Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam

Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam Triển khai phương pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm artesunat đang lưa hành ở việt nam

B ộ Y TẾ TRUỜNG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI •

ĩỊí #|c #Ịc ĩỊc ĩỊc ĩỊc

NGUYỄN ANH TUĂl

TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP HPLC

ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TIÊM ARTESUNAT

ĐANG LƯU HÀNH ở VIỆT NAM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC

DS ĐÀO THỊ KIM OANH Nơi thực hiện : Phòng thí nghiệm bộ môn Hoá dược

Trường đại học dược Hà Nội Thòi gian thực hiện: 11/2004 - 5/2005

HÀ NỘI, THÁNG 5-2005

;UUD

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS - TS Trần Đức Hậu, Ds Đào Thị Kim Oanh, hai người thầy trực tiếp hướng dẫn, đã dành nhiều công sức giúp đỡ vổ truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp.

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ môn Hoá Dược - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khoá luận.

Trong quá trình thực hiện khoá luận này tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô ở các bộ môn Công Nghiệp Dược Tôi xỉn chân thành cảm ơn.

Cuối cùng, tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên và hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành khoá luận này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2005

Nguyễn Anh Tuấn

DHA: Dihydro artemisinin

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng caoTW1 : Trung ương 1

P h ần 2 ĐÔÌ Tư;JNG - HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ PHUÍNG

2.1 Đối tượng nghiên cứu 182.2 Phưoíng tiện, dụng cụ hoá chất 182.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 192.4 Xử lý và đánh giá kết quả 19

3.1 Cải tiến phương pháp HPLC 203.2 Khảo sát, đánh giá phương pháp vừa cải tiến 203.2.1 Đánh giá tính thích hợp của hệ thống 203.2.2 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp 213.2.3 Đánh giá tính đúng của phương pháp 233.2.4 Đánh giá tính chính xác của phương pháp 243.2.5 Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp 253.3 Đánh giá chất lượng thuốc tiêm artesunat đang lưu hành ở Việt

3.3.1 Đánh giá về độ đồng đều khối lượng 283.3.2 Đánh giá về hàm lượng 333.4 Kết quả và bàn luận 37Phần 4 Kết luận và đề xuất 39

Tài liệu tham khảo 40

ĐẶT VẤN ĐỂ

Sốt rét là một bệnh xã hội, dễ bị lây nhiễm, gây ra bởi sinh trùng sốt rét,

ký sinh trùng này thuộc chi Plasmodium Những loài gây bệnh cho người chủ yếu gồm:

Hiện nay ký sinh trùng sốt rét đã kháng lại hầu hết các loại thuốc quen thuộc: Quinin, Qoroquin, Quinacrin, Mefloquin, Làm cho việc điều tri sốt rét ngày càng trở nên khó khăn hơn [18] Trong thòd gian mười năm trở lại đây artemisinin (hoạt chất chiết từ cây thanh hao hoa vàng) và các dẫn chất của nó được đưa vào điều trị cho kết quả rất tốt, đặc biệt là artesunat Đây là thuốc cắt cơn sốt nhanh, ít bị tái phát hofn artemisinin, có tác dụng cả với chủng p.falciparum đã kháng cloroquin Thuốc qua được hàng rào máu não, nên có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét thể não

Nước ta hiện nay cũng đã tổng hợp được artesunat, và đang đưa vào sản xuất với qui mô lớn Việc kiểm tra chất lượng chế phẩm artesunat là rất quan

trọng, tuy nhiên trong thực tế việc định lượng aitesunat ở các cơ sở cho thấy

còn nhiều điều bất cập, thường cho kết quả rất cao phụ thuộc người định lượng

Để xây dựng một phương pháp định lượng artesunat có tính đặc hiệu cao đồng thòd góp phần làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam, trong khoá luận này, để rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi cải tiến phương pháp định lượng đã xây dựng trong khoá luận dược sỹ đại học của Nguyễn Thanh

Tùng và tiến hành triển khai phưofng pháp HPLC để định lượng thuốc tiêm

artesunat đang lưu hành ở Việt Nam với những mục tiêu sau:

- Cải tiến quy trình định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC ¡21J

- Tiến hành khảo sát đánh giá quy trình định lượng artesunat bằng HPLC đã cải tiến.

- Áp dụng quỵ trình định lượng đã cải tiến, để định lượng artesunat trong

một số lô thuốc tiêm sản xuất ở Việt Nam, qua đó đánh giá chất lượng thuốc tiêm artesunat đang lưu hành ở Việt Nam trên hai mặt hàm lượng và độ đồng đêu khối lượng.

Aitemisinin được khử hóa nhóm lacton thành dihydro artemisinin bỏi natri borohydrid (NaBH4) trong môi trường methanol và ở nhiệt độ 0-5°C Sơ

đồ phản ứng như sau:

• Giai đoan 1:

Kết quả thu được DHA ở hai dạng đồng phân là a và p.

Giai đoạn 2:

DHA được este hóa thành aitesunat khi tác dụng vói anhydrit succinic hoặc acid succinic với xúc tác là dimethylamino pyridin (DMAP) hoặc hỗn hợp của DMAP và dicyclohexyl carbodiimid (DCC)

Ngày nay, từ DHA ngưòd ta còn có thể bán tổng hợp ra nhiều chất khác

có hoạt lực tác dụng tương tự như artesunat, đó là arteether (AE) và artemether (AM), bằng cách cho DHA tác dụng vơi ethanol hoặc methanol, xúc tác là acid Lewis, AE và AM tan tốt trong dầu và có hoạt tính chống sốt rét ngang với artesunat

Ngày nay ngưòi ta còn điều chế ra một dẫn chất mới, có hoạt lực cao trên

ký sinh trùng sốt rét đó là: acid aitelinic Chất này vừa có hiệu lực cao hơn artemisinin, AM, hơn nữa muối naphten của nó lại tan được trong nước nên có thể chế được cả thuốc tiêm, thuốc viên [5]

1.1.3 Tính chất [4]

Tinh thể không màu hay bột kết tinh màu trắng, không mùi, không vị, dễ tan trong ethanol, aceton, cloroíom, benzen, khó tan trong nước, kém bền vững trong môi trường acid hay kiềm Dạng muối Na của nó dễ tan trong nước, do vậy có thể dùng để pha thuốc tiêm

Năng suất quay cực của artesunat: [a]o = (+10®) -(+14°)

1.1 A Tác dụng

Diệt thể phân liệt trong máu của tất cả các chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do p.íalcparum, không diệt thể giao bào, và không tác dụng trên giai đoạn ngoài hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh[8]

1.1.5 Dược đông học

Aitesunat dùng theo đường uống được hấp thu từ 24-64%, thời gian bán thải ti/2=41 phút Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển hóa qua gan, thuốc qua được rau thai nên tránh dùng thuốc cho phụ nữ có thai Aitesunat thải trừ qua đường nước tiểu dưói dạng chuyển hoá là: Deoxy aitemisinin, dihydro deoxy artemisinin

1.1.6 Tác dụng không mong muốn

Nhẹ và thoảng qua như: rối loạn tiêu hoá, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt

1.1.9 Các phương pháp định lượng artesunat

-Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng tử ngoại [1]

Artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại có bước sóng ngắn Saukhi đun nóng trong môi trường kiềm, artesunat chuyển thành Q289 là sảnphẩm cổ độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289 nm Do đó có thể định lượng artesunat trong phế phẩm và nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 289nm

-Phương pháp HPLC với detector u v

Định lượng aitesunat với pha động là acetonitril- đệm phosphat pH=5,l (tỷ lệ 38:62) [20] hoặc vói pha động acetonitril-đệm acetat pH=5,5 (tỷ lệ 1:1) [19], bước sóng phát hiện là 235nm Để định lượng artesunat trong dược liệu, trong các dịch sinh học người ta sử dụng phương pháp HPLC pha động: 48% Cíỉ3CN+31% dung dịch KH2PO4 0,05M trong nước + 20% nước

- Phương pháp HPLC với detector khúc xạ k ế [32].

- Phương pháp HPLC với detector điện hóa [28], [29].

- Phương pháp đo kiềm.

Artesunat là ester của acid succinic, và dihydro artemisinin, nên trong phân tử còn một nhóm chức acid tự do, do đó người ta có thể định lượng trực tiếp nhóm chức này bằng NaOH 0,05% với chỉ thị phenolphtalein, hoặc định lượng trong môi trường khan [32], hay là cũng có thể định lượng artesunat bằng phương pháp chuẩn độ gián tiếp [6]

- Phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối hydrxamat sắt [4]

Cho artesunat tác dụng với dung dịch hydroxylamin hydroclorid trong môi trường kiềm Sau đó, cho phản ứng với dung dịch sắt (in) clorid trong môi trường HCL sản phẩm tạo thành có màu tím đỏ Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch này

- Các phương pháp định lượng khác

- Phương pháp cực phổ

- Phương pháp phân tích phóng xạ miễn dịch

Nhân xét:Các phương pháp định lượng Artesunat đang sử dụng ở nước ta, hoặc khó thực hiện (Phương pháp HPLC với detector điện hoá, phương pháp HPLC vói detector khúc xạ kế, phương pháp cực phổ, phương pháp phân tích phóng xạ miễn dịch), hoặc không đặc hiệu [4] (Sự có mặt của DHA ảnh hưởng rất lớn đến kết quả định lượng theo phương pháp đo quang phổ tử ngoại Sự có mặt của acid succinic ảnh hưởng rất lớn đến đối vói kết quả định lượng theo phương pháp chuẩn độ bằng kiềm Các phưcfng pháp khác tính đặc hiệu cũng không cao, chính DHA cũng ảnh hưởng tới kết quả định lượng) Do vậy chúng tôi triển khai áp dụng phương pháp HPLC để định lượng artesunat.1.2 Phương pháp HPLC

1.2.1 Nguyên tắc

HPLC là phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực giữa các chất với hai pha: Pha tũih, (cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ, hoặc phân bố, liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bofm pha động vói áp suất cao qua cột thì tuỳ thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được

chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được đưa ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:

1 Bơm cao áp để bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký Bơm này phải điều chỉnh được áp suất ( thường là 0 - 400 bar) để tạo

ra được những tốc độ dòng nhất định của pha động qua cột, phù hợp vói quá trình sắc ký.

2 Van tiêm mẫu để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký Đó là các van 6

chiều có chứa vòng mẫu thể tích 20, 50 hay 100 jLi\, hoặc máy tiêm

mẫu tự động

3 Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh, quyết định sự tách một hỗn hợp mẫu Cột tách có nhiều cỡ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 - 25 cm; đường kính trong từ 2 - 5 mm

4 Bộ phận phát hiện: là các detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ như;

+ Detector hấp thụ quang phân tử

+ Detector phổ nguyên tử

+ Detector huỳnh quang

+ Detector điện hoá ( đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng )

+ Detector khúc xạ kế

+ Detector đo độ dẫn nhiệt

Tuỳ thuộc theo chất phân tích mà chọn detector cho phù hợp để đạt được

độ nhạy cao khi phát hiện các chất Trong các loại trên thì detector hấp thụ ƯV-vis , hiện nay đang được dùng phổ biến nhất

5 Bộ phận chỉ thị kết quả Phổ biến nhất là máy tự ghi (recorder), để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic

Đó là 5 bộ phận cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HP

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện, phóng đại vàghi thành sắc ký đồ

Hìnhl Giản đồ sắc kỷ hai chất 1 và 2

+ Ir :Thời gian lưu

+ to :Thời gian chết

+ tR’(Thời gian lưu thực) = tß - to-

+ Wq 5 (Độ rộng píc ở nửa chiều cao)

+ Wị, ( Độ rộng ở đáy píc )

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi Để đặc trưng cho một chất, thuận lợi hơn ngưòi ta dùng hệ số dung lượng K’:

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

ký, đã người ta thưòrng sử dụng độ phân giải R giữa hai pic cạnh nhau Độ phân giải giữa hai pic (picl và pic2) được tính theo công thức sau:

Trong thực tế: R= 0,75 hai pic không tách tốt còn xen phủ nhau nhiều

R= 1,0 hai pic tách khá tốt còn xen phủ nhau 4%

R= 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%

Để đặc trưng cho hiệu lực của cột, người ta sử dụng số đĩa lý thuyết (N), và chiều cao của đĩa (H):

N = 1 6 ; hoặc N = 5,54

\wy,\

Trong đó: + Wb là chiều rộng ở đáy pic

+ Wj/2 là chiều rộng ở nửa chiều cao của pic Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết được tính bằng công thức:

ở đây : w là độ rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

1.2.4 Pha tĩnh trong HPLC

Pha tĩnh trong HPLC, là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp

có nhiều thành phần Nó là một chất rắn xốp và có kích thước hạt rất nhỏ,

đường kúih cỡ hạt từ 3-10 ụ m, diện tích bề mặt riêng từ 50-500

mVg-Pha tĩnh trong HPLC là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Có nhiều loại sắc ký trong HPLC nhưng pha tĩnh chỉ có 2 trạng thái là rắn hoặc lỏng,

Điều kiện đối vói pha tĩnh :

+ Phải trơ, và bền vững vói các điều kiện của môi trường sắc ký.+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan, trong những điều kiện sắc ký nhất định

+ Tính chất bề mặt phải ổn định

+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh, và lặp lại tốt + Cỡ hạt phải tưofng đối đồng nhất

Có thể liệt kê một vài loại cột trong pha đảo và pha thuận vói các thương phẩm phổ biến trong bảng sau:

Bảng 1: một số loại cột phổ biến

Loại sắc ký NhómR Tên thương mạiPha thuận -OH Lichrosorb Si 60( Silicagen trung tính ) Aminopropyl (- C3H6-NH2)

Cyanopropyl (- CgHg-CN)

Nucleosil C8

Octyl (- ) Supelcolsil LC8

Pha đảo Lichrosorb RP8

( Silicagen đã alkyl Zorbax C8

Nucleosil LC18Octadecyl (- C18H37) Zorbax ODS

LIPaitisil ODSlSupelcosil LC18Phenyl ( - QH5) L ll

1.2.5 Pha động trong HPL€

Pha động là dung môi để rủa giải chất tan (chất phân tích ) ra khỏi cột sắc ký Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi, tuỳ vào đặc điểm chất phân tích Pha động quyết định thời gian lưu của chất tan và hiệu quả tách sắc ký

Pha động phải thoả mãn các điều kiện sau:

+ Phải trơ với pha tĩnh

+ Phải hoà tan được chất mẫu

+ Phải bền vững theo thòi gian

+ Phải có độ tinh khiết cao

+ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

+ Phải phù hợp vói loại detector

+ Phải kinh tế

Có bốn yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của một hỗn hợp mẫu:

+ Bản chất của dung môi để pha pha động

+ Thành phần của các chất tạo ra pha động

+ Tốc độ của pha động

+ pH của pha động

1.2.6 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động

Cách chọn pha tĩnh, và pha động thích hợp để tách được hỗn hợp chất cần phân tích là rất quan trọng Dựa vào tính chất của mỗi pha đã nêu trên ngưòi ta chọn hệ pha tĩnh, pha động phù hợp nhau, chẳng hạn:

+ Sắc ký pha thuận: Pha động là các dung môi hữu cơ kị nước, không phân cực hay ít phân cực Cột hay sử dụng là cột Lichrosorb Si 60

+ Sắc ký pha đảo: Pha động là nước hoặc các dung môi tan được trong nước, điển hình là methanol, acetonitril Nói chung dung môi cho hệ pha đảo

là nước cất, alcoL Ngoài các dung môi chính còn có các dung dịch đệm pH (hay sử dụng dung dịch đệm phosphate) để ổn định cho quá trình sắc ký, chất tạo phức để rửa giải chọn lọc, chất tạo phức cặp ion, sắc ký pha đảo thưòrng dùng để tách các chất phân cực Có nhiều cột để lựa chọn, loại thường sử dụng

là cột alkyl hoá Cg, Cj8 với các tên thương phẩm khác nhau

Tuỳ theo điều kiện cơ sở và phương pháp tiến hành thí nghiệm mà ngưcd

ta chọn loại cột thích hợp ví dụ:

+ Khi chọn cột C18 người ta dùng hệ pha động là acetonitril : acid phosphoric hoặc methanol : hệ đệm phosphate hoặc nước : methanol : acid acetic băng theo các tỷ lệ nghiên cứu phù hợp vói chất phân tích

Việc chọn pha tĩnh, và pha động phù hợp với chất phân tích có tính chất quyết định, cần chọn lựa, thay đổi sao cho phù hợp để việc phân tách đạt kết quả cao nhất Mặt khác, cũng phải lưu ý đến chi phí khi lựa chọn pha tĩnh, và pha động.

Trong đề tài này aitesunat là hợp chất hữu cơ phân cực Vì vậy để phân tích và định lượng tốt chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC pha đảo

- Chọn cột sắc ký: Các loại cột sắc ký pha đảo thông dụng là nucleosil

C8, C18; lichrosorb RP8, RP18; supelcosil LC8, LC18

-ơiọn pha động:Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là nước, acetonitril, methanol, hay hỗn hợp của methanol (acetonitril) với nước Do artesunat dễ tan trong methanol, nên để kéo dài thời gian lưu thích hợp của chất cần phân tích, pha động phải cần nước; để khống chế mức độ iôn hoá của artesunat, cần sử dụng đệm PH acid

1.2.7 Detector

Khi hệ pha động rửa giải các chất ra khỏi cột chúng được ghi nhận bỏi Detector và chuyển thành tín hiệu được ghi trên sắc ký đồ Có nhiều loại Detector như:

+ Detector huỳnh quang và Detector điện hoá, có độ nhạy và độ chọn lọc cao, chủ yếu được dùng trong phân tích vết và phân tích y sinh học

+ Detector tử ngoại (Đèn Deuterium) và khả kiến (Đèn Vonfram) có thể làm việc ở bước sóng tuỳ chọn theo tính chất hấp thụ của chất cần phân tích Loại này hiện nay được dùng rất phổ biến

Tuỳ theo chất cần phân tích, mà ngưòi ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau Khi các thành phần nằm trong dạng phối hợp, muốn định lượng đồng thời ngưòi ta phải chọn đặt bước sóng phù hợp vói hỗn hợp cần phân tích (bằng cách quét quang phổ dung dịch các chất đem chạy sắc ký được pha trong dung môi pha động tương ứng, có ưu tiên cho chất có độ hấp thụ riêng nhỏ hơn hoặc chất có nồng độ nhỏ nhất)

1.2.8 Phương pháp định lượng, cách đánh giá pỉc và tính kết quả trong HPLC

> Cách đánh giá diện tích pic

- Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic, ngưòi ta có thể dùng tích phân kế, hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình

- Đánh giá chiều cao của pic: Điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao của pic là các chỉ số k’ hằng định Đo chiều cao pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình

> Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc là: Nồng độ của chất tỷ lệ vói chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký;

-Phương pháp ngoại chuẩn:

Dựa trên việc so sánh mẫu thử và mẫu chuẩn được phân tích trong cùng một điều kiện Kết quả của chất chưa biết được tính toán dựa trên chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn

- Phương pháp nội chuẩn:

Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký có thòi gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Phương pháp thêm:

Phưcfng pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn Các pic thu được của dung dịch chuẩn và thử được đo trong cùng một điều kiện sắc ký Phương pháp này có thể thực hiện nhiều lần Trường hợp đơn giản nhất với một lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích pic Với phương pháp thêm nhiều lần với nồng độ khác nhau ta có phương pháp thêm đường chuẩn

- Phương pháp phần trăm diện tich pic (hoặc phần trăm chiều cao pic):

Là phương pháp tính nồng độ của mẫu thử dựa trên diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong phương pháp HPLC, công thức này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của Detector trên các chất là như nhau nếu không như nhau, khi mỗi chất cần phải

có hệ số điều chỉnh

1.2.9 quy trình kĩ thuật định lượng Artesunat bằng phương pháp HPLC

[ 21 ]

1 Dung dịch thử : Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng o.lg

artesunat hòa tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45 micromet

2 Dung dịch chuẩn : trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng o.lg

artesunat chuẩn hòa tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch Lọc qua màng lọc0,45 micromet

3 Đệm pH 3,5 : hòa tan l,36g KH2PO4 trong nước cất và thêm nước vừa đủ đến vạch lOOOml, điều chỉnh về pH 3,5 bằng KH2PO4 đặc, sau đó lọc và siêu

âm đuổi khí

4 Pha động :đệm pH 3,5 : acetonitril: methanol (50 : 10 : 40)

5 Điều kiện sắc k í :

Cột sắc kí: Nucleosil C18 (250 X 4 mm 5 micromet)

Detector u v , bước sóng phát hiện 216 nm

Pha động: Đệm pH 3,5 : Acetonitril: Methanol tỷ lệ (50 :10 :40)

(Đệm pH 3,5 : hòa tan l,36g KH2PO4 trong vừa đủ 1000 ml nước cất, điều chỉnh về pH 3,5 bằng H3PO4, sau đó lọc và siêu âm đuổi khí)

Methanol, acetonitril được siêu âm đuổi khí trước khi sử dụng

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

Thể tích tiêm: 20//1

Nhiêt độ phân tích : nhiệt độ phòng.

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn 5 lần và ghi diện tích pic thu được trên sắc ký đồ độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic 5 lần tiêm phải nhỏ hofn 1,5% ;hệ số bất đối xứng của pic artesunat phải nhỏ hơn 1,5.

Tiêm riêng biệt những thể tích bằng nhau ( khoảng 20 //1) dung dịch thử,

và dung dịch chuẩn vào máy sắc ký Ghi các sắc ký đồ và đo diện tích các pic chính Tính hàm lượng % của artesunat có trong mẫu thử theo công thức sau:

x% = Ị ^ x p

AfjX ntg

Ms, ĩĩiu ; là lượng cân của mẫu chuẩn và mẫu thử

Phần 2

ĐỐI TƯỢNG - HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ - NỘI

DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đối tượng nghiên cứu.

+ Thuốc tiêm artesunat do xí nghiệp dược phẩm tw 1 sản xuất

+ Nguyên liệu dihydro artemisinin

+ Nguyên liệu acid succinic

2.2 Phương tiện, dụng cụ hoá chất

> Dụng cụ máy móc

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX

+ Detector PDA -110 photodiode aưay detector

+ Máy quang phổ u v -VIS Lambda EZ 210

+ Máy lắc siêu âm - SONOREX

+ Máy đo pH Meter 3305 - Jenway

+ Máy lọc chân không - Satorius

+ Cân phân tích Mettler AB 204 độ chính xác 0,1 mg

+ Bình định mức 25, 50,100,1000 ml

+ Cốc đong 50,100, 500,1000 ml

+ Pipet các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45 jum.

+ Tủ sấy và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

Tất cả các thiết bị trên đã được hiệu chuẩn và kiểm định theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025

> Hoá chất

+ Thuốc tiêm artesunat do Công ty Dược Phẩm TW 1 sản xuất

+ Artesunat: Dạng nguyên liệu do bộ môn công nghiệp dược trường đại học Dược Hà Nội sản xuất