Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong viên đặt aphaneten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ

ĩỉí; ỉ< : ỉíĩíí^ ĩỉí; ỉí: íí> f í: íí: íí; ỉí: í: ; íc ; ỉí; f í: íí> ! í^ * ; ỉí/^

NGÔ THANH THƯỶ

NGHIÊN CỨU DỊNH LƯỢNG DỒNG THỜI CLOTRIMAZOL VÀ

METRONIDAZOL TRONG VIÊN ĐẶT APHANETEN BẰNG PHƯ0NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(KHOÁ L U Ậ N TỐ T NG H IỆP Dược sĩ KHOÁ 2001 - 2005)

Người hướng dẫn: PGS.TS THÁI PHAN QUỲNH NHƯ

TS THÁI DUY THÌN

Thời gian thực hiện: 8/2004 ĐÊN 5/2005

Ị

■ V'.' 1^ ' "■ >

y f l wNó''Oc^

LỜI CÁM ƠN

Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý I - Viện Kiểm nghiệm Bộ Y tế và Bộ môn Hoá dược - Trường đại học Dược - Hà Nội Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các thầy, cô hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn Hoá dược

và các cán bộ của phòng Hoá lý I Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế.

Tôi xin chân thành cám ơn sự hưófng dẫn chỉ bảo tận tình của;

- Tiến sĩ: Thái Duy Thìn - Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược - Trường đại học Dược - Hà Nội

- Phó giáo sư - Tiến sĩ; Thái Phan Quỳnh Như - Trưởng phòng Hoá lý I - Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế

Đã giúp đỡ tôi những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực hành khóa luận.

Tôi xin cám ơn sự giũp đỡ của các thầy, các cô, các kỹ thuật viên trong

bộ môn Hoá dược và các cán bộ phòng Hoá lý I Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế

Đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp của mình.

Tôi xin cám 0fn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo nhà trưòng

và các thầy giáo, cô giáo đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.

Tôi xin tỏ lòng biết ơn với gia đình, bạn bè và những người luôn sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.

Sinh viên

Ngô Thanh Thuỷ

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN 1- TỔNG QUAN 3

1.1- Clotrimazol 3

1.1.1- Đại cương 3

1.1.2- Các phương pháp định lượng 3

1.1.3- Tác dụng dược lý 4

1.2- Metronidazol 5

1.2.1- Đại cương 5

1.2.2- Các phương pháp định lượng 5

1.2.3- Tác dụng dược lý 6

1.3- Các phưoìig pháp định lượng clotrimazol, metronidazol trong chê phẩm hỗn hợp 7

1.3-1- Định lượng Clotrimazol 7

1.3-2- Định lượng M etronidazol 7

1.3-3- Nhận x é t 8

1.4- Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao 8

1.4.1- Khái n iệ m 8

1.4.2- Các đại lượng đặc trưng 9

1.4.3-Hệ thống H PLC 12

1.4.4- Pha tính trong H PL C 13

1.4.5- Pha động trong H PLC

1.4.6- Cách đánh giá p ic 17

1.4.7- Cách tính kết q u ả 1 ^

PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1- Đối tượng nghiên cứu 19

2.2- Thiết bị và hoá c h ấ t 19

2.2.1- Hoá c h ấ t 19

2.2.2- Thiết bị, dụng c ụ 19

2.3- Nội dung, phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1- Nội dung 2 0 2.3.2- Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.3- Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tíc h 20

2.3.4- Cách đánh giá kết q u ả 21

PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22

3.1- Xây dựng điều kiện sác ký để định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol 2 2 3.1.1- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý 26

3.1.2- Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 27

3.1.3- Khảo sát độ chính xác của phưofng p h áp 30

3.1.4- Khảo sát độ đúng của phương p h áp 34

3.1.5- Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 37

3.2- ứng dụng định lượng chê phẩm "Aphaneten" do xí nghiệp dưực phẩm

120 sản xuất đã và đang lưu h ành 393.3- Bàn luận về kết q u ả 41KẾT LUẬN 43 TÀI LIÊU THAM KHẢO

