 Tinh hình nghiên cứu mức độ nhỉễm nấm mốc trên dược liệu ở Việt Nam.
Do sự p h át triể n của nồn ỵ học cổ truyền ngày càng lớn m ạnh đã làm cho k hối lượng và chủng loại dược liệu , đặc b iệt là các dược liệu có nguồn gốc dược thảo ngày càng tăng cả về lượng tiêu dùng cũng như lượng bảo qu ản , lưu thông buôn bán Q ua thực tế của công tác thu hoạch, bảo quản và tiêu dùng cho thấy các dược thảo này rất dễ bị m ốc.Tuy n h iên các cồng trìn h n g hiên cứu về m ức độ n h iễm nấm m ốc và
m y co to x in trên dược liệu còn rất ít M ặc dầu vậy cũng đã có m ột số công trìn h đáng chú ý Đó là công trình n ghiên cứu về hệ nấm m ốc đặc trưng trên dược liệu ở kho của tác giả N g u y ễn Thị Sinh năm 1984 [4]
M ột số dẫn liệu quan trọng, giúp định hướng cho các công trìn h nghiên cứu tiếp theo về nấm m ốc và m ycotoxin trên dược liệu mà tác giả đã công bố là: hệ vi nấm đặc trưng trên dược liệu bảo quản trong đó nổi
b ật là các loài của 2 chi A sp erg illu s vờ p e n ic iỉliu m , đặc b iệt là sự xuất
h iện của loài A fla v u s trên 80% dược liệu n g h iên cứu N goài ra tác giả
cũng cho b iết độ ẩm tương đối (R elative H u m id ity ) tối th iểu cần th iết cho sự p h át triể n của hệ vỉ nấm dược ỉiệu ở kho ỉà 75%
M ột công trìn h n g h iên cứu khác m ang ý n g h ĩa thăm dò của tác giả
N g u y ễn Hữu T uấn [6] về sự có m ặt của loài A fla v u s và khả năng tạo aflato x in trên dược liệu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm A fia v u s là khá cao
(90% ) T uy n h iên do th iếu chất chuẩn afla lo x in tác g iả ch ỉ phát hiện được afla to x in G2 trên các m ẫu dược liệu nần nghẹ và ngưu tất đã
n ghiên cứu
Công trìn h n g h iên cứu gần đây nhất (1 /2 0 0 3 ) của tác g iả T rần T rịnh
C ông [2] , n g h iên cứu về mức độ nhiễm nấm m ốc và a íla to x in BI trên
m ột SỐ vị th u ố c đôn g dược đang lưu hành trên đ ịa bàn Hà N ội K ết quả
Trang 15của công trìn h đã cung cấp cho chúng ta những bằng chứng cụ thể về
m ối đe dọa tiềm tàn g của nấm m ốc và độc tố a fla to x in , nhất là các vị thuốc có nguồn gốc quả và hạt T rong số 6/15 vị th u ố c có nguồn gốc quả, h ạt m à tác g iả n g h iên cứu đã phát hiộn thấy 4 vị th u ố c là nguồn cơ
ch ất rất phù hợp cho cho các loài nấm sinh độc tố phát triển Vị thuốc đầu tiên m à ch ú n g ta không thể không nói đến là h ạt sen, m ột loại hạt không chỉ được dùng phổ biến làm th u ố c từ lâu đời m à còn được dùng
phổ biến tro n g dân gian làm thực phẩm đã bị n h iễm loài A fla v u s trung
bình tới 40 % trong các m ẫu tác giả n g hiên cứu Đ ặc b iệt hơn tác giả đã phát hiện th ấy 4 /2 0 m ẫu hạt sen lấy ở các h iệu th u ố c đông dược và các chợ thực phẩm bị nhiễm aflatoxin BI với hàm ỉượng dao động 17,5-434 ppb T rong k h i đó giới hạn tối đa của độc tố n ày trên lương thực, thực phẩm m à ngành ỵ tế cho phép chỉ là 10 ppb H ai vị th u ố c khác trong số
6 vị th u ố c có n g u ồ n gốc quả, hạt là ngũ vị tử và phá cố chỉ đã bị nhiễm
loài A n ig e r lần lượt là 91 và 30,6 % Đ ây là m ột loài tuy không phải là loài ngu y h iểm như A ỷĩavus hay A p a ra s itic u s nhưng cũng có khả năng
sinh aflato x in V ị thuốc cuối cùng trong sổ 6 vị có nguồn gốc quả, hạt
mà tác g iả đã n g hiên cứu là bá tử nhân cũng cho ihấy đây là cơ chất đặc
trưng của m ột loài nào đó thuộc chi P eniciU ium , chi nấm m à theo các
nhà n g h iên cứu độc tố nấm trôn th ế giới là có k h ả năng sinh nhiều
m y co to x in có hại cho người và động vật [13]
Trang 16PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1 N G U YÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PH Á P T H ự C NG H IỆM
