Nghiên cứu các đặc tính vi khuẩn methylobacterium spp phân lập ở vùng đông nam bộ

Thông qua khảo sát các đặc tính của các chủng phân lập phát hiện những đặc tính mới được ghi nhận bao gồm: ảnh hưởng lên quá trình phát sinh cơ quan ở thực vật; Sinh tổng hợp chất điều h

KIỀU PHƯƠNG NAM

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH VI KHUẨN

METHYLOBACTERIUM SPP PHÂN LẬP Ở VÙNG

ĐÔNG NAM BỘ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS BÙI VĂN LỆ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010

1MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH x

TÓM TẮT 1

MỞ ĐẦU 2

1 Chương 1 - TỔNG QUAN 4

1.1 Chi vi khuẩn Methylobacterium 4

1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại chi Methylobacterium 4

1.1.2 Đặc điểm sinh thái 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá 7

1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh 11

1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium 12

1.1.6 Khoá phân loại chi Methylobacterium 13

1.1.7 Các đặc tính của vi khuẩn Methylobacterium spp 16

1.2 Các cơ chế tương tác của vi khuẩn Methylobacterium spp 26

1.2.1 Sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở vi sinh vật và Methylobacterium spp 29

1.2.2 Methylobacterium spp và sự kiểm soát bệnh hại ở thực vật 35

1.3 Địa lý và điều kiện tự nhiên vùng Đông Nam Bộ 47

2 Chương 2 - VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 48

2.1 Vật liệu 48

2.1.1 Nguồn phân lập 48

2.1.2 Chủng vi sinh vật 48

2.1.3 Hạt, giống thực vật 49

2.1.4 Môi trường 49

2.2 Phương pháp 51

2.2.1 Phân lập và định danh 51

2.2.2 Xác định đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng phân lập 56

2.2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự tăng trưởng và phát sinh cơ quan ở thực vật 59

2.2.4 Sự sinh tổng hợp gibberellin, auxin và cytokinin 61

2.2.5 Vai trò của M radiotolerans H2T trong việc hạn chế bệnh thối nhũn ở cây A thaliana 65

2.2.6 Đặc tính làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống 71

2.2.7 Tác dụng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của chủng Methylobacterium radiotolerans H2T 73

2.2.8 Xác định khả năng sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 76

3 Chương 3 - KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN 84

3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Methylobacterium spp 84

3.1.1 Phân lập 84

3.1.2 Định danh 84

3.1.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng phân lập 91

3.2 Nghiên cứu các đặc tính của các chủng phân lập được 96

3.2.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự tăng trưởng và phát sinh cơ quan ở thực vật 96

3.2.2 Sự sinh tổng hợp gibberellin, auxin và cytokinin 104

3.2.3 Vai trò của Methylobacterium radiotolerans H2T trong việc hạn chế bệnh thối nhũn ở cây Arabidopsis thaliana 111

3.3 Nghiên cứu định hướng các ứng dụng của các chủng Methylobacterium spp phân lập 121

3.3.1 Đặc tính làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống 121

3.3.2 Tác dụng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của chủng M radiotolerans H2T 126

3.3.3 Đặc điểm sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 131

3.4 Tóm tắt tổng kết các đặc điểm và khả năng ứng dụng của các chủng Methylobacterium spp phân lập ở Vùng Đông Nam Bộ 142

4 Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143

4.1 Kết luận 143

4.2 Đề nghị 144

CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN TỚI NỘI DUNG LUẬN ÁN 145

TÀI LIỆU THAM KHẢO 147

TIẾNG VIỆT 147

TIẾNG ANH 148

INTERNET 163

PHỤ LỤC 165

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng việt

cfu: đơn vị hình thành khuẩn lạc

CMS: môi trường MS bổ sung 2g/l cao thịt và casein

ĐC: đối chứng

LB: môi trường Luria – Bertani

STN: sinh trắc nghiệm

tRNA: RNA vận chuyển

MMS: môi trường Methanol Mineral Salts

MS: môi trường Murashige và Skoog, 1962

rDNA: gen mã hóa rRNA

Tiếng Anh

ABA : abscisic acid

ACC deaminase: 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase

AHL: N-acyl homoserine lactone

IAA: indole - 3- acetic acid

IBA: indole -3- butyric acid

ISR: induced systemic resistance

NAA: -Naphthaleneacetic acid

OD: optical density

PCR: Polymerase Chain Reaction

PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria

PPFM: Pink Pigmented Facultative Methylotroph

PR: pathogenic-related protein

PHB: poly-ß-Hydroxybutyrate (poly-beta-Hydroxybutyrate)

Q-PCR: quantitative PCR

QS: Quorum Sensing

RNA: ribonucleic acid

rRNA: RNA ribosome

RT-PCR: reverse-transcription PCR

SA: salicylic acid

SAR: systemic acquired resistance

UV: ultraviolet

Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các loài Methylobacterium spp đã được đặt tên Lựa chọn

dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI 13

Bảng 1.2 Tóm tắt các đặc điểm của các chi vi khuẩn dinh dưỡng methyl (methylotrophic bacteria) 14

Bảng 1.3 Đặc điểm sử dụng carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium 15

Bảng 1.4 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA 30

Bảng 1.5 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp gibberellin 31

Bảng 1.6 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cytokinin 31

Bảng 1.7 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp abscisic acid 32

Bảng 1.8 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ethylene 32

Bảng 1.9 Một số AHL và hoạt động phụ thuộc vào mật độ quần thể được điều hòa bởi AHL 38

Bảng 2.1 Các loại môi trường sử dụng 60

Bảng 2.2 Thành phần của các dung dịch cắm hoa 76

Bảng 2.3 Các thông số cần được khảo sát trong nuôi cấy lỏng lắc 80

Bảng 2.4 Các thông số cần được khảo sát ở điều kiện nuôi cấy lỏng có lắc trong thí nghiệm 2.2.8.5 82

Bảng 3.1 Thông tin về các chủng phân lập được 84

Bảng 3.2 Sự tương đồng của các chủng mục tiêu và các trình tự đã công bố dựa trên kết quả Blast trong NCBI 85

Bảng 3.3 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của M radiotolerans H2T, M oryzae 1021b, M zatmanii 6012 và M komagatae TN10 92

Bảng 3.4 Đặc điểm sử dụng nguồn carbon của bốn chủng khảo sát và bốn chủng chuẩn của loài 94

Bảng 3.5 Một số thử nghiệm sinh hoá khác 95

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn 1019 lên sự phát sinh chồi ở thuốc lá

và Saintpaulia ionathna nuôi cấy in vitro 98

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cúc và thuốc

lá 99

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây hoa cúc và

thuốc lá 100

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự

tăng trưởng chồi và tạo rễ ở cây in vitro, sau 14 ngày nuôi cấy 102

Bảng 3.10 Tỉ lệ sống của cây thuốc lá, cà chua và cây hoa cúc sau 10 ngày đưa

ra vườn ươm, và chiều cao trung bình của cây sau 21 ngày 103

Bảng 3.12 Kết quả sinh trắc nghiệm 108 Bảng 3.13 Tốc độ nảy mầm của hạt lúa 109 Bảng 3.14 Sự thay đổi hoạt tính amylase Đơn vị là UI, trong đó 1 đơn vị là

lượng enzyme cần để giải phóng 1µM maltose từ tinh bột trong 1 phút, ở pH 6,9

Bảng 3.22 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của hoa cắt

cành cắm trong dung dịch sinh khối vi khuẩn 127

và sinh khối vi khuẩn lên các chỉ tiêu theo dõi ở hoa cẩm chướng 128

Bảng 3.24 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của hoa cắt

cành cắm trong dung dịch có sự phối hợp giữa nồng độ sucrose 1,5%, AgNO3

35mg/l và sinh khối vi khuẩn 129

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của các dạng chế phẩm lên các chỉ tiêu cảm quan của

hoa cẩm chướng 130

Bảng 3.26 Kết quả khảo sát môi trường và chủng vi khuẩn trong thu nhận PHB

ở điều kiện nuôi cấy lỏng lắc 135

Bảng 3.27 Các thông số của quá trình nuôi cấy thu nhận PHB từ chủng M

radiotolerans H2T trên môi trường Med3 với các nồng độ methanol bổ sung ở các thời điểm khác nhau 138