ĐẬT VẤN ĐỀ

Trong xu hướng sản xuất thuốc đa thành phần nhằm phối hợp tác dụng dược lý của các dược chất người ta đã sản xuất thuốc viên nén đặt trong phụ khoa gồm clotrimazol phối hợp với metronidazol Trong đó:

Clotrimazol là một loại thuốe chống nấm phổ rộng, do ức chế các enzym chuyển hoá màng tế bào nấm [1]

Metronidazol là một loại thuốc có tác dụng rất mạnh trong điều trị nhiễm động vật nguyên sinh như:

Trichomonas vaginalis, Trichomonas buccalis, Trichomonas intestinalis Trichomonas là loại động vật đơn bào, thuộc lớp trùng roi sống ở âm đạo gây viêm âm đạo, âm hộ Thuốc có tác dụng chọn lọc trên thể đã gây bệnh, còn ít có tác dụng trên thể chưa gây bệnh, do đó cần phải phối hợp với các thuốc kháng khuẩn khác, để đạt được hiệu quả tối ưu trong điều trị [1]

Do đó viên thuốc hỗn hợp clotrimazol và metronidazol vừa có tác dụng kháng khuẩn, vừa có tác dụng chống nấm nên thuốc được sử dụng rộng rãi cho các trường hợp viêm nhiễm tạp khuẩn và nấm trong phụ khoa

Xí nghiệp Dược phẩm 120 có sản xuất viên nén đặt phụ khoa ở dạng phối hợp với tên “Aphaneten”

Khi sản phẩm này ra đời thì vấn đề đặt ra ở đây là phải kiểm tra chất lượng thành phẩm trước khi thuốc đến tay người dùng Mặt khác trong các Dược điển hiện hành [5], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21] chỉ có chuyên luận viên đơn thành phần chứa clotrimazol hoặc metronidazol, vì vậy để kiểm tra chất lượng sản phẩm cần nghiên cứu phương pháp định tính và định lượng hai hợp chất này trong cùng một dạng bào chế

Ngày nay khoa học kỹ thuật đã phát triển vượt bậc, đã có nhiều thành tựu được đưa vào ứng dụng và đã mang lại cho chúng ta những phương pháp kiểm

nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao Một trong những phương pháp đó là sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng có kết quả, các hợp chất trong nhiều loại thuốc đa thành phần [8], [13], [14],

Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu định lượng đồng thời các hoạt chất trong viên thuốc đặt phụ khoa “Aphaneten” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với mục tiêu cụ thể sau:

- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành Dược một phương pháp kiểm nghiệm ngoài Dược điển nhằm mục đích rút ngắn thời gian tiến hành định lượng, tăng độ chọn lọc và nâng cao hiệu quả phân tích

- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn để tiêu chuẩn hoá thuốc mới trước khi đưa ra thị trường

- Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để kiểm nghiệm nhanh và chính xác một số thuốc có thành phần tưcmg tự như trên đang lưu hành trên thị trường

PHẦN 1 - TỔNG QUAN1.1- CLOTRIMAZOL

* khác: Lotrimin; Gyne-lotrimin; Myclo; Canesten; Mycelex.

* Tên khoa học: l-[(2-chlorophenyl) diphenylmethyl] - IH- imidazol

*Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan:

- Hoà tan clotrimazol trong acid acetic khan Chuẩn độ bằng acid pecloric

0,1N, xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế Song song tiến hành làm mẫu trắng [15], [20] Hoặc dùng chỉ thị tím tinh thể rồi chuẩn độ bằng acid pecloric 0,1M đến khi xất hiện mầu xanh [19] Hoặc dùng

chỉ thị naphtolbenzein rồi chuẩn độ cho đến khi mầu chuyển từ nâu vàng sang xanh[17], [21].

* Phương pháp HPLC: [16]

- Pha động là hỗn hợp:

Methanol - Dung dịch K2HPO4 (3:1)

(Dung dịch K2HPO4: Hoà tan 4,35g K2HPO4 trong lOOOml nước cất)

* Tên khác: Flagyl; Klion; Protostat; Metro IV; Novomidazol trikacide.

