Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

PHẦN 1: TỔNG Q U A N 3

1.1 Tổng quan về artesunat 3

1.1.1 Công thức 3

1.1.2 Nguồn gốc và cách điều chế 3

1.1.3 Tính chất 4

1.1.4 Tác dụng 5

1.1.5 Dược động học 5

1.1.6 Tác dụng không mong muốn 5

1.1.7 Chế phẩm 5

1.1.8 Chỉ đ ịn h 5

1.2 Tổng quan về tạp DHA trong artesunat nguên liệu 5

1.2.1 Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu 5

1.2.2 Tổng quan một số phươQg pháp xác đinh tạp chất liên quan trong thuốc, ưu nhược điểm, các phương pháp xác định tạp DHA .6

1.3 Tổng quan về H P L C 9

1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng c a o 9

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 10

1.3.3 Cơ sở lý thuyết sắc k ý 11

1.3.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống sắc k ý 11

1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và yếu tố ảnh hưởng 12

1.3.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc k ý 15

1.3.7 úhg dụng của H P L C 18

PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 2.1 Đối tưọng, hoá chất, thiết bị, nội dung và phưotig pháp nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng 22

2.1.2Phương tiện, dụng cụ, hoá chất 22

2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

2.1.4 Một số công thức sử dụng tính toán thống kê 23

2.2 Thực nghiệm và kết quả 24

2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc k ý 24

2.2.2 Thử tính thích hợp của hệ thống 25

2.2.3 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu 27

2.2.4Tínli chính xác của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệ u 28

2.2.5 Tính đúng của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệ u 29

2.2.6 Tính đặc hiệu của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệ u 31

2.2.7 Xác định giới hạn định lượng DHA theo phương pháp xây dựng 34

2.2.8 Xây dựng cách xác định DHA trong nguyên liệu artesunat khi không có DHA chuẩn .35

2.2.9 Kết luận 38

Phần n i: Kết luận và đề xuất 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CHỮ VIẾT TẮT

DHA : Dihydro ArtemisininHPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng caoNXB : Nhà xuất bản

PA : Tinh khiết phân tích

SKS : Số kiểm soát

UV-VIS : Tử ngoại - Khả kiếnVKN : Viện kiểm nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỂ

rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội Bệnh truyền từ người '^ n à y sang người khác do muỗi Anophen Hàng năm trên thế giới có tới

300- 500 triệu trường hợp bị mắc sốt rét [18] trong đó có khoảng 2,7 triệu ca

tử vong do sốt rét mỗi năm [23] Những vùng có số người bị bệnh sốt rét cao

là Châu Phi, Đông Nam Á, Việt Nam là một nước thuộc khu vực Đông Nam Á, và nằm trong vùng sốt rét lưu hành Hàng năm nước ta có tới 1 triệu

ca sốt rét trong đó có 30.000 ca sốt rét ác tính [11]

Việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét càng ngày càng kháng mạnh với các loại thuốc điều trị sốt rét trước đây như: Cloroquin, Mefloquin, Primaquin, [17] Trong khoảng mười năm trở lại đây artemisinin (hoạt chất chiết từ cây Thanh Hao Hoa Vàng) và các dẫn chất của

nó được đưa vào điều trị cho kết quả rất tốt, đặc biệt là dẫn chất artesunat Đây

là một thuốc cắt cơn sốt nhanh, ít bị tái phát như artemisinin, có tác dụng cả với chủng p.falciparum đã kháng Cloroquin Thuốc qua được hàng rào máu não nên có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét thể não [5]

Tuy vậy phương pháp kiểm tra chất lượng artesunat đang áp dụng ở nước

ta còn rất nhiều hạn chế [12], [13], [14], [15], [16], Mặt khác artesunat lại đắt nên rất dễ bị làm giả Vì là thuốc điều trị sốt rét nên thuốc giả hay kém phẩm chất rất nguy hiểm cho bệnh nhân Theo một bài báo ở Đông Nam Á artesunat

bị làm giả rất nhiều Mỗi năm thế giói có khoảng 1 triệu người chết vì sốt rét trong đó có tới 200.000 người có thể cứu được nếu dùng đúng thuốc

DHA là một tạp chất chính trong artesunat Mặc dù DHA là một thuốc điều trị sốt rét mạnh gấp 2 lần artemisinin nhưng tác dụng yếu hơn artesunat

2, 3 lần, DHA lại rất ít tan trong nước nên DHA là một nguyên nhân quan

trọng làm giảm hiệu quả điều trị của artesunat [21] Vì vậy xác định và khống chế hàm lượng DHA trong artesunat là rất quan trọng.