Bảng 3.28 Tóm tắt về đặc tính của các chủng Methylobacterium spp phân lập

được ở vùng Đông Nam Bộ 142

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Pseudomonas methanica và Vibrio extorquens 5 Hình 1.2 Methylobacterium spp trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn

chụp qua kính hiển vi điện tử (B) 6

Hình 1.3 Methylobacterium spp chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trường thạch

LB (A) và môi trường dịch thể LB (B) 7

Hình 1.4 Biến dưỡng hợp chất một carbon ở vi khuẩn Methylobacterium

extorquens AM1 9

Hình 1.5 Cây phát sinh loài (dựa theo trình tự 16S rRNA) thể hiện các nhánh

khác nhau của vi khuẩn nốt sần (rhizobia), 11

Hình 1.6 Nốt sần rễ cây C perrottetii hình thành khi ủ chung với vi khuẩn 11 Hình 1.7 Khuẩn lạc của vi khuẩn Methylobacterium spp phân lập 12 Hình 1.8 Sự tái sinh chồi của lá cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trường MS

không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy 17

Hình 1.9 Sự hiện diện của dòng vi khuẩn PPFM (đã dòng hoá gen gfp) trên lá

cây cỏ ba lá đỏ (A,B), rễ cây cỏ ba lá (C) và cây lúa mì (D) 18

Hình 1.10 P deltoides _ nigra DN34 tái sinh từ mô nuôi cấy in vitro trên môi

trường thạch MS 18

Hình 1.11 Sự phát triển của rêu Funaria hygrometrica trong điều kiện có vi

khuẩn Methylobacterium spp (+) và đối chứng (-) 20

Hình 1.12 Giả thuyết về cơ chế tương tác ở mức độ trao đổi các chất chuyển

hóa giữa mô thực vật và vi khuẩn PPFM 22

Hình 1.13 Cấu trúc phân nhánh của tế bào Methylobacteium extorquens (A) và

phân bố của PHB trong tế bào (B) 24

Hình 1.14 Các cơ chế kích thích sự tăng trưởng ở thực vật của Rhizobacteria 28 Hình 1.15 Tương tác quorum sensing 36 Hình 1.16 Hệ thống điều hòa sinh tổng hợp AHL ở vi khuẩn Garm âm 37

Hình 1.17 Mô hình tương tác QS giữa thực vật và vi khuẩn 40

Hình 1.18 Hiện tượng thối nhũn ở cây Amorphophallus konjac sau khi ủ với vi khuẩn Erwinia carotovora SCG1 sau 5 ngày 42

Hình 1.19 Sơ đồ các con đường tín hiệu được hoạt hóa và sự liên hệ các phản ứng đề kháng ở thực vật 44

Hình 1.20 Sơ đồ về hệ thống truyền tín hiệu được cảm ứng với Rhizobacteria và tác nhân gây bệnh 45

Hình 1.21 Các khu vực bảo tồn ở vùng Đông Nam Bộ 47

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí lấy mẫu phân lập vi khuẩn Methylobacterium spp tại vùng Đông Nam Bộ 48

Hình 2.2 Hệ thống cấp độ đánh giá mức độ gây bệnh của vi khuẩn Erwinia chrysanthemi trên Arabidopsis thaliana 66

Hình 2.3 Bảng điểm đánh giá các mức độ tươi của hoa cẩm chướng 75

Hình 2.4 Bảng điểm đánh giá các mức độ tươi của thân và lá cành hoa cẩm chướng 75

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 2F,2R 85

Hình 3.2 Cây phát sinh loài của tất cả các loài trong chi Methylobacterium và các chủng phân lập được ở vùng Đông Nam Bộ 87

Hình 3.3 Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm IV 88

Hình 3.4 Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm II 88

Hình 3.5 Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm III 89

Hình 3.6 Cây phát sinh loài chi tiết cho nhóm I 90

Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium dưới kính lúp (x55) 92

Hình 3.8 Hình thái tế bào M komagatae TN10 quan sát dưới kính hiển vi quang học sau khi nhuộm Gram; hình dạng tế bào M radiotolerans H2T chụp qua kính hiển vi điện tử quét 93

Hình 3.9 Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự tạo chồi ở cây thuốc lá (A), ở cây

cà chua (B), ở cây Saintpaulia (C) sau 21 ngày nuôi cấy 97

Hình 3.10 Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá (E); cây súp lơ (F) sau 21 ngày nuôi cấy 99

Hình 3.11 Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây hoa cúc (A) và cây hông sau 21 ngày đồng nuôi cấy (B) 100

Hình 3.12 Chồi ngọn cây thuốc lá nuôi cấy trên MS sau 14 ngày 102

Hình 3.13 Chồi cây cà chua nuôi cấy trên môi trường MS sau 14 ngày 102

Hình 3.14 Chồi ngọn cây hoa cúc nuôi cấy trên MS sau 14 ngày 102

Hình 3.15 Chồi ngủ cây hoa cúc nuôi cấy trên môi trường MS sau 14 ngày 102

Hình 3.16 Cây hoa cúc sau 21 ngày ra vườn ươm 103

Hình 3.17 Cây cà chua sau 21 ngày ra vườn ươm 103

Hình 3.18 Cây thuốc lá sau 21 ngày ra vườn ươm, 104

Hình 3.19 Phân tích dịch chiết pha acid bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 105 Hình 3.20 Vị trí của dịch chiết GA sau sắc ký bản mỏng 107

Hình 3.21 Triệu chứng thối nhũn (do Erwinia spp.) của cây Arabidopsis thaliana Col0 trong điều kiện có hay không bổ sung vi khuẩn Methylobacterium spp., A: cây in vitro; B: cây thủy canh 114

Hình 3.22 Tín hiệu huỳnh quang trên bảng sắc ký dịch trích AHL, quan sát dưới tia UV 115

Hình 3.23 Sự biểu hiện gus ở cây Arabidopsis thaliana dòng pr1::gus sau khi xử lý với dung dịch AHLm (từ vi khuẩn M radiotolerans H2T ) và các chất chuẩn (C6; C8, C10) sau 96 giờ 117

Hình 3.24 Sự biểu hiện gus ở cây Arabidopsis thaliana dòng pr1-gus sau khi xử lý với vi khuẩn Methylobacterium spp 96 giờ 119

Hình 3.25 Tỉ lệ nảy mầm của hạt sau 4 ngày gieo A: Hạt đậu xanh được xử lý với M oryzea 1021, B: hạt đậu xanh với nước cất, C: hạt cà chua với M oryzea 1021b, D: hạt cà chua với nước cất 125

Hình 3.26 Tình trạng hoa cẩm chướng trong dung dịch SK-ESG, ESG, NH, SK-

ASG, ASG so với nước cất sau 8 ngày 130

Hình 3.27 Sự phát ánh sáng cam dưới kính hiển vi huỳnh quang của một số

chủng khi nhuộm tế bào với NileBlue A 131

Hình 3.28 Sắc ký đồ GC gồm peak dung môi chloroform và peak

3-hydroxylbutyryl methyl với mẫu PHB chuẩn 132

Hình 3.29 Sắc ký đồ GC - MS xác định sản phẩm 3-hydroxylbutyryl methyl,

được xử lý từ mẫu sinh khối khô của chủng M radiotolerans H2T 133

Hình 3.30 Sản phẩm PHB dạng bản mỏng sau khi tách chiết bằng dung môi

chloroform từ chủng M radiotolerans H2T 135

DANH MỤC ĐỒ THỊ-SƠ ĐỒ

Đồ thị 3.1 Đường cong tăng trưởng chủng M radiotolerans H2T 93

Đồ thị 3.2 Đường tương quan giữa sai biệt trọng lượng tử diệp với nồng độ BA

(trái) và đường tương quan giữa OD530 nm với nồng độ IAA (phải) 106

Đồ thị 3.3 Tỉ lệ % các cấp độ gây thối nhũn của vi khuẩn E chrysanthemi lên

cây Arabidopsis thaliana Col0 trồng ở điều kiện thủy canh 112

Đồ thị 3.4 Tỉ lệ % các cấp độ gây thối nhũn của vi khuẩn E chrysanthemi lên

cây Arabidopsis thaliana Col0 trồng ở điều kiện in vitro 112

Đồ thị 3.5 Tác động của các loại AHL khác nhau lên sự tăng trưởng của E

chrysanthemi A470 116

Đồ thị 3.6 Tỉ lệ % các cấp độ gây thối nhũn của vi khuẩn E chrysanthemi đã

xử lý với AHL từ M radiotolerans H2T lên lá cây Arabidopsis thaliana Col0 trồng ở điều kiện thủy canh sau 48 và 72 giờ 116

Đồ thị 3.7 Đồ thị biểu diễn sự biểu hiện các gen kháng ở cây Aradidopsis

thaliana Col0 khi lây nhiễm vi khuẩn Methylobacterium spp ở các thời điểm khác nhau 118

Đồ thị 3.8 Đồ thị biểu diễn sự biểu hiện các gen kháng ở dòng Aradidopsis

thaliana Col0 và sid2 khi lây nhiễm vi khuẩn Methylobacterium spp ở các thời điểm 48 giờ sau khi lây nhiễm vi khuẩn 120

Đồ thị 3.9 Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu xanh trong các điều kiện bảo quản sinh

khối vi khuẩn khác nhau 123

Đồ thị 3.10 Tỉ lệ nảy mầm của các loại hạt thí nghiệm 124

Đồ thị 3.11 Đường chuẩn xác định hàm lượng PHB theo tỉ lệ diện tích peak

(Ax/Ao) bằng phương pháp sắc ký khí GC trên máy Shimadzu GC - 17A 134

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ ly trích các chất từ canh trường nuôi vi khuẩn theo phương

pháp ly trích các chất điều hoà sinh trưởng thực vật 62

TÓM TẮT

16 chủng vi khuẩn Methylobacterium được phân lập lần đầu tiên ở Việt Nam

từ các nguồn mẫu lá cây, đất và nước ở các sinh cảnh đồng ruộng hay rừng tự nhiên

trong vùng Đông Nam Bộ Thông qua phân tích trình tự gen mã hóa rRNA 16S xác định 16 chủng thuộc 4 loài khác nhau: M radiotolerans, M oryzae, M zatmanii và

M komagatae Loài M radiotolerans (với 11 chủng phân lập) xuất hiện trên nhiều

loại mẫu và ở nhiều khu vực trong vùng Đông Nam Bộ

Thông qua khảo sát các đặc tính của các chủng phân lập phát hiện những đặc tính mới được ghi nhận bao gồm: ảnh hưởng lên quá trình phát sinh cơ quan ở thực vật; Sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật, nhóm gibberellin; Cảm ứng

hệ thống kháng tập nhiễm (SAR) ở cây thông qua phân tử AHL và con đường salicylic acid

Trên cở sở đặc tính của các chủng, các định hướng nghiên cứu ứng dụng mới

đã được triển khai Trong đó, chế phẩm có hoạt tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành là

sự phối hợp giữa sinh khối vi khuẩn và các chất bổ trợ (đường, nitrate bạc và GA3) Chế phẩm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống là lây nhiễm một hỗn hợp sinh khối

nhiều chủng vi khuẩn Methylobacterium spp vào hạt và dùng chính hạt làm chất

mang sinh khối vi khuẩn

Nhựa phân hủy sinh học (PHB) có thể thu nhận từ việc nuôi cấy các chủng

Methylobacterium spp phân lập ở vùng Đông Nam Bộ Sự tích lũy PHB cao

(50,55%) ở chủng M radiotolerans H2T từ nguồn cơ chất methanol (có giá thành

hạ) là một điểm mới và ưu thế cho việc nghiên cứu thu nhận PHB ở nước ta

MỞ ĐẦU

Từ lâu, khả năng cố định đạm của vi khuẩn nốt sần (Rhizobium) đã được sử

dụng để tăng năng suất cây trồng Việc ứng dụng thành công nhóm vi sinh vật này

là cơ sở cho sự hình thành hướng vi sinh-nông nghiệp với mục tiêu nghiên cứu các

vi sinh vật và ứng dụng trong ngành nông nghiệp Thành tựu của hướng nghiên cứu này đã tạo ra các chế phẩm như phân bón vi sinh, thuốc trừ sâu vi sinh, góp phần không nhỏ trong tăng năng suất cũng như gia tăng chất lượng nông sản Ngày nay, dưới áp lực về dân số và ô nhiễm môi trường, việc nghiên cứu và áp dụng các thành tựu mới về vi sinh trong nông nghiệp ngày càng được quan tâm và đẩy mạnh

Ở nước ta, nông nghiệp vẫn chiếm tỉ trọng lớn trong nền kinh tế và với mục tiêu hiện đại hóa nền nông nghiệp thì việc nghiên cứu áp dụng vi sinh vật trong nông nghiệp cũng cần được chú trọng Do đặc điểm nền nông nghiệp và điều kiện sinh thái nên hệ vi sinh vật ở nước ta cũng có những đặc điểm riêng Chính vì thế, chúng ta không thể áp dụng một cách máy móc các hệ vi sinh vật từ nước ngoài mà cần nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong nước và cân nhắc, chọn lọc các hệ vi sinh vật nhập nội

Hiện tại, các nghiên cứu không chỉ tập trung vào khai thác hệ vi sinh vật vùng

rễ mà hệ vi sinh vật vùng lá cũng được chú ý nhiều Hệ vi sinh vật vùng lá tuy không đa dạng và phong phú như hệ vi sinh vật vùng rễ nhưng chúng có những đặc điểm khiến chúng trở nên đặc biệt như khả năng sử dụng methanol, sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hay sinh tổng hợp những chất mới mà chưa được biết tới

Chi Methylobacterium là nhóm vi khuẩn hồng, dinh dưỡng methyl tùy ý

(pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) [63] Chúng cư ngụ chủ yếu ở vùng

diệp quyển, nhưng đôi khi vẫn tìm thấy ở trong đất và trong nước Chúng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12) và

các enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại đối với thực vật, là nhóm vi khuẩn có ích nên chúng đã được sử dụng để tăng năng suất lúa, kích thích

sự sinh trưởng của mía, bông vải hay gia tăng tính kháng bệnh ở đậu phộng [97], [99], [102], [104]

Nhóm vi khuẩn này có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, cũng như trong công nghiệp sản xuất polymer phân hủy sinh học, protein tái tổ hợp nên chúng đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu như Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Thụy Sĩ, Pháp Các nghiên cứu này đang dần làm rõ các đặc tính của chi vi khuẩn này Tuy nhiên, chính sự đa dạng về loài và các đặc tính mới là những vấn đề đang được tiếp tục nghiên cứu Thêm vào đó, Việt Nam được đánh giá có hệ sinh thái đa dạng và hệ sinh vật phong phú nhưng chưa có công trình nào đề cập tới chi vi khuẩn này Vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài:

Nghiên cứu các đặc tính vi khuẩn Methylobacterium spp phân lập ở vùng

Đông Nam Bộ nhằm đạt được các mục tiêu như sau:

- Thu thập các chủng vi khuẩn Methylobacterium spp ở vùng Đông Nam Bộ,

xác định tên và các đặc tính của chủng phân lập được nhằm tạo ra nguồn

chủng vi khuẩn Methylobacterium spp phục vụ cho các nghiên cứu tiếp

theo

- Nghiên cứu những đặc điểm về cơ chế tương tác với thực vật, tương tác với

vi sinh vật gây bệnh cho thực vật và sự sinh tổng hợp các hợp chất có giá trị của các chủng phân lập được

- Nghiên cứu phát triển các chế phẩm trên cơ sở nguồn chủng phân lập và các đặc tính được nghiên cứu

Các kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học cho việc xây dựng, phát triển chế

phẩm vi sinh vật từ vi khuẩn Methylobacterium spp., phù hợp với điều kiện sinh

thái và nhu cầu của nền nông nghiệp nước ta

1 Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Chi vi khuẩn Methylobacterium

1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại chi Methylobacterium

Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng

methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như fomate, formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng [63]

Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau:

dụng Trong đó, loài Methylobacterium spp được Bassalik phân lập lần đầu tiên vào năm 1913 từ giun đất và được đặt tên lúc đầu là Bacillus extorquens [63]

Trong giai đoạn trước năm 1960, một số loài vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các

loài này được phân loại vào các chi vi khuẩn khác nhau chẳng hạn như:

Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Vibrio… [63], [104]

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Pseudomonas methanica (A) và Vibrio extorquens (B) [140]

Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả

năng sử dụng methane Loài này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [117] Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng M organophilum có nhiều đặc điểm rất giống

với các loài vi khuẩn PPFM đã được công bố trước đây (không có khả năng sử dụng methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa

và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với loài M organophilum, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium

[35], [63]

Từ năm 1992 đến nay, số lượng các loài Methylobacterium spp mới được

phân lập và đặt tên gia tăng nhanh chóng một phần dựa trên sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử Tuy nhiên, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa vẫn là công cụ không thể bỏ qua [50], [106], [165], [171], [172]

1.1.2 Đặc điểm sinh thái

Vi khuẩn Methylobacterium spp phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện

diện trong nhiều môi trường khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nước sạch [83], nước mưa, không khí [164], băng ở hai cực, bề mặt lá cây (hình 1.2) [81], nốt sần ở

A B

rễ thực vật, các loại hạt giống, thực phẩm [25], mỹ phẩm, môi trường bệnh viện,

dung dịch ngâm xác động vật, trong một vài trường hợp vi khuẩn Methylobacterium

spp còn được phân lập từ miệng, bề mặt da ở người, máu của bệnh nhân nhiễm HIV… [20], [50], [58], [63], [163], [169]

Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này thường được phân lập từ bất kỳ môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan Ngoài ra, vi khuẩn PPFM còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nước sạch dùng để sinh hoạt [57], [58], [59], [67], [83]

Vi khuẩn PPFM hiện diện trên vùng căn quyển, diệp quyển của hơn 70 loài thực vật và chúng có mối quan hệ mật thiết với thực vật Thông qua phương pháp

sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả năng sử dụng các hợp chất methanol từ thực vật của vi khuẩn PPFM, điều này giải thích nguyên nhân sự hiện diện của vi khuẩn PPFM trên thực vật [63], [72], [115]

qua kính hiển vi điện tử (B) [72]

Vi khuẩn Methylobacterium spp có hiện diện trên bề mặt lá, thân, rễ của thực

vật nhưng mật độ ở mỗi cơ quan thì khác nhau [122] Bên cạnh đó, khi sử dụng các phương pháp chuyên biệt chẳng hạn như phương pháp lai tại chỗ với mẫu dò đặc

trưng cho chi Methylobacterium, Pirttil và cộng sự (2000) đã chứng tỏ vi khuẩn

Methylobacterium spp có hiện diện bên trong chồi của cây Thông (Pinus sylvestris)

hay nằm bên trong các bó mạch của các cây họ cam chanh [23], [119]

Vi khuẩn PPFM thường lan truyền qua không khí, có khả năng sử dụng các hợp chất có tính độc với sinh vật làm nguồn cung cấp carbon và nitơ: tetrachloromethane, trimethylamine Chính vì vậy, các vi khuẩn PPFM còn đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon trong tự nhiên [45], [63], ứng dụng trong xử lý

ô nhiễm môi trường [170] Tuy nhiên, vai trò của chúng trong hệ sinh thái vẫn chưa được sáng tỏ [85]

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá

Hầu hết các loài vi khuẩn Methylobacterium spp thường có hình que (0,8-1,0

x 1,0-0,8m) (hình 1.3) Tế bào thường có dạng phân nhánh hay có những hình dạng bất thường khác đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng, vi khuẩn thường nằm ở dạng tế bào đơn hay đôi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [63], [83], [140]

(A) và môi trường dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [141]

Hầu hết các chủng đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao (flagellum) ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài loài lại không có khả năng di động Tế bào thường chứa một lượng lớn các thể bắt màu với thuốc nhuộm sudan (poly--

hydroxybutyrate) hay các hạt volutin Đa số các loài vi khuẩn Methylobacterium

spp là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi Một vài loài có cấu trúc thành

tế bào nhiều lớp và con đường biến dưỡng citrate đặc trưng cho nhóm vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn thường tăng trưởng chậm, khuẩn lạc thường có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một vài chủng không tăng trưởng được trên môi trường nutrient agar Sắc tố hồng của vi khuẩn không tan trong nước, không phát ánh sáng huỳnh quang và là hợp chất carotennoid, hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532nm [50], [63]

Hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Oxidase dương tính yếu,

catalase dương tính hay âm tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn Methylobacterium spp

là những vi khuẩn hóa dị dưỡng, có khả năng sử dụng tùy ý các hợp chất methyl

Do vậy, tất cả các loài đều có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung formaldehyde [40], formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng các hợp

chất methylamine, chỉ có một loài duy nhất là M organophilum có khả năng sử

dụng methane làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng Ngoài ra, các nghiên cứu

cũng cho thấy khả năng sử dụng methane của M organophilum là do các gen nằm

trên plasmid chi phối, bởi vì khả năng sử dụng methane của vi khuẩn này bị mất đi trong trường hợp môi trường nuôi cấy không thường xuyên được bổ sung methane [50], [63]

Phương thức chuyển hóa các hợp chất một carbon ở tất cả các loài vi khuẩn PPFM đều theo chu trình serine (hình 1.4), trong đó có sự gắn kết của chu trình serine và chu trình tricarboxylic acid (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử dụng Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly--hydroxybutyrate) [63]

Trong tất cả các loài PPFM thuộc chi Methylobacterium spp thì loài

Methylobacterium extorquens được nghiên cứu nhiều nhất và M extorquens cũng

được xem là vi khuẩn kiểu mẫu cho chi Methylobacterium spp Ngoài ra, còn rất

nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu vai trò của các gen tham gia vào chu trình

chuyển hoá các hợp chất một carbon, điều này sẽ giúp cho việc sử dụng các loài vi

khuẩn Methylobacterium spp một cách hữu ích nhất [41], [109]

extorquens AM1 Các gen đã biết được in nghiêng Để đơn giản hóa các phản ứng oxy hóa khử trong chu trình đồng hoá không trình bày trong sơ đồ này [41]

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium

dao động từ 25 đến 300C Một vài loài vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 370C hay

510C Mặc dù đa số các loài đều tăng trưởng ở khoảng pH trung tính nhưng cũng có

một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH cực đoan (pH4; pH10) Tất

cả các loài đều không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng và không có khả năng phân giải các hợp chất như: casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA Khả năng phân giải các hợp chất lipid chỉ có ở một số loài Tất cả các loài đều không tạo

ra các enzyme: -galactosidase, L-ornithine decarboxylase, L-lysine decarboxylase, L-arginine dihydrolase (ngoại trừ Urease lại hiện diện ở tất cả các loài) Một số loài

có khả năng sinh indole và H2S, test methyl red và Voges-Proskauer âm tính, hay khử nitrate thành nitrite [50], [58], [63], [70], [83]

Hầu hết các loài đều nhạy cảm với các chất hay hợp chất kháng sinh như: kanamycin, gentamycine, albamycin T, streptomycin, framycetin và tetracycline,

trong đó tetracyclin có hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium

spp Ngoài ra, các chủng vi khuẩn còn có khả năng đề kháng với nhiều kháng sinh như: cephalothin, nalidixic acid, penicillin, bacitracin, carbenicillin, colistin sulfate, polymyxin B và nitrofurantoin [63]

Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp carbon và năng

lượng ở các loài vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng Do vậy,

có thể xác định loài vi khuẩn Methylobacterium spp căn cứ vào khả năng sử dụng

các hợp chất hữu cơ của chủng vi khuẩn này (Bảng 1.2) [70]

Những nghiên cứu phân tích DNA và rRNA cho thấy các loài vi khuẩn

Methylobacterium spp có quan hệ họ hàng rất gần với các loài vi khuẩn trong chi Agrobacterium và Rhizobium (hình 1.5) Những nghi vấn này được làm sáng tỏ khi

Sy và cộng sự (2001) phân lập được loài vi khuẩn M nodulans từ nốt sần của các cây Crotalaria, loài này không có sắc tố hồng như các loài vi khuẩn

Methylobacterium spp nhưng có trình tự rRNA 16S tương đồng với chi Methylobacterium và có vai trò trong việc hình thành nốt sần ở rễ các cây họ đậu,

trong đó có các gen như: nod, nifH đóng vai trò tương tự như các gen cố định nitơ ở

vi khuẩn Rhizobium (hình 1.6) [75], [141].

Hình 1.5. Cây phát sinh loài (dựa theo trình tự 16S rRNA) thể hiện các nhánh khác nhau của vi khuẩn nốt sần (rhizobia), bao gồm cả vi khuẩn M nodulans thuộc chi Methylobacterium ở nhóm -proteobacteria [141]

Hình 1.6 Nốt sần rễ cây C perrottetii hình thành khi ủ chung với vi khuẩn

M nodulans ORS2060; (a) các nốt sần nguyên vẹn; (b) phẫu thức cắt dọc nốt sần cho thấy vùng mô phân sinh thứ cấp (m), vùng bị tác động (iz), vùng lõi (sz), bó mạch (vb) [141]

1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh

Methylobacterium spp là những vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol làm

nguồn cung cấp carbon và năng lượng, vì thế môi trường methanol mineral salts

(MMS) là môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn Methylobacterium spp Ngoài

ra, vi khuẩn Methylobacterium spp có sắc tố hồng đặc trưng nên rất dễ nhận diện

trên môi trường phân lập (hình 1.7) [63]

từ cỏ ba lá trên môi trường có methanol [174].

Khoảng nhiệt độ thường được sử dụng để phân lập Methylobacterium spp là

25-300C Vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng tương đối chậm, trên môi trường MMS sau 2 đến 3 ngày mới hình thành khuẩn lạc, khuẩn lạc đạt đường kính tối đa 1-3 mm sau 7 ngày nuôi cấy Đôi khi vi khuẩn mọc nhanh, có màu đậm hơn trên môi trường Glycerol-Peptone Agar và môi trường này thường được sử dụng trong giữ giống các chủng PPFM [63]

Ngoài việc sử dụng methanol làm tác nhân chọn lọc thì việc sử dụng cycloheximide cũng giúp cho quá trình phân lập được thuận lợi hơn Khi sử dụng môi trường MMS làm môi trường phân lập thì những khuẩn lạc màu hồng có đường kính khoảng 1 mm thường là vi khuẩn PPFM, trong môi trường này nhóm nấm men hay nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng không phải là phổ biến [63], [104]

1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium

Theo thống kê của ngân hàng dữ liệu NCBI [171] thì đã có tổng cộng 35 loài Tuy nhiên, chỉ có 33 loài đã được công bố trên các tạp chí uy tín Trong đó lại có 3

loài được sắp xếp lại: M dichloromethanicum và M chloromethanicum là loài M

extorquens, còn M lusitanum là loài M rhodesianum [83] Vì vậy, tổng số loài cho

tới thời điểm tháng 10 năm 2010 là 30

Bảng 1.1. Danh mục các loài Methylobacterium spp đã được đặt tên Lựa chọn

dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI [172]

1 M adhaesivum 11 M podarium 21 M aerolatum

2 M aminovorans 12 M populi 22 M jeotgali

3 M aquaticum 13 M radiotolerans 23 M oryzae

4 M extorquens 14 M rhodesianum 24 M platani

5 M fujisawaense 15 M rhodinum 25 M goesingense

6 M hispanicum 16 M suomiense 26 M persicinum

7 M isbiliense 17 M thiocyanatum 27 M komagatae

8 M mesophilicum 18 M variabile 28 M brachiatum

9 M nodulans 19 M zatmanii 29 M tardum

10 M organophilum 20 M iners 30 M gregans

1.1.6 Khoá phân loại chi Methylobacterium

Cũng giống như các vi khuẩn khác, việc định danh vi khuẩn Methylobacterium

spp cũng có thể tiến hành theo phương pháp truyền thống (căn cứ trên các đặc điểm

về hình thái, sinh lý, sinh hóa) hay phương pháp sinh học phân tử (căn cứ trên sự khác biệt về trình tự của các phân tử sinh học: gen mã hóa rRNA 16S, rRNA 23S (internally transcribed spacer, ITS, intergenic spacer, IGS) và tiểu phần β phân tử DNA gyrase Phương pháp truyền thống tuy có khuyết điểm về độ nhạy cũng như

sự phức tạp trong quá trình thực hiện nhưng nó vẫn là “quy tắc vàng” trong định danh vi khuẩn Hiện tại, các phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng để định danh Tuy nhiên, để có kết quả chính xác nhất vẫn luôn kèm theo việc định danh bằng phương pháp truyền thống Sự kết hợp cả hai phương pháp này gần như là bắt buộc trong việc đặt tên cho các loài vi khuẩn mới được phát hiện [136]

1.1.6.1 Phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá

Theo khoá phân loại Bergey (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology) tái bản lần thứ 9 [70], chi Methylobacterium có các đặc điểm khác biệt với các chi

khác trong nhóm vi khuẩn sử dụng methyl và được trình bày trong bảng 1.2

Hình cầu + + + + + + + + + +/- + + Hình que - - - + - - - +/- - -bĐường kính µM 0,6 -

0,8 0,8 - 1,0 1,0 -1,2 0,3 – 0,5 0,8 – 1,0 1,0

0,5 – 1,2 0,2

0,3 – 0,6 0,5 – 0,9 0,9 – 1,3 0,4 – 1,0 Phản ứng cysts - - - + D - - - Khả năng di động + - + D + - + + D - + D

Vị trí tiêm mao

ở cực - + + D + + + d -

ở một bên + - - D - - - d +

ở cận cực - - - D - - - Cần NaCl - - - D + - - - - Cần vitamine B12 - - - + - -

Cần vitamine B1 - d - - - d -

Nguồn carbon -

Methane - - + - D + + - - - - Methanol + + + + + + + + + + + + Methylamine + D + d

Formaldehyde - + D

Hợp chất đa

carbon + + + D + - - + d + + + Chu trình biến dưỡng chính

Ribulose

monophosphate + - + + + +

Serin - + - - - -

Oxidase - + - +/w + + + + + + Catalase + + + D + + + + + + + Sinh tổng hợp Poly--

hydroxybutyrate - - + - + - - - + + + Sắc tố

trắng, vàng, hồng

trắng, vàng sáng

nâu sậm

trắng, vàng sáng

hồng,

đỏ cam không hồng, trắng Hồng không trắng, vàng sáng Vàng Vàng Khả năng cố định CO 2 - - + + - - D - + Tăng trưởng ở 450C - - - + - - - D Tăng trưởng ở pH dưới

5,5 - + - - - - - - - - - - Oxy hóa ethanol thành

acid acetic ở pH 4,5 + + - - - - - - - - - Acid béo

Chú thích: 1:Acetobacter methanolicus; 2: Acidomonas; 3: Derxia; 4: Methylobacillus; 5:

Methylobacterium; 6: Methylococcus; 7: Methylomonas; 8: Methylophaga; 9: Methylophilus; 10: Paracoccus dentrifinicans/alcaliphilus; 11: Rhizobacter; 12: Xanthobacter ; +: hơn 90% các chủng cho phản ứng dương tính; -: hơn 90% các chủng cho phản ứng âm tính; d: 11-89 % các chủng cho phản ứng dương tính; v: chủng không ổn định; D: phản ứng khác biệt ở nhóm phân loại khác; W: chủng mọc yếu

Dựa vào bảng 1.2 ta có thể định danh được loài vi khuẩn mục tiêu có thuộc chi

Methylobacterium hay không Tuy nhiên, để xác định được loài vi sinh vật mục tiêu

là loài vi khuẩn Methylobacterium spp nào thì cần phải dựa vào khả năng sử dụng

các nguồn carbon khác nhau của loài đó Đặc điểm khả năng sử dụng các nguồn

carbon của một vài loài Methylobacterium spp được trình bày theo bảng 1.3

Chú thích: 1: M.suomiense; 2: M lusitanum; 3: M extorquens; 4: M organophilum; 5:

M rhodesianum; 6: M zatmanii; 7: M rhodinum; 8: M radiotolerans; 9: M mesophilicum; 10: M aminovorans; 11: M fujisawaense; 12: M thiosyanatum; 13: M chloromethanicum; 14: M dichloromethanicum;15: M hispanium; 16: M aquaticum; 17:

M variable; 18: M isbiliense; +: có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định; d:

từ 11-89% các trường hợp có sử dụng

1.1.6.2 Phân loại dựa vào phân tích trình tự rRNA 16S

Việc sử dụng trình tự rRNA 16S trong định danh các loài vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium ngày càng được sử dụng rộng rãi Hiện tại trên ngân hàng gen đã

lưu trữ các trình tự gần như nguyên vẹn của gen mã hóa rRNA 16S của tất cả các

loài Methylobacterium spp đã được nghiên cứu Do vậy, chỉ cần so sánh trình tự gen mã hóa rRNA 16S của loài vi khuẩn cần định danh và cơ sở dữ liệu trong ngân hàng gen ta có thể biết được tên của loài vi sinh vật mục tiêu Ngoài ra, việc kết hợp

giữa so sánh trình tự gen mã hóa rRNA 16S, trình tự gryB và các đặc điểm sinh lý,

sinh hóa sẽ đem lại kết quả chính xác trong việc định danh vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium cũng như xác định loài mới trong chi vi khuẩn này [57], [58],

được dùng để xác định nhanh sự hiện diện của vi khuẩn Methylobacterium trong

các nguồn mẫu khác nhau [85], [88]

1.1.7 Các đặc tính của vi khuẩn Methylobacterium spp

1.1.7.1 Tương tác với thực vật

Giữa cây và vi khuẩn có quan hệ tương hỗ, một số vi khuẩn có lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hóa, cung cấp cho cây các chất dinh dưỡng cần thiết Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò quan trọng của các vi khuẩn kích thích tăng trưởng ở vùng rễ thực vật (PGPR-Plant Growth Promoting Rhizobacteria), tuy nhiên, tầm quan trọng của hệ vi sinh vật vùng lá vẫn chưa được hiểu rõ Hầu hết các vi khuẩn sống bám trên bề mặt lá sống hoại sinh dựa vào nguồn cơ chất tiết ra từ dịch lá Có nhiều loại chất hữu cơ và vô cơ trong dịch

lá, bao gồm tất cả các yếu tố thiết yếu, đường tự do, rượu kết hợp với đường, các amino acid, nhiều acid hữu cơ, chất điều hòa tăng trưởng, vitamine, alkaloid và các hợp chất phenol Thực tế ở một số rừng mưa nhiệt đới, vi sinh vật có thể tạo thành một lớp dày 50µm trên bề mặt lá nhưng các nghiên cứu lại quan tâm nhiều đến các loài gây bệnh và ký sinh hơn là các loài có tác động tích cực Nguồn thức ăn từ dịch

lá tiết ra có lẽ là nguyên nhân của một số vi khuẩn sống cơ hội và trở thành loài cư trú thường xuyên trên bề mặt thực vật Liệu có loài nào trong chúng cung cấp trở lại cho thực vật hay không? [69]

Vi khuẩn dinh dưỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều loài cây Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi

khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trường nuôi cấy in

vitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật (hình 1.8) Thuốc lá,

cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trưởng mạnh hơn so với đối chứng

(số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên môi trường không có vitamine [80], [79]

không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy (a): không bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [80]

PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều loài cây, chúng được phân lập từ hơn 100 loài thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các loài cây hạt trần và cây hạt kín (hình 1.9) Gần đây có khá nhiều nghiên cứu đã phân lập và khảo sát ảnh hưởng có lợi của vi khuẩn PPFM đối với sự tăng trưởng và sinh lý của thực vật bậc thấp cho tới bậc cao Mặc dù chưa có bằng chứng tuyệt đối, nhưng các kết quả nghiên cứu đã cho thấy mối quan hệ tương hỗ trong việc vi khuẩn PPFM tận dụng nguồn cơ chất thải

ra từ thực vật và ngược lại chúng tiết các hợp chất có hoạt tính sinh học cung cấp trở lại cho cây chủ [50], [69], [87], [92], [93], [100], [104], [115]

Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn

Methylobacterium spp là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá

được rửa sạch Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thông

thường trong khâu chuẩn bị nuôi cấy mô không loại trừ được Methylobacterium

spp Dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhưng các mô sẹo phát sinh từ những

mẫu mô này vẫn có nguy cơ bị nhiễm PPFM (hình 1.10) Đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú và không gây bệnh thực vật, phân bố chủ yếu ở vùng lá, đặc biệt là những lá non; ngoài ra PPFM cũng sống ở vùng rễ cây và ở các hạt PPFM chiếm tỉ

lệ lớn và có mật độ từ 104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu: colony-forming unit) trên mỗi gam trọng lượng tươi của mô thực vật Chúng lây nhiễm qua hạt, ở hạt đậu nành khô thì mật độ là 105 cfu/gam [69], [104]

cỏ ba lá đỏ (A,B), rễ cây cỏ ba lá (C) và cây lúa mì (D) Mũi tên ở hình A và B biểu thị vi khuẩn nằm sâu trong kẽ lá, s: lục lạp, thanh ngang: A, 40 m; B, 20 m; C, 8

Tuy PPFM không tăng trưởng nhanh như các vi khuẩn vùng lá khác trên môi trường giàu dinh dưỡng nhưng chúng vẫn có khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên

lá Một số tác giả cho rằng dinh dưỡng methyl tùy ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thường là methanol, PPFM có thể loại bỏ chất độc này khỏi mô thực vật và có được chỗ cư ngụ trong lá (môi trường chỉ thích hợp với một vài loài vi khuẩn) Việc phân hủy các pectin có methyl có thể tạo một nguồn methanol trong cây Hoạt động này càng phổ biến ở các mô đang tăng trưởng [92], [115] Mặt khác, khi cư ngụ trên thực vật thì methanol không phải là nguồn carbon duy nhất cho vi khuẩn

Methylobacterium spp [142] mà còn oxalic acid – một sản phẩm bài tiết của thực

vật – cũng là một nguồn carbon cho một vài loài trong chi Methylobacterium Tuy

nhiên, khả năng sử dụng chất bài tiết oxalic acid có phải là một cơ chế mới của quá

trình tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium spp và thực vật hay không vẫn

chưa sáng tỏ [129], [130]

Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, còn nhiều bằng chứng cho thấy mặc

dù PPFM thu nhận chất dinh dưỡng từ cây chủ nhưng đây không phải là mối quan

hệ một chiều Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hóa và chuyển hóa quan trọng ở cây chủ

Methylobacterium spp nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng như khả năng tổng hợp

amino acid, PHB (Poly-β-hydroxybutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cường tạo hương vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine và nitramine; khả năng phân hủy và chuyển hoá một số cơ chất không cần thiết ở thực vật thành sản phẩm có giá trị [68], [69], [86], [92], [98], [152], [153], [154], [168]

Tầm quan trọng thực sự của PPFM chính là ở mối quan hệ mật thiết với thực vật Chủng PPFM đầu tiên được Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh

trưởng ở cây rêu (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro Trong những nghiên

cứu ban đầu, họ mô tả vi khuẩn này có thể kích thích sự tăng trưởng và tái sinh của

rêu nuôi cấy mô (hình 1.11) Sau đó, họ chỉ ra rằng PPFM sản xuất vitamine B12

(cyanocobalamine) và sự bổ sung vitamine này khi trồng rêu Jungermannia

leiantha và Gymnocolea inflata có thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển của

cây [69], [72], [71], [132]

Methylobacterium spp (+) và đối chứng (-) [71]

Vi khuẩn Methylobacterium spp có tác động đối với một số lượng lớn các loài

cây trồng có giá trị như: thuốc lá, hông, dâu tây, lúa, bông vải, mía, cà chua, hướng dương, đậu phộng [98], [99], [100], [102], [101], [168] Tuy nhiên, hiệu quả cho từng loại cây không phải do một loài mà là do sự tác động tổng hợp của nhiều loài

vi khuẩn Methylobacterium spp tạo ra [133].

Vi khuẩn Methylobacterium spp có thể được dùng để kích thích hạt của

những cây quý hiếm, đặc biệt là các loài cây nhiệt đới Có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác như giúp phục hồi hạt giống bảo quản, góp phần làm tăng năng suất và sản lượng cây trồng, bảo vệ cây tránh các nguy cơ dịch bệnh và cung cấp các chất chuyển hoá cần thiết cho hạt giống [98], [173].

Cây lúa (Oryza sativa) là một loại cây có mối quan hệ mật thiết với các vi khuẩn PPFM Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium spp tác động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn ex vitro [97], [104] Chúng có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lượng tươi, chiều cao của cây mạ trong điều kiện in vitro, cản trở sự phát sinh

phôi từ mô sẹo, kích thích tăng trưởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa góp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1% Ngoài ra, chúng còn có vai trò ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, góp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7% [100], [104]

Căn cứ vào các công trình công bố về vi khuẩn Methylobacterium spp thì các

cơ chế để giải thích mối tương tác giữa chúng và thực vật bao gồm:

a Chuyển hóa các chất dinh dưỡng khoáng cho cây dễ hấp thu Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp các phân tử (như thể sắt-siderophore) làm quá trình hấp thu khoáng ở cây dễ hơn [77], [160]

b Tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (phytohormone) hay các hợp chất giống phytohormone Sự sinh tổng hợp cytokinin và auxin ở vi khuẩn

Methylobacterium spp đã được ghi nhận [49], [69], [68],[89], [92], [114], [148]

c Tổng hợp và tiết ra enzyme urease, là enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hoá nitơ ở thực vật [69]

d Tổng hợp và tiết vitamine B12 hoặc các hợp chất thứ cấp từ PPFM có thể tăng cường sức sống cho cây con [132]

e Sinh tổng hợp 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC deaminase) điều hòa quá trình sinh tổng hợp ethylene, làm giảm thiểu các hiện tượng lão suy ở thực vật [99], [96]

f Cố định nitơ cung cấp nguồn đạm cho cây [141], [78], [89], [123]

g Sử dụng các tinh thể oxalate calci [129], [130]

giữa mô thực vật và vi khuẩn PPFM [104]

Ngoài khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của một số loài cây

trồng, vi khuẩn Methylobacterium spp còn có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên thực vật chẳng hạn như: Xanthomonas camprestris, Pseudomonas

syringae, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense và Agrobacterium tumefaciens, Fusarium solani (gây bệnh trên cây tiêu), Guignardia citricarpa hay Xylella fastidiosa (gây bệnh nghiêm trọng trên các loài cây có múi) Madhaiyan ghi

nhận khả năng kháng bệnh ở cây lúa và cây đậu phộng có liên quan tới sự thay đổi

hệ enzyme polyphenol trong cây [100], [102] Penalvera và Poonguzhali ghi nhận khả năng sinh tổng hợp các phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone, điều này

giúp vi khuẩn Methylobacterium spp cạnh tranh với các loài vi khuẩn gây bệnh

khác trong quá trình cư trú trên thực vật [118], [121] Các nghiên cứu này ghi nhận khả năng giúp cây trồng kháng lại với các tác nhân gây bệnh nhưng chưa làm sáng

tỏ các cơ chế Tuy nhiên, những ghi nhận này cũng cho thấy tiềm năng sử dụng vi

khuẩn Methylobacterium spp để kiểm soát dịch bệnh trên thực vật [22], [23], [33],

[126]

Có lẽ việc kết hợp tất cả các nguyên nhân nói trên làm thay đổi sự sinh trưởng

ở những cây nhiễm PPFM Từ những công trình nghiên cứu trước đây, có thể thấy rằng vi khuẩn hiếu khí, dinh dưỡng methyl tùy ý (PPFM) đang ngày càng trở nên hấp dẫn trong nghiên cứu ứng dụng vì chúng tương tác có lợi cho cây trồng

1.1.7.2 Sản xuất các hợp chất polymer

PHB (Poly-β-hydroxybutyrate) là một loại nhựa polymer chịu nhiệt, là nguồn carbon dự trữ ở vi sinh vật Do vậy, quá trình sinh tổng hợp hay phân giải hợp chất PHB sẽ do các enzyme có trong sinh vật đảm nhiệm Do đó, PHB được coi như là một loại nhựa sạch, không gây ô nhiễm môi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y dược, nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm PHB được điều chế thành các sản phẩm có giá trị cao như chỉ khâu dùng trong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị gãy, nhựa chịu nhiệt…[166]

Nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp PHB chẳng hạn như: Bacillus spp., Ralstonia eutropha, Zoogloea ramigera, Azotobacter beijierinckii,

Methylobacterium spp… Ở vi khuẩn PHB được tổng hợp theo hai con đường: Ralstonia eutropha, Zoogloea ramigera, Methylobacterium extorques, PHB được

tổng hợp từ acetyl coenzyme A nhờ quá trình xúc tác bởi 3 enzyme: - ketothiolase, NADPH-liên kết với Acetoacetyl-CoA reductase và PHB synthase Trong khi đó ở

vi khuẩn Rhodospirillum rubrum và Methylobacterium rhodezianum thì quá trình

sinh tổng hợp PHB chịu tác động của 5 enzyme khác nhau: -ketothiolase, NADPH-liên kết với Acetoacetyl-CoA reductase, L-(+) crotonase, D-(-) crotonase

và PHB synthase [82], [86]

Đa số các loài vi khuẩn trong chi Methylobacterium đều có khả năng sinh tổng hợp PHB (hình 1.13) nhưng lượng PHB tạo ra ở mỗi loài Methylobacterium spp khác nhau và phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Ở Methylobacterium extorquens

AM1 trên môi trường có nguồn carbon là succinate thì lượng PHB tạo thành chiếm 15-20% trọng lượng sinh khối khô, trong môi trường có methanol lượng PHB tạo ra

chiếm tới 80% trọng lượng khô và Methylobacterium fujisawaense trên môi trường

glucose chỉ sinh tổng hợp được lượng PHB chiếm khoảng 12,4% [166], [175]

phân bố của PHB trong tế bào (B) [63]

Trong tế bào vi khuẩn, PHB được dự trữ trong túi bên trong tế bào PHB bắt màu đặc hiệu với thuốc nhuộm Nile blue, phát ánh sáng đỏ khi được xem dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng 235nm Một số loài vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium đã được sử dụng để tách chiết PHB bao gồm: M extorquens, M fujisawaense, M organophilum, M mesophilicum, M rhodium, M rhodesianum,

M zatmanii, M radiotolerans [17], [86], [166]

1.1.7.3 Các đặc tính khác

Ngoài khả năng sinh tổng hợp PHB, Methylobacterium spp còn có khả năng

sinh tổng hợp một số hợp chất khác có giá trị kinh tế chẳng hạn như: exopolysaccharid được sử dụng để tạo ra các màng sinh học, methylan được sử dụng để tạo ra các polysaccharid ion dương nhằm thay thế cholestyramine dùng trong điều trị bệnh cao huyết áp [90], [159]

Methylobacterium spp có khả năng sử dụng đa dạng các hợp chất hữu cơ khác

nhau, từ các chất không độc cho tới các chất độc đối với sinh vật hay các chất gây ô nhiễm môi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane, trinitrotoluent, Hg,

Ni, Cd ) Do vậy, đây là nhóm vi khuẩn có nhiều tiềm năng để ứng dụng trong xử

lý ô nhiễm môi trường [45], [63], [73], [107], [152]

M radiotolerans, M extorquens, M fujisawaense còn có khả năng kháng

mạnh với các chất phóng xạ, chúng vẫn tồn tại ở liều chiếu xạ 20kGy Vì thế, nhóm

vi khuẩn này được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị cho khả năng vô trùng của các vật dụng dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, y tế được xử lý vô trùng bằng công

nghệ chiếu xạ Ngoài ra, Methylobacterium spp còn có khả năng kháng mạnh với

các chất sát trùng có nguồn gốc Clo, vì thế chúng vẫn tồn tại trong nước uống và

nước sinh hoạt Do vậy, Methylobacterium spp còn được xem như vi sinh vật chỉ

thị cho mức độ ô nhiễm vi sinh vật của nước [58], [67], [113]

Do sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên vi khuẩn

Methylobacterium spp đang là một vi khuẩn kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử

dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị chẳng hạn như: protein đơn bào, -carotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[63], [139] Ngày nay, nhiều công trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu hiện các protein ngoại lai trong tế bào vi khuẩn

Methylobacterium spp., trong đó hai công trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này

là biểu hiện bacteriocin [65] và tinh thể độc tố diệt sâu [43] Từ những nghiên cứu

này, vi khuẩn Methylobacterium spp sẽ trở thành vi khuẩn có lợi trong việc tạo ra

các sản phẩm có giá trị cao, phục vụ nông nghiệp và đời sống [55], [149]

1.1.7.4 Các loài vi khuẩn Methylobacterium spp có hại

Không phải tất cả các loài vi khuẩn Methylobacterium spp là có lợi, một số loài Methylobacterium spp mới được phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người chẳng hạn như loài M mesophilicum tồn tại trên thực vật có thể gây dị ứng, sốt nhẹ M poradium phân lập được ở các nốt sần trên da Một số loài

Methylobacterium spp hiện diện trong miệng của người, chuyển hoá các hợp chất

có chứa lưu huỳnh gây hôi miệng hay gây bệnh hoa chân (foot flora) [21], [20], [131], [135], [169]

Ngoài ra, Methylobacterium spp còn phân bố trong hệ thống cung cấp nước

sạch, sự sinh trưởng của chúng trong hệ thống cung cấp nước có thể dẫn tới tắc nghẽn đường ống cấp nước [67]

1.2 Các cơ chế tương tác của vi khuẩn Methylobacterium spp

Methylobacterium là một trong 13 chi của nhóm Rhizobacteria, nhóm vi

khuẩn kích thích tăng trưởng ở thực vật [19], nên những cơ chế tương tác của vi

khuẩn Methylobacterium spp cũng rất tương đồng với cơ chế chung của

Rhizobacteria (hình 1.14) Thêm vào đó, vì là nhóm vi khuẩn mới được phát hiện và

nghiên cứu nên những cơ chế tương tác của vi khuẩn Methylobacterium spp với

thực vật vẫn chưa được biết hết Chính vì thế, việc hiểu biết các cơ chế tương tác

với thực vật của nhóm Rhizobacteria sẽ là nền tảng cho việc phát hiện các cơ chế tương tác với thực vật của chi vi khuẩn Methylobacterium

Rhizobacteria hay còn được gọi là Plant Growth Promoting Rhizobacteria

(PGPR) là các sinh vật tự do, cư ngụ trên bề mặt rễ, trong vùng căn quyển (rhizophere) hay diệp quyển (phyllosphere) [111], [105] Để sinh trưởng và phát triển, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng do rễ hay lá cây tiết ra, đồng thời cũng sinh tổng hợp một loạt các hợp chất cung cấp lại cho cây với mục tiêu gia tăng sự sinh trưởng của cây để có thêm nhiều chất dinh dưỡng Sự trao đổi nguồn dinh dưỡng này đã hình thành mối quan hệ gắn bó giữa cây và vi sinh vật Về cơ chế trao đổi các chất dinh dưỡng, thực vật cung cấp chủ yếu nguồn carbon (nguồn đường), trong khi đó vi khuẩn sinh tổng hợp rất đa dạng các chất khác nhau, bao gồm: các nguồn khoáng đa lượng, vi lượng, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và các chất kháng sinh Trong các chất trên thì các nguồn khoáng đa lượng (N, P, Ca, Mg)

là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cây và luôn luôn thiếu hụt trong đất nên nhóm