* Tên khoa học: 1 - (P - hydroxyetyl) - 2 - metyl - 5 - nitroimidazol

* Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan:

- Hoà tan metronidazol trong acid acetic khan, chuẩn độ bằng dung dịch acid pecloric 0,1N Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế [1]; [5]; [18]; [21] Hoặc dùng chỉ thị naphtobenzein, rồi chuẩn độ đến khi màu chuyển từ vàng da cam đến xanh[15]; [19]; [20] Hoặc dùng chỉ thị malachit xanh, rồi chuẩn độ đến khi xuất hiện màu vàng xanh Song song tiến hành làm mẫu trắng [15]; [19]; [20]

* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:

- Hoà tan một lượng metronidazol trong acid hydrocloric 0,1M để được

dung dịch có nồng độ 0,002% metronidazol Đo độ hấp thụ tử ngoại của dung

dịch trên ở bước sóng 230nm -ỉ- 350nm Qiỉ có một cực đại hấp thụ ở 277nm

với độ hấp thụ riêng 365 4- 395 và một cực tiểu ở 240 nm [1]

- Định lượng thuốc tiêm metronidazol: [19]

Pha chế phẩm với dung dịch acid hydrocloric loãng để được dung dịch có nồng độ 12,5|Lig/ml Đo độ hấp thụ của dung dịch đó ở bước sóng 277nm, dùng dung dịch acid hydrocloriç loãng làm mẫu trắng Lấy 377 là giá trị A(l%, Icm) ở bước sóng 277nm

- Định lượng thuốc viên nén metronidazol: [5]

Lấy 20 viên và xác định khối lượng trung bình của viên, nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 50mg metronidazol cho vào bình định mức lOOml thêm khoảng 80ml dung dịch acid hydrocloric 0,1N lắc kỹ cho phân tán đều, thêm acid hydrocloric 0,1N vừa đủ đến vạch Lắc đều, lọc, loại bỏ 20ml dịch lọc đầu Kút chính xác 2,0ml dịch lọc cho vào bình định mức lOOml Thêm dung dịch acid hydrocloric 0,1N vừa

đủ đến vạch, lắc đều Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở 277nm, dùng dung dịch acid hydrocloric 0,1N làm mẫu trắng Lấy 377 là giá trị A (1%, Icm) ở bước sóng 277nm

1.2.3- Tác dụng dược lý: [2]; [6]

* rá c dụng:

Metronidazol có tác dụng tốt với cả amip trong và ngoài ruột, cả thể cấp

và thể mạn Với lỵ amip mạn ở ruột, thuốc có tác dụng yếu hơn do ít xâm nhập vào đại tràng

Ngoài ra thuốc còn có tác dụng tốt đối với trichomonas vaginalis, giardia, các vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn gram (-), kể cả barteroid, clostridium, helicobacter, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn ưa khí

* Cơ chê tác dụng:

Nhóm nitro của metronidazol bị khử bởi protein vận chuyển electron hoặc bởi ferredoxiri Metronidazol dạng khử làm mất cấu trúc xoắn của ADN, tiêu diệt vi khuẩn và sinh vật đơn bào

1.3- CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLOTRIMAZOL, METRONIZOL TRONG CHẾ PHẨM HỖN h ợ p

* Định lượng thuốc đạn clotrimazol, metronidazol và chlohexidine acetat:

1.3.1 - Định lượng clotrimazol: [19]

Cân 10 viên thuốc đạn, hơ nóng cho chảy rồi trộn đều và để nguội Cân chính xác một lượng thuốc đạn (đã chảy lỏng và để nguội ở trên) tương đương với khoảng 400mg clotrimazol Thêm 20ml cloroform ấm hoà tan lượng thuốc đạn trên trong một phễu chiết và lắc đều cho tan hoàn toàn sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng Chiết metronidazol và chlohexidine acetat từ dung dịch trên 3 lần (40, 20, 20ml) bằng dung dịch acid acetic (1,5M), lọc dịch chiết vào một bình định mức lOOml, rửa giấy lọc bằng dung dịch acid acetic (1,5M), gộp dịch rửa và dịch chiết rồi thêm acid acetic (1,5M) đến vạch và trộn đều