Trong điều kiện khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, kỹ thuật phân

tích HPLC đang được triển khai áp dụng rộng rãi ờ Việt Nam Việc nghiên

cứu và thực hành phương pháp HPLC đối với một Dược sỹ là rất cần thiết.Nằm trong mảng đề tài xây dựng phương pháp kiểm nghiệm artesunat bằng phương pháp HPLC, trong khoá luận tốt nghiệp của mình tôi tham gia cải tiến điều kiện sắc ký đã xây dựng trong khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học của Nguyễn Thanh Tùng (2004) để rút ngắn thời gian phân tích và xây dựng phương pháp xác định giới hạn DHA trong artesunat nguyên liệu với những mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu và sử dụng được máy HPLC đ ể áp dụng phương pháp HPLC vào kiểm nghiệm trong thời gian làm khoá luận.

2 Học tập cách nghiên cứu, trình bày một vấn đề khoa học.

3 Xây dựng được phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu

và đánh giá phương pháp vừa xây dựng.

+ Nguồn gốc: Artemisinin phân lập từ cây Thanh Hao Hoa Vàng có tác

dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng cloroquin Tuy vậy, artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh nhân sạch ký sinh trùng trong máu

Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất của artemisinin có tác dụng tốt hơn là DHA, artemether, arteether, artesunat, artelinic

Trong đó artesunat có tác dụng tốt, tan trong dung dịch kiềm dùng để pha tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát và vì vậy được dùng phổ biến hcfn cả

+ Bán tổng hợp: Artesunat là sản phẩm bán tổng hợp của artemisinin

qua sản phẩm trung gian là DHA

Trưòỉng Đại học Dược Hà Nội bán tổng hợp artesunat qua 2 giai đoạn như sau [9]:

Giai đoạn 1; Artemisinin khử hoá nhóm lacton thành DHA bởi NaBH4/ MeOH ở 0°c - 5°c, phương trình:

Giai đoạn 2: DHA được ester hoá thành artesunat khi tác dụng với anhydrit succinic hoặc acid succinic xúc tác là Dimethylamino Pyridin (DMPA) hay hỗn hợp DMPA và Dicyclohexyl Carbodiimid

Phương trình:

o

ọ / DMAP H31

COOH / ỘH2 / dmap

1.1.4 Tác dụng

Diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do p.falciprum, không diệt thể giao bào và không tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh

1.1.5 Dược động học

Sinh khả dụng đường uống: 24-64%, tj/2= 41phút bị giảm hoạt tính do chuyển hoá qua gan; qua được hàng rào máu não và nhau thai; thải qua nước tiểu: dạng deoxy [2]

1.1.6 Tác dụng không mong muốn: Nhẹ và thoảng qua: Rối loạn tiêu hoá,

đau đầu, hoa mắt, chóng mặt

1.1.7 Chế phẩm: Có ba dạng: viên nén 50 mg artesunat, bột pha tiêm 60 mg

artesunat, thuốc đạn 50 mg artesunat [8]

1.1.8 Chỉ định: Điều trị sốt rét do p falciparum, p malaria, p vivax, kể cả

p.falciparum đã kháng thuốc khác[2]

LIỆU

2.1 Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu

Bản thân DHA là thuốc điều trị sốt rét mạnh hơn cả artemisinin Tuy nhiên, trong artesunat thì DHA lại được coi như là tạp chất, mặt khác DHA rất

ít tan, sinh khả dụng thấp, tác dụng kém hơn artesunat Vì vậy nếu artesunat lẫn nhiều DHA thì hiệu lực điều trị của thuốc sẽ giảm, đồng thời DHA còn là chỉ thị cho mức độ tinh chế artesunat và cũng là yếu tố đánh giá bảo quản thuốc [19], [21]

Nguyên nhân chính gây tạp DHA trong nguyên liệu artersunat:

- Tinh chế chưa tốt

- Sản phẩm phân huỷ của artesunat trong bảo quản

1.2.2 Tổng quan về một số phương pháp xác định giói hạn tạp chất liên quan trong thuốc, ưu nhược điểm Các phương pháp xác định tạp DHA

a Một số phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc và ưu nhược điểm

♦ Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối vói tạp vô cơ)

Lấy 2 ống nghiệm giống nhau để thực hiện phản ứng

Ống 1 lấy chính xác 1 thể tích dung dịch thuốc đem thử

Ống 2 lấy chính xác 1 thể tích dung dịch chuẩn, dung dịch này chứa hàm lượng chất chuẩn tạp bằng giới hạn cho phép của tạp đó trong chế phẩm.Sau

đó cho vào mỗi ống, thuốc thử như nhau, số lượng như nhau rồi so sánh kết quả phản ứng ở 2 ống; từ đó xác định giói hạn tạp có trong mẫu thuốc đem thử Kết quả thường so sánh về mầu sắc, độ đục [3]

Phương pháp này đơn giản, song chỉ cho kết quả bán định lượng

♦ Đo quang

Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp rồi đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu so với độ hấp thụ của dung dịch có chứa tạp đó ở mức tiêu chuẩn trong cùng điều kiện

Phưoĩìg pháp chỉ xác định mức giới hạn, việc áp dụng hạn chế do phải có phản ứng đặc hiệu [1], [25]

♦ Sác ký lóp mỏng

Pha dung dịch thử của chế phẩm Pha dung dịch so sánh, dung dịch này chứa chuẩn tạp có nồng độ bằng mức giới hạn quy định tính theo dung dịch thử Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng một lượng thể tích bằng nhau của hai dung dịch Triển khai sắc ký, lấy ra sấy khô, hiện mầu và so sánh vết tạp của dung dịch chuẩn tạp và vết tạp tương ứng của dung dịch thử Yêu cầu vết tạp của dung dịch thử có diện tích và đậm độ không được lófn hơn vết tạp của dung dịch chuẩn tạp

Nếu không có chuẩn tạp thì người ta dùng chính dung dịch thử để pha dung dịch so sánh; dung dịch này có nồng độ bằng mức giới hạn quy định của tạp và cũng tiến hành tương tự như trên, rồi so sánh vết tạp của dung dịch thử

và vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch so sánh [1], [25], [28].

Nhận xét: Khi không có chuẩn tạp, người ta đã xem đáp ứng của tạp và chất thử là như nhau

♦ Sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [25], [28]

- Chuẩn hoá diện tích pic:

Pha dung dịch thử và tiến hành sắc ký, ghi diện tích của tất cả các pic trừ pic dung môi và những pic có đáp ứng rất nhỏ (thường là những pic có đáp ứng nhỏ hơn 0.1 % so với tổng diện tích các pic) Phần trăm diện tích của mỗi pic được tính là phần trăm khối lượng mỗi chất có trong mẫu thử

Phương pháp này cho kết quả khá chính xác nhưng đã xem đáp ứng của các pic là như nhau khi nồng độ bằng nhau và tất cả các chất có trong mẫu thử đều cho đáp ứng trên sắc ký đồ Để xác định đúng hàm lượng phần trăm mỗi chất (tạp chất) trong mẫu thử, cần xác định sự liên quan giữa tỉ lệ phần trăm diện tích pic với phần trăm hàm lượng giữa các chất, thường xem hoạt chất có

tỉ lệ này bằng: 1 Vì vậy cần xác định hệ số biến đổi phần trăm diện tích pic ra phần trăm hàm lượng (hệ số F) Khi đó phần trăm tạp được tính như sau:

% Tạp = - |í ^ l O O %

Ẻ Si-ß

i= ỉ

- So sánh với chuẩn tạp (khi chỉ cần xác định giới hạn cho phép của tạp).

Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượng bằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic Diện tích pic tạp của dung dịch thử tương ứng pic chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp

- So sánh vói chuẩn của thử

Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được pha từ dung dịch thử, có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép của tạp Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được lớn hơn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn.

Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xẩy ra,

b Các phưoTig pháp xác định tạp DHA trong artesunat nguyên liệu

♦ Phưotig pháp Dược Điển Việt Nam và Dược Điển Trung Quốc

Xác định bằng sắc ký lớp mỏng:

- Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel GF254

- Dung môi: Ethylacetat: Toluen(l:l)

- Dung dịch thử: 10 mg chế phẩm trong Iml cloroform

- Dung dịch đối chiếul: 0,1 mg DHA/lml cloroform

- Dung dịch đối chiếu 2: 0,05 mg DHA/lml cloroform

Chấm riêng biệt các dung dịch lên một bản mỏng, mỗi dung dịch 10|al.Triển khai sắc ký, hiện mầu bằng Vanilin 2%/H2S04, sấy ở 100°c trong

thời gian 10 phút Bất kỳ vết nào ngoài vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng với vết DHA không được đậm hơn vết DHA của dung dịch đối chiếu 1 (< 1%) Ngoài vết chính và vết phụ tương ứng vói DHA không được quá 1 vết đậm hơn vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu 2 (< 0,5%) [1], [24]

Nhận xét: Phương pháp tiến hành khá phức tạp, kết quả còn phụ thuộc chủ quan và chưa cho kết quả xác định chính xác hàm lượng tạp

♦ Phưong pháp của Dược Điển Quốc Tế (volume 5)

Phưoỉng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:

o Cột: (12,5x3mm; 5Ịim)

o Pha động; Acetonitril R: Đệm pH3 (50:50)

o Tốc độ dòng: 0,6ml/phút

o Nhiệt độ: 30°c

o Thể tích tiêm: 20|il

o Dung dịch A: 4mg/ml artesunat nguyên liệu,

o Dung dịch C; 0,04mg/ml artesunat nguyên liệu,

o Tiêm 20 |il dung dịch A, ghi kết quả

o Tiêm 20 |Lil dung dịch c , ghi kết quả

Diện tích của bất kỳ pic nào trên sắc ký đồ của dung dịch A trừ pic chính không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của c (< 1%)

Không được có hơn một pic có diện tích lớn hơn 1/2 diện tích pic chính của c (< 0,5%)

Tổng diện tích các pic tạp (bỏ qua pic có diện tích nhỏ hofn hoặc bằng0,1% diện tích pic chính của C) không lớn hơn 2 lần diện tích của pic chínhcủa c (< 2 %) [29],

Nhận xét: Phương pháp đã thừa nhận đáp ứng pic của các tạp chất và artesunat là như nhau khi hàm lượng bằng nhau

1.3 TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.3.1 Khái niệm về sắc ký và sác ký lỏng hiệu năng cao

a Khái niệm về sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách và phân tích các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào sự

sử dụng các quá trình sắc ký khác nhau trong các điều kiện động Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào sự phân chia khác nhau vào hai pha, là pha động và pha tĩnh Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên nền chất rắn Pha rắn được nhồi trong cột hay tráng trên bản mỏng hay dàn thành film Pha động là khí hay chất lỏng Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [4]

b Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp HPLC

là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp sắc ký lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ

hay tương tác hoá học ở bề mặt [4].

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì

ta có sắc ký phân bố Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký Ví dụ: Nếu ta nạp một mẫu gồm 3 chất là A, B, c vào cột tách thì khi bơm pha động qua cột tách các quá trình sắc ký xẩy ra, khi đó A, B, c tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác:

- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (Fl)

- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2)

- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3)

Theo sơ đồ sau:

Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định [10]

1.3.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống sắc ký

a Hệ thống bơm

Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký Bơm đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ hằng định

* Có hai loại bơm: + Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng

+ Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường

b Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh đôi khi bằng thép không gỉ Cần lọc loại các hạt trong dung môi (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 |Lim) và đuổi khí hoà tan trong dung môi Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi Trong phương pháp gradien cần tới 2, 3, 4 bình chứa các dung môi

c.Hệ tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động

d Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký Vì ở cột xẩy ra quá trình tách các chất Cột đóng vai trò rất quan trọng tới khả năng

tách các chất Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được

áp suất cao đến vài trăm bar Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký Cột tách

có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký Một cách đại cương có thể chia ra 3 loại cột:

- Cột phân tích: dài 10-25 cm, đường kính 2-5mm

- Cột bán điều chế: dài 5 0 -1 0 0 cm, đường kính 5 - lOcm

- Cột điều chế: dài 1 0 0 -1 5 0 cm, đường kính 10 - 50cm

e Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động từ cột sắc ký đi ra liên tục

Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các chất hay hợp chất của chúng dựa theo một tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích Thường có các loại Detector sau:

- Detector UV- VIS

- Detector huỳnh quang

f Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder.

g Hệ điều khiển: Computer

1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưỏtig [1], [25], [28]

a Thòi gian lưu I r và thể tích lưu V r

- ĩr là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tói detector và cho pic trên sắc đồ

- Vr là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ: Vr = ÍrxFc (Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian).