2.1.1 Vật liệu.
2.1.1.1 Đ ối tượng nghiên cứu.
Các vị thuốc đông dược nghiên cứu được thu thập ở các hiệu thuốc trên
địa bàn thuộc 3 tỉnh Hà Tây, Bắc Ninh và Hải Dương:
- Binh lang: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mâu ở Bắc Ninh và 2 mẫu ở Hà Tây.
- Ý dĩ: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mẫu ở Bắc Ninh và 1 mẫu ở Hà Tây
- Hạt sen: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mẫu ở Bắc Ninh và 3 mẫu ở Hà Tây
- Táo nhân: 3 mẫu ở Hải Dương, 1 mẫu ở Bắc Ninh và 3 mẫu ờ Hà Tây.
- Ngũ vị tử: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mẫu ở Bắc Ninh và 1 mẫu ở Hà Tây
- Sa nhân: 3 mẫu ở Hải Dương và 1 mẫu ở Bắc Ninh
- Nhục đậu khấu: 3 mẫu ở Hải Dưoìig, 1 mẫu ở Hà Tây
- Kha tử: 3 mẫu ở Hải Dương và 1 mẫu ở Bắc Ninh.
2.1.1.2 M ôi trường phân lập và xác định nấm mốc,
- Môi trường PDA (g/1): Glucosc: 20g; thạch: 15g; dịch chiết khoai tây: 1
lit.
- Môi trường Czapek ~ Dox (g/1): Sacarose: 30g; NaNOg 3,0g; KCl 0,5g;
K2HPO4 l,Og; MgS0 4.7 H2 0 : 0,5g; FeSO^-VH^O: 0,01g; Thạch: 17,5g; nước cất vừa đủ lOOOml; pH = 5 - 6, Khử trùng ở 121‘^c trong 15 phút
- Môi trường AFPA (xác định nhanh các chủng thuộc 2 loài A fla vm vả
A.parasiticus): Peptone: lOg; Cao nấm men: 20g: sắt amoni citrat: 0,5g;
Chloramphenicol: 0 ,lg ; Thạch: 15g; nước vừa đủ 1 lít Khử trùng ỏ 121^c trong vòng 15 phút
Trang 172.1.2 Phương pháp nghĩên cứu.
2.1.2.1 Phương ph áp lấy mẫu.
Phưcrng pháp lấy mẫu hạt dựa trên cơ sở phưcnig pháp của FAO [16] Các mẫu hạt được bảo quản ở dạng đóng bao lấy bằng 10% số bao trong toàn lô hàng Mẫu đại diện có trọng lượng khoảng lOkg Mãu đại diện được Irộn đều, chia theo phucfng pháp đường chéo, lấy ỉkg làm mẫu đại diện phụ.^M ^^đại diện phụ lại được trộn đều, lấy một phần tư theo phương pháp chia theo đường chéo để nghiên cứu nấm mốc
2.1.2,2, Phương p h á p xác định mức độ nhiễm nấm mốc.
Phương pháp này được tiến hành theo phương pháp của Samson và cộng
sự [24] Mức độ nhiễm này được tính bằng phần trăm hạt bị nhiễm các chi hay loài từ bên trong các vị thuốc Các mẫu dược ỉiêu được khử trùng hệ nấm bên ngoài bằng cách ngâm trong dung dịch H2O2 4% trong 6 - 7 phút Sau đó rửa sạch bằng nước cất khử Irùng 5 lần Để ráo nước và đặt nhanh các mẩu dược liệu vào đĩa petri đã có môi trường PDA bằng kẹp vô trùng Mỗi mẫu dùng 5 dĩa mỗi đĩa đặt từ 5-15 mẩu tuỳ từng vị Sau đó ủ ở nhiệt độ 25*^c - 35®c sau 3-7 ngày tuỳ theo nhiệt độ cao hay thấp, phân lập các chủng nấm mọc chuyển sang môi trường Czapek - Dox, ủ ở nhiệt độ 25° c sau 3,5,7 ngày tiến hành các bước phân loại và kết luận Trên cơ sư đó tính % mức độ nhiễm nấm mốc nói chung, mức độ nhiễm các chi và loài nấm nói riêng của từng vị thuốc
2 ,1 3 3 Phương ph áp phán loại nấm mốc.
- Phân loại các chi nấm theo khoá phàn loại của Barnett và Hunter [10].
- Phân loại các loài thuộc chi Aspergillus theo khoá phân loại của Raper
và Fennell [23],
- Xác định các chủng của 2 loài Aspergỉỉhis flaviis và A parasừicus bằng phucfng pháp sinh hóa của Pitt & Hocking [22].
Trang 182.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét.
2.2.1 M ức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu hạt sen nghiên cứu.
Hạt sen ( Semen Nclumbinis ) còn gọi là liên nhục, là hạt còn màng mỏng của quả già đã phơi hay sấy khô của cây sen (Nelumbo nucífera Gaertn) Thành phần hoá học có nhiều linh bột, đường, proũt, chất béo Ngoài ra còn
có m ột tỷ lệ nhỏ canxi, phốt pho, sắt Trong tâm sen có asparagin và ancaloit
Từ những m ẫu hạt sen đã thu thập để nghiên cứu chúng tôi thu được kết quả
về mức độ nhiễm nấm mốc được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu hạt sen nghiên cứu
Mức đô nhiêm các chi và loài nấm chủ /ếu (%)
Trang 19Kết quả khảo sát mức độ nhiễm nấm mốc của 8 mẫu hạt sen thu thập ở các địa phương khác nhau cho thấy tất cả các mẫu hạt sen nghiên cứu đều bị nhiễm nấm mốc với tỷ lệ dao động từ 3 - 75 % (ảnh 4), trong đó tỷ lệ nhiẻm
loài A, fla va s là 1-35 % (trung bình 9 %), một tỷ lệ đáng quan tâm về khả
năng nhiễm aflatoxin của các mẫu hạt sen nghiên cứu Bên cạnh đấy tỷ lệ
nhiẻm chi Penicilinm dao động từ 1-15 % cũng là điểm cần lưu ý về khả năng
nhiễm độc tố cùa chi này Qua kết quả khảo sát cũng cho thấy không có mặt
của loài A.parasiticus ưên các mẫu hạt nghiên cứu Ngoài ra trên các mẫu hạt sen còn có mặt một tỷ lệ nhỏ của 2 chi là Fusarium (1-6 %) và Rhizopus (1-5
%) trong 6 mẫu nghiên cứu
Ảnh 4: Nấm mốc nhiêm trên hạt sen thu thập ở Hải Dương
Trang 20S l'l
Dia diem
lay mau
Ty le % hat nhi6m namm6c
Mure do nhi6m cac chi va loai chu yeu (%)
Aspergillus
Penicillium M ucor A.flavus A.niger
A.flaviis vdi ty 16 dao dOng 2-10 % Ben canh do cac loai cua chi Penicillium
cung bi nhi^m 4/6 m^u vcfi ty 16 dao dong la 1-12 %
Anh 5: Nam moc nhiem tren hat y dl thu thap cf Hai Ducmg
\