Lọc phần cloroform, rửa phễu chiết và giấy lọc bằng cloroform, gộp dịch rửa và dịch chiết clorform và dồn vào bình định lượng Thêm lOml dung dịch acid acetic, 2ml dung dịch anhydric acetic, 2 giọt tím tinh thể và định lượng bằng acid pecloric (0,1M) cho đến khi chuyển sang màu xanh sẫm Song song tiến hành làm mẫu trắng

1.3.2 - Định lượng metronidazol:

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng lOOmg metronidazol

chuẩn rồi hoà tan bằng methanol trong bình định mức lOOml Thêm methanol đến vạch và trộn đều Lấy chính xác l,Oml dung dịch sang bình định mức lOOml khác Thêm l,Oml dung dịch acid acetic (1,5M) sau đó thêm ethanol đến vạch và trộn đều

- Chuẩn bị dung dịch mẫu: Lấy chính xác 10,0ml dung dịch nước thu

được ở phần định lượng clotrimazol vào một bình định mức 50ml Thêm dung dịch acid acelic (1,5M) cho đến vạch và trộn đều Lấy chính xác l,Oml dung dịch thu được và chuyển vào bình định mức lOOml khác Thêm ethanol đến vạch và trộn đều

- Chuẩn độ: Đo độ hấp thụ tử ngoại của hai dung dịch mẫu và dung dịch

chuẩn ở bước sóng 312nm, dùng hỗn hợp dung dịch acid acetic (1,5M) - ethanol (1/100) làm mẫu trắng Tính nồng độ của metronidazol dựa vào độ hấp thụ tử ngoại

1.3.3- Nhận xét:

Quy trình định lượng clotrimazol và metronidazol trong chế phẩm hỗn hợp (đã trình bày ở phần 1.3.1 và phần 1.3.2), phải qua quá trình chiết tách rất phức tạp nên rất dễ mắc phải sai số Do đó việc nghiên cứu một phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc hỗn hợp được thuận tiện hơn, không phải chiết tách qua nhiều công đoạn phức tạp, tránh được sai số là việc hết sức quan trọng và cần thiết

1.4- PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC): [3]; [4]; [7]; [10]; [11]; [12]

1.4.1- Khái niệm:

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải), pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao và các chất phân tích di chuyển theo pha động qua cột dưới tốc độ khác nhau tuỳ theo ái lực của chúng với 2 pha dẫn đến sự tách ra của các chất Sự lách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp thụ hoặc trao đổi ion của các chất tiêm khác nhau về cấu trúc hoá học và tính chất Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột, được nhận biết bởi bộ

phận phát hiện gọi là detector Tuỳ theo bản chất của các chất phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector u v Sau một qúa trình sắc ký ta thu được một sắc ký đồ, sắc ký đồ phản ánh quá trình

tách sắc ký ở trong cột tốt hay không Trong quá trình sắc ký chất nào được

lưu giữ mạnh nhất trong pha tĩnh sẽ được pha động rửa giải ra khỏi cột sau cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh cũng như tính chất hoá lý của chất tan

1.4.2- Các đại lượng đặc trưng:

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ

signal

Hình 1.1: Các đại lượng đặc trưng trên sắc ký đồ

trong phép định lượng bằng HPLC.

*t* Thời 2Ìan lưu t¡i (phút) (Retention time):

Là thời gian từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic (thời gian lưu đặc trưng cho một chất) So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện sẽ định tính được chất đó

+ Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động

Hê số dune lươnư K ' (Capacity factor):

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong

pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

^0 ^0Nếu K' nhỏ thì Ir cũng nhỏ và sự tách kém, K' lớn thì pic bị doãng, độnhậy kém Trong thực tế K' từ 1 đến 5 là thích hợp

♦> Đô chon loe a (Selectivity):

Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A,

B có K \ và K' b khác nhau thì mới có khả năng tách, mírc độ tách biểu thị ớ dộ chọn lọc a ;

Trong đó Cg, C|^ lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.

♦> Sô đĩa lý thuết (N) và chiều cao của đĩa (H):

Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: Số đĩa lý thuyêì và chiều cao đĩa lý thuyết Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ơ mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H Ta có thể tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:

(5)

Trong đó: Chiều rộng pic ở đáy pic

W|^2- Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh

2

w

_ B _ w

Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý ihuyêt được tính bằng công thức:

L

H =

❖ Đô phân siải (Rs):

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho:

t„ o - t

Rs =

- R B - R A _ Khoảng cách giữa hai pic

1/ r +\Y 1 Đô rông trung bình của hai pic

/ 0 1 B A J

❖ Hê sô đôi xứns (T):

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức;

T =

Trong đó : Wx: Độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

A: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp nliậii được.

1.4.3- Hệ thống HPLC:

Theo thứ tự từ đầu đến cuối hệ thống, có các bộ phận chính như sau: + Bình chứa dung môi

+ Bơm cao áp, đẩy pha động qua cột sắc ký

+ Van bơm mẫu, boìn vào cột một thế tích mẫu nhất định

+ Cột tách

+ Detector

+ Máy ghi sắc ký hoặc máy vi tính

1.4.4- Pha tĩnh trong HPLC:

Cũng như sắc ký cột ở áp xuất thường, pha tĩnh (Stationenary phasc) trong HPLC chính' là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chát phân tích Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rấl nhỏ đường kính cỡ hạt từ 3 lOịim, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 -4- 500mVg-

* Phán loại pha tình :

- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong

kỹ thuật tách HPLC

- Căn cứ vào trạng thái là rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm hai loại; Nếu pha tĩnh là chất rắn, người ta có sắc ký lỏng rắn LSC (Liquid solid chromatography), nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ngưòi ta có sắc ký lỏng lỏng LLC (Liquid liquid chromatography).

- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại; sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.

- Xét về cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có hai kiểu xốp: Xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).

* Điều kiện đối với một pha tĩnh :

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong diều kiện sắc ký nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

* Chế tạo pha ãnh. Pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:

- Pha tĩnh trên nền silicagel

- Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm

- Pha tĩnh trên nền mạch carbon

Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền silicagel là ưu việt hơn và được

sử dụng nhiều nhất

* Pha tĩnh trên nền silicagel:

- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký pha thuận Loại này trên bề mặt

của nó có chứa các nhóm -OH Đó là các nhóm hoạt động có tính chất phân

cực và ái nước Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực

và ít phân cực Pha động của loại này là những chất không phân cực hoặc ít

phân cực Với loại pha tĩnh này, nước có ảnh hưởng nhiều đến bề mặt hoạt

động của chúng (tức là các nhóm -OH ái nước) Chính yếu tố này làm ảnh

hưởng đến độ lặp lại của quá trình tách sắc ký

- Silicagel đã alkyl hoá: Được sử dụng cho sắc ký pha đảo Nhóm -OH

của silicagel trung tính được alkyl hoá bằng các gốc alkyl của mạch carbon

thẳng hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl.ơiính vì bị thế mất nhóm

-OH nên bề mặt của chất nhồi loại này không phân cực hay ít phân cực Loại

chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất

phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion Pha động cho loại này là chất hữu cơ

phân cực như methanol, acetonitril hay nước hoặc là hỗn hợp của các chất

này với nhau theo những tỷ lệ nhất định Pha tĩnh loại này kỵ nước, nghĩa là

bề mặt hoạt động của nó không bị ảnh hưởng của các phân tử nước, mà trái lại

nước là một thành phần của dung môi rửa giải có ý nghĩa thực tế lớn Sự tách

các chất nhồi loại này có độ lặp lại tốt hofn Do đó loại này được ứng dụng

nhiều hơn loại silicagel trung tính

- Silicagel đã được sunfonic hoá hay nitro hoá: Được sử dụng cho sắc ký

trao đổi ion (cation) Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitro hoá các

silicagel trung tính để thay các nhóm -OH trên bề mặt silicagel trung tính

bằng các nhóm -SO3H hay -NOjH Các nhóm chức này có ion có thể trao

đổi được với các cation kim loại khác Đây là các pha tĩnh trao đổi các cation

mạnh, còn nếu thay thế nhóm -OH bằng nhóm -R-COOH thì ta có loại pha tĩnh trao đổi cation acid yếu Pha tĩnh loại này được dùng để tách các chất có cấu tạo ion như ion các kim loại và hợp chất của chúng, hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành ion như các acid, base Pha động sử dụng trong loại sắc ký này là các dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, dung dịch acid hay base, hoặc có thể có các chất hữu cơ tan trong nước.

- Các silicagel được amin hoá: Được sử dụng cho sắc ký trao đổi anion

Các silicagel này được chế tạo bằng cách thay thế nhóm -OH bằng các nhóm -NH2; -NH; -NR2; -NR3; -CH.JOH) Pha tĩnh loại này sử dụng để tách các anion trong hợp chất có cấu trúc ion hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành các ion như các base, acid Pha động của loại này cũng giống như trên

1.4.5- Pha động trong HPLC:

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất cần phân tích)

ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Đây là một yếu tố hết sức linh động và dễ dàng thay đổi Nó có thể là một dung môi hoặc có thể là một hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định Nó cũng có thể là dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất

Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký Pha động có thể ảnh hưởng đến:

- Độ rộng của pic sắc ký

• Trong HPLC pha động phải thoả mãn một sô điều kiện sau :

- Trơ đối với pha tĩnh

- Hoà tan được chất cần phân tích

- Bền vững theo thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân

tích

- Có tính kinh tế, dễ kiếm

• Trong sắc ký pha thuận :

Pha động phải là các dung môi hữu cơ không phân cực hoặc ít phân cực như n-hexan, n-heptan, cloroform, tetraclorcarbon Trong quá trình chạy sắc

ký, để cho quá trình tách được ổn định độ lặp lại cao, phải bão hoà pha động trước khi chạy sắc ký bằng nước

• Trong sắc ký pha đảo :

Pha động là hệ dung môi phân cực, là những dung môi đồng tan với nước,

có khi nước lại là thành phần chính trong pha động ví dụ như methanol, acetonitril Ta có thể tạo ra những pha động có độ phân cực khác nhau bằng cách thêm vào đó những tỷ lệ nước nhất định, do đó hệ pha này trở nên linh động và được ứng dụng nhiều Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, thành phần pha động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng trong sắc ký cặp ion

• Trong sắc ký trao đổi ỉon:

Pha động là dung dịch nước của các acid hay base, hoặc là dung dịch nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có chứa chất đệm pH, chất tạo cặp ion, chất tạo phức Trong loại sắc ký này thì pH pha động và chất tạo

phức có ý nghĩa rất lớn Trong sắc ký cặp ion, pha động vẫn sử dụng nước và methanol là dung môi chính thêm vào đó chất chứa ion tạo cặp, chất đệm pH, chất tạo phức.

* Có 4 yếu tố quan trọng cần chú ý trong lựa chọn pha động'.

- Bản chất của dung môi để pha chế pha động

cả pic có đường nền bị trôi Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với nồng độ trung bình, vừa và cao

* Đánh giá chiều cao pic:

Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền

và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể được dùng để đánh giá sắc phổ Một điều kiện để áp dụng cho việc đánh giá bằng chiều cao pic là các chỉ số K hằng định

Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng hơn và chính xác hơii việc xác định diện tích pic

I a /C ' ^ ' \

1.4.7- Cách tính kết quả:

* Phương pháp ngoại chuẩn :

Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử được phân tích trong cùng điều kiện Kếl quả của chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn

* Phương pháp nội chuẩn:

Là phươrig pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử Nó được tách hoàn toàn và có nồng

độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc hoá học tưoỉng ứng

* Phương pháp thêm:

Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ: Tá dược) Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký

1.4.8- Nhận xét:

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được ứng dụng rộng rãi trong việc định lượng các thuốc đơn thành phần cũng như đa thành phần Phương pháp này có độ chính xác và độ nhạy cao, tốn ít mẫu, có tính đặc hiệu, thực hiện tương đối nhanh và thuận tiện, đặc biệt là định lượng đồng thời được các thành phần trong hỗn hợp mà không qua quá trình chiết tách, có thể thực hiện được ở những cơ sở kiểm nghiệm đã được trang bị máy HPLC

Với những ưu điểm của phương pháp HPLC và những nhược điểm của các phương pháp khác trong việc định lượng thuốc đa thành phần như đã nêu ở mục 1.3 Chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời clotrimazol và metrimazol bằng phương pháp HPLC

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1- ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

Mẫu viên nén Aphaneten do xí nghiệp dược phẩm 120 sản xuất

* Các hoá chất và dung môi khác:

- Methanol loại dùng cho HPLC

- Dikali hydrophosphat loại tinh khiết phân tích

- Nước cất loại dùng cho HPLC

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45|Lim

- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,1 mg

- Máy quang phổ UV-VIS Perkin Enmer và Lambda EZ 210

- Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác: Bình định mức, pipet, ống đong

2.3- NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.3.1- Nội dung:

* Khảo sát các điều kiện sắc ký:

Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời clotrimazol và metronidazol trong thuốc hỗn hợp bao gồm;

-Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

2.3.2- Phương pháp nghiên cứu:

- Phương pháp thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách 2 chất được tốt nhất, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả

- Phương pháp cụ thể: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.3- Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tích:

- Giá tri Trung bình: x = ^ V x (10)

n t t

* Định lượng:

Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau

Tính hàm lượng của từng chất theo công thức:

s„.m.c t

Trong đó:

Sj và S^: Diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn

m^: Lượng chuẩn đã cân của từng chất (mg)

c :Hàm lượng chuẩn tưcmg ứng (%)

m^: Khối lượng trung bình viên (g)

rrit: Khối lượng bột viên đem thử (g)

Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn để tiến hành khảo sát:

+ Dung dịch thử:

Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 1/2 viên cho vào bình định mức 50ml thêm khoảng 30ml pha động, lắc siêu âm 10 phút, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 2,0ml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 50,0ml, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 Ịxm

+ Dung dịch chuẩn:

Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn clotrimazol và 50 mg chất chuẩn metronidazol cho vào bình định mức 25ml, thêm khoảng 18ml pha động, lắc siêu âm 10 phút, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều Hút chính xác 2,0ml dung dịch này pha loãng với pha động vừa đủ 50,0ml và lọc qua màng lọc 0,45 |Lim (dung dịch chuẩn có nồng độ clotrimazol khoảng 40|Lig/ml

là methanol, acetonitril, nước cất và một số dung dịch đệm Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát bằng thực nghiệm với nhiều hệ dung môi khác nhau, qua đó nhận thấy hệ dung môi:

Methanol - Dung dịch dikali hydrophosphat 0,025M (2:1)

Có khả năng tách tốt các thành phần trong hỗn hợp, thời gian lưu vừa phải đồng thời cho sắc ký đồ khá đẹp Vì vậy chúng tôi lựa chọn hệ dung môi này trong quá trình nghiên cứu định lượng các mẫu khảo sát

* Lựa chọn bước sóng phát hiện :

Dựa vào độ hấp thụ của clotrimazol và metronidazol, dựa vào nồng độ của hai chất có trong hỗn hợp, chúng tôi đã tiến hành thực nghiệm và chọn ra bước sóng để định lượng đồng thời hai chất đó trong hỗn hợp là 215nm Tại bước sóng này clotrimazol là chất có hàm lượng thấp nhưng có độ hấp thụ đáng kể, còn đối với metronidazol là chất có hàm lượng cao lại có độ hấp thụ gần cực tiểu Kết quả thu được từ phổ tử ngoại của hai chất cũng cho thấy lựa

chọn bước sóng ở 215nm là hợp lý.

Hình 3.1- Phổ hấp thụ tử ngoại của clotrimazol

Hình 3.2 - Phổ hấp thụ tử ngoại của metronidazol