- tjỊ và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai đại lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động tốc độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ

b Hệ số phân bố K

K = k.c^c„

c , và là nồng độ chất tan ò pha tĩnh và pha động tưoĩig ứng, k là hệ số

phân bố ỏ trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột K chỉ phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

Nếu K ’ < 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp

Nếu K ’ > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài

d Tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất

Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (select!vity-factor)

Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0 Nếu a càng lớn 2 chất

tách nhau càng tốt, a nhỏ 2 chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài Giá trị a phụ thuộc yếu tố quyết định t ’jỊA và I’rb

e Độ phân giải (Resolution)

Là đại lượng đo mức độ tách 2 chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

Tăng N: Tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng, cách này ít hiệu quả

Tăng K ’b: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn

Tăng a: Thay đổi pha động hay pha tĩnh sẽ làm R, thay đổi lớn

f Hệ sỏ bất đối AF

w

2 d

Wqos là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao pic

d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic[25]

Yêu cầu AF = 0,9 - 2,

Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả tính diện tích pic càng chính xác

- Yếu tố ảnh hưởng:

N = 1 6 ^ [27] hay N = 5 5 4 -^ [25] Số đĩa lý thuyết cho biết hiêu

lực cột Khi phân tích yêu cầu N > 3000 Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào ír và w (độ rộng pic)

tjỊ càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài

w (độ rộng pic ở đáy) hay Wj/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng bé

thì N càng lớn nhưng w và Wjỵ2 sẽ bé hơn nếu tjỊ bé

Khi ír cố định thì bản chất cột, pha động, pH là yếu tố quyết định trong

• sắc ký hấp phụ pha thuận (normal phase - HPLC).

• Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reverse phase- HPLC)

Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ

bề mặt của pha tĩnh Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ

Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực.Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân cực, chất phân tích có thể phân cực hay ít phân cực

Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC

• Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký

• Silica đã Alkyl hoá, được điều chế bằng cách Alkyl hoá các nhón OH trên bề mặt Silica bằng các gốc Alkyl - R của mạch Cacbon (C2, C8, C18) hay các gốc Cacbon vòng Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hoá được sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion

• Silica Sulfon hoá hay Nitro hoá để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi cation Silica amin hoá dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion

b Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tjỊ và hiệu quả tách

Pha động có thể ảnh hưởng tới:

Yêu cầu của một pha động:

• Phải trơ đối với pha tĩnh

• Phải hoà tan được chất mẫu

• Phải bền vững theo thời gian

• Phải có độ tinh khiết cao

•Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

• Phù hợp với loại detector

• Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n_hexan, n_heptan, benzen, cloroform, Các pha động này thường được bão hoà nước

Trong sắc ký pha đảo thì pha động là hệ dung môi phân cực như: Nước, Methanol, Acetonitril, hay hỗn hợp của chúng Các dung môi đó có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

Trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký pH thường phải

ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hay base, Nếu pH thích hợp sẽ góp phần làm cho kết quả tách tốt hofn Thông thường với chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid nhưng cũng có trường hợp đặc biệt, còn sắc ký tạo cặp ion thì pH tuỳ từng trường hợp

d Tốc độ pha động

Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn

để quá trình tách tốt hơn là tốc độ pha động

1.3.7 ứng dụng của HPLC [4], [7], [28]

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính

a Định tính: Thời gian lưii của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ Tuy nhiên việc định tính đơn thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn

b Sác ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất

c Định lưọtig và xác định giói hạn tạp chất; sắc ký lỏng hiệu năng cao có

ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất

Khi sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là;

• Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so sánh với diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn Kết quả có thể được tính theo cách chuẩn hoá một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính

• Phương pháp chuẩn nội

Là phưcttig pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội.

• Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường chuẩn

• Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu

tử được tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần

□Yêu cầu:

Tất cả các thành phần đều được rửa giải và phát hiện

Tất cả các thành phần có đáp ứng như nhau với detector

Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:

phần khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau: Fx =

S^.C,

S( và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng