Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng dụng ghép tự thân điều trị các tổn thương mất da

Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể p63 tấm tế bào sừng nhiều lớp được tạo ra trên màng collagen .... Do đó, việc kết hợp giữa màng collagen từ màng ối và tế bào sừng của người



Trần Lê Bảo Hà

NGHIÊN CỨU XÁC LẬP QUY TRÌNH NUÔI CẤY

TẾ BÀO SỪNG NGƯỜI TRÊN MÀNG COLLAGEN

TỪ MÀNG ỐI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG GHÉP TỰ THÂN

ĐIỀU TRỊ CÁC TỔN THƯƠNG MẤT DA

Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật

Mã số: 62 42 30 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS BS Trần Công Toại

2 TS Hoàng Nghĩa Sơn

Thành phố Hồ Chí Minh - 2010

LỜI CAM ĐOAN

TÔI XIN CAM ĐOAN ĐÂY LÀ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA RIÊNG TÔI NHỮNG KẾT QUẢ TRONG NGHIÊN CỨU NÀY HOÀN TOÀN CHƯA ĐƯỢC CÔNG BỐ BỞI BẤT KỲ TÁC GIẢ NÀO KHÁC

TRẦN LÊ BẢO HÀ

Để hoàn thành công trình này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của những người thân, Thầy Cô, bạn bè, đồng nghiệp xung quanh

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS TS BS Trần Công Toại, người đã tạo cho tôi những điều kiện tốt nhất cũng như

đã tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận án Cảm ơn Thầy

đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, tạo nhiều thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với TS Hoàng Nghĩa Sơn, người đã bỏ ra nhiều thời gian giúp tôi hoàn thành luận án

Sự cố vấn của Thầy là nguồn động viên không nhỏ giúp tôi vững bước trên con đường mà tôi đã chọn

Dành cho người luôn động viên, hỗ trợ và gắn bó với tôi từ khi tôi là sinh viên cho đến tận bây giờ và cả sau này, xin đặc biệt cảm ơn Thầy, ThS Phan Kim Ngọc

Chân thành cảm ơn các anh chị, các em Bộ môn Mô phôi – Di truyền – Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch đã

hỗ trợ, chia sẻ vui buồn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án

Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, đặc biệt là các em trong nhóm Vật liệu sinh học, đã luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi trong suốt những năm qua

Cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Út đã cho tôi những góp ý chân thành

Luận án này không thể hoàn thành nếu không nhận được nguồn cung cấp nguyên vật liệu Qua đó, chân thành cảm ơn Bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình đã cung cấp nguồn da và Bệnh viện Hùng Vương đã cung cấp màng ối để tôi có thể thực hiện đề tài này

Đề tài được hoàn thiện nhờ sự hỗ trợ kỹ thuật từ nhiều cá nhân và đơn vị Xin cảm ơn Cô Thoa, Huy - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, anh Bình – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc đánh giá sản phẩm của đề tài Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ, kỹ thuật viên thuộc Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi Đồng I và Trường Đại học Y Dược Tp.HCM đã hỗ trợ tôi trong việc phân tích kết quả mô học

Xa cách về địa lý nhưng rất gần về tấm lòng, xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đối với các chuyên gia Nhật Bản trong việc

cố vấn, huấn luyện về mặt kỹ thuật cho tôi: GS Hirotoshi Miyoshi

và GS Ookawa ở trường đại học Tsukuba, TS Yuji Shirakata và

TS Lujun Yang thuộc trường đại học y Ehime và TS Masahiro Kino_oka đến từ trường đại học Osaka

yêu vô bờ Cảm ơn các Anh Chị đã luôn yêu thương và dành cho tôi sự quan tâm sâu sắc Cảm ơn Chồng, người đã cùng chia sẻ, luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được song hành trên con đường tình yêu và sự nghiệp, là chỗ dựa vững chắc nhất của cuộc đời tôi Cảm ơn Kirin, Sóc – hai con yêu của Mẹ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2009

Trần Lê Bảo Hà

AEC Amniotic epithelial cells

CEA Cultured Epidermal Autograft

pH Hydrogen ion concentration

Apoptosis Sự chết tế bào được lập trình

thanh dành cho tế bào sừng

không chứa ion Ca2+ và Mg2+

người Keratinocyte Tế bào sừng

Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp dây chuyền

nhờ polymerase

ngăn thấm vi sinh vật của màng ối 12

Bảng 1.2 Tóm tắt các thử nghiệm lâm sàng sử dụng CEA trên thế giới 30

Bảng 3.1 Tóm tắt hiệu quả loại tế bào biểu mô HAM khi sử dụng

trypsin/EDTA và cạo 61

Bảng 3.2 Kết quả kiểm nghiệm màng collagen 64

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của màng collagen đến sự thay đổi pH của môi trường SFM 65

Bảng 3.4 Thông tin về các mẫu da đã thu nhận 69

Bảng 3.5 Số tế bào sống và % tế bào sống sau khi phân lập 73

Bảng 3.6 Sự tăng sinh của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất 77

Bảng 3.7 Kết quả đo mật độ quang đánh giá sự tăng trưởng tế bào sừng trên màng collagen 83

Đồ thị 3.1 Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất 78

Đồ thị 3.2 Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng trên màng collagen

thông qua kết quả đo mật độ quang 84

Hình 1.2 Sơ đồ mô tả cấu trúc của màng ối 4

Hình 1.3 Minh họa vai trò của các tế bào tách từ màng ối trong chữa tổn thương 9

Hình 1.4 Bé trai 3 tuổi bị bỏng 3% độ 2 tại mặt, sử dụng màng ối sau khi đã rửa sạch và sấy khô 14

Hình 1.5 Cấu trúc cơ bản của da người 15

Hình 1.6 Đơn vị tăng sinh biểu bì EPU 16

Hình 1.7 Các lớp tế bào sừng của biểu bì 18

Hình 1.8 Tế bào gốc biểu bì ở vùng sâu nhất và nông nhất trong da 20

Hình 1.9 Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa tế bào gốc biểu bì 22

Hình 1.10 Các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng tương ứng chương trình biệt hóa biểu bì 23

Hình 1.11 Sự phân bố của p63 (đỏ) và involucrin (xanh) trong biểu bì người bình thường 23

Hình 1.12 Protein Wnt hoạt hóa các tế bào gốc biểu bì (EpSC) bất hoạt thành các tế bào khuếch đại chuyển (TA) 25

Hình 1.13 Các tế bào sừng lan ra làm liền vết thương 26

Hình 1.14 Chỉ định của CEA 32

Hình 1.15 Mô hình minh họa các bước của CEA 32

Hình 2.3 Minh họa phương pháp nuôi cấy tế bào trên màng collagen

đã được trải trên đĩa lồng 50Hình 2.4 Vùng lấy da ghép 56 Hình 3.1 Lớp tế bào biểu mô nguyên vẹn của HAM 58 Hình 3.2 HAM nguyên (a), HAM được xử lý trypsin-EDTA

15 phút (b), 30 phút (c), 45 phút (d) và cạo để loại biểu mô 59 Hình 3.3 HAM đã được xử lý trypsin-EDTA 30 phút và cạo để

loại biểu mô 60 Hình 3.4 Kết quả nhuộm trichrom (a) và nhuộm PAS (b) của HAM

đã loại biểu mô 61 Hình 3.5 Lớp biểu bì và trung bì tách rời nhau sau khi ủ enzym 71 Hình 3.6 Mô học biểu bì đã tách rời (a), mô học trung bì đã tách rời (b), mô học

trung bì tách rời đã được thu nhận hoàn toàn tế bào lớp đáy (c) 72 Hình 3.7 Tế bào được nuôi sơ cấp 76 Hình 3.8 Tế bào sừng bám trên đĩa nuôi (a) và trên màng collagen (b)

sau 3 giờ cấy chuyền 82 Hình 3.9 Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen 85 Hình 3.10 Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không khí 86 Hình 3.11 Kết quả tạo nhiều lớp tế bào sau 4 ngày (a), 7 ngày (b), 10 ngày (c)

nâng lên bề mặt không khí 87

tăng nồng độ Ca2+

trong môi trường nuôi 89

Hình 3.14 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể p63 tấm tế bào sừng nhiều lớp được tạo ra trên màng collagen 91

Hình 3.15 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy có sự hình thành liên kết giữa tế bào và màng collagen 93

Hình 3.16 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy có sự hình thành liên kết giữa hai tế bào kế cận 94

Hình 3.17 Bộ nhiễm sắc thể tế bào người nữ sau nuôi cấy 95

Hình 3.18 Bộ nhiễm sắc thể tế bào người nam sau nuôi cấy 95

Hình 3.19 Kết quả RT-PCR các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng 96

Hình 3.20 Kết quả ghép tự thân tấm tế bào sừng nuôi cấy trên bệnh nhân 101

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nhu cầu điều trị bỏng, mất da, mất phần mềm do tai nạn giao thông, tai nạn lao động, loét do tiểu đường, do các bệnh lý tim mạch, các vết thương

do xạ trị… rất lớn Cho đến nay, ghép da tự thân vẫn là “tiêu chuẩn vàng” để tái tạo

bề mặt các vết thương Tuy nhiên, vùng da cho để ghép tự thân bị hạn chế trong các vết thương mất da rộng Điều này thúc đẩy phát triển các liệu pháp khác, trong đó

có liệu pháp ghép tấm tế bào nuôi cấy

Công nghệ nuôi cấy tế bào là công nghệ hiện đại trong điều trị bỏng, tổn thương mất da, điều trị thẩm mỹ Trên thế giới, công nghệ này liên tục được nghiên cứu để hoàn chỉnh về quy trình công nghệ, về môi trường nuôi cấy… Thông qua công nghệ nuôi cấy tế bào, nhiều nước trên thế giới đã đạt được những tiến bộ vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thương mất da, nhiều nạn nhân bỏng sâu và rộng trên 70% diện tích cơ thể đã được cứu sống cũng như giảm thiểu các di chứng nặng

nề do bỏng sâu để lại Đồng thời, nhiều vật liệu cũng được nghiên cứu để làm màng phủ tạm thời các vết thương mất da Với những ưu điểm như kháng viêm, kháng khuẩn, tính sinh miễn dịch thấp…, kể từ nghiên cứu đầu tiên của David vào năm

1910, màng ối đã được sử dụng rộng rãi trong chữa trị vết thương mất da Hơn nữa, màng ối còn có đặc điểm nổi bật là cấu tạo collagen của màng cơ bản tương tự màng cơ bản của da người

Do đó, việc kết hợp giữa màng collagen từ màng ối và tế bào sừng của người được nuôi cấy để tạo ra tấm tế bào sừng nhằm ứng dụng ghép tự thân là một giải pháp khả thi trong điều trị các tổn thương mất da và bỏng

Tại Việt nam đã có nhiều giải pháp điều trị các tổn thương mất da bằng các màng sinh học, trong đó có màng ối Thậm chí có nhiều tác giả còn đề xuất việc ứng dụng tế bào nuôi cấy trong việc điều trị Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có công trình khoa học nào về việc tạo vật liệu điều trị tổn thương mất da từ sự kết hợp

tế bào nuôi cấy và màng ối được công bố tại Việt nam

Vì vậy tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào

sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng dụng ghép tự thân điều trị các tổn thương mất da” nhằm đạt các mục tiêu sau:

1 Xây dựng được quy trình chế tạo màng collagen từ màng ối người ứng dụng làm giá thể cấy tế bào

2 Xây dựng được quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào sừng người

3 Tạo được tấm tế bào sừng nhiều lớp trên giá thể collagen từ màng ối người

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 MÀNG ỐI NGƯỜI

Màng ối là một màng mỏng, dai, trong suốt, bao bọc quanh xoang nước ối, bao quanh dây rốn từ điểm xuất phát ở nhau đến rốn thai nhi Màng ối có thể được tách khỏi màng đệm và bánh nhau dễ dàng ngay sau sanh Ngoài chức năng sản xuất nước ối, màng ối còn có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập của vi sinh vật trong thời kỳ bào thai [60]

1.1.1 Cấu tạo của màng ối

Về nguồn gốc, màng nhau phát triển từ mô ngoài phôi, vừa chứa thành phần của con (màng ối, màng đệm) và thành phần của mẹ (màng rụng) Cấu trúc màng đệm-màng ối trên tạo thành hàng rào bao bọc phôi [62]

Về cấu trúc, màng ối bao gồm một lớp đơn tế bào biểu mô, một lớp màng đáy và một lớp nền Màng ối không chứa mạch máu hay dây thần kinh Thay vào

đó, chất dinh dưỡng cần thiết được cung cấp trực tiếp cho màng ối nhờ sự khuếch tán của dịch ối và từ lớp màng rụng ở bên dưới

Độ dày trung bình của màng ối từ 0,02 – 0,4mm

Hình 1.1 Màng ối bọc quanh thai nhi [121]

Hình 1.2 Sơ đồ mô tả cấu trúc của màng ối [62]

Bên trong cùng, gần thai nhất là lớp đơn các tế bào biểu mô nằm trên màng đáy

Lớp đặc ở bên dưới màng đáy tạo thành bộ khung dạng sợi chính cho màng

ối Collagen của lớp đặc do các tế bào trung mô nằm ở lớp nguyên bào sợi tiết ra Trong đó, chủ yếu là collagen loại I và loại III tạo thành các bó song song, duy trì tính cơ học của màng ối Collagen loại V và loại VI giúp kết nối hai loại collagen trên với màng đáy

Nằm ngay trên màng đệm là lớp trung gian hay lớp xốp, chứa nhiều proteoglycan, glycoprotein, collagen loại III tạo thành cấu trúc xốp [111] Vì lớp xốp này liên kết lỏng lẻo với màng đệm nên màng ối có thể dễ dàng tách khỏi màng đệm [62]

Dịch ối

Màng rụng (mẹ)

Thành phần ngoại bào Lớp

Lớp đặc Màng đáy Biểu mô

Màng đáy

1.1.2 Các đặc điểm sinh học của màng ối giúp cho màng ối có tính ứng dụng cao trong kỹ nghệ mô (tissue engineering)

1.1.2.1 Đặc điểm kháng viêm, kháng khuẩn

Trong một số trường hợp, các phản ứng viêm là tốt do chúng khởi động quá trình hàn gắn vết thương Tuy nhiên, các phản ứng này cũng thường gây ra các hậu quả không mong muốn Phản ứng chống lại vật thể lạ kích thích đại thực bào và các

tế bào khổng lồ tiết ra những cytokinee, thu hút nguyên bào sợi, gây nên sự xơ hóa (fibrosis) Các nguyên bào sợi được hoạt hóa bởi nhân tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF - Transforming growth factor) [82]

Màng ối làm giảm tiết TGF-β cũng như các thụ thể của TGF-β trên nguyên bào sợi và do đó làm giảm chứng xơ hóa nói trên Không những vậy, khung nâng

đỡ (scaffold) từ màng ối có thể điều khiển quá trình hàn gắn vết thương bằng cách kích thích tái cấu trúc mô hơn là kích thích hình thành mô sẹo [143]

Đã có nghiên cứu chứng minh màng ối có tác dụng kháng viêm Khuôn nền của màng ối ức chế biểu hiện của một số cytokinee tiền viêm như IL-1α và IL-1β [132] Một loại protein khác là MMP (Matrix metalloproteinase) được biểu hiện trên các tế bào đa nhân và đại thực bào cũng bị ức chế bởi màng ối [66] Hyaluronic acid, một glycosaminoglycan có khối lượng phân tử lớn, hiện diện rất nhiều trên màng ối có thể gắn với CD44 Đây là yếu tố đánh dấu (marker) biểu hiện trên các tế bào gây viêm và đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn của các tế bào gây viêm (ví dụ: tế bào lympho) với chất nền của màng ối [65]

β-defensin là nhóm các peptide kháng khuẩn do các tế bào biểu mô và bạch cầu tiết ra, đóng vai trò trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh [86] Các tế bào biểu mô màng ối cũng có khả năng sản xuất β-defensin [81] Ngoài ra, màng ối còn tiết ra hai chất ức chế elastase khối lượng phân tử thấp là SLPI (secretory leukocyte proteinase inhibitor) và elafin [23] Ngoài đặc tính kháng viêm, cả SLPI và elafin đều có hoạt tính kháng khuẩn và tham gia vào hệ thống miễn dịch bẩm sinh giúp

bảo vệ các bề mặt không bị nhiễm Việc xử lý màng ối với cả hai chất đối kháng thụ thể lactoferrin và IL-1 làm cho màng ối có khả năng kháng khuẩn và kháng viêm

1.1.2.2 Đặc điểm kháng tạo mạch

Màng ối có hoạt tính kháng tạo mạch nhờ sự hiện diện của các hóa chất kháng tạo mạch trong các tế bào biểu mô và trung mô màng ối như thrombospondin-1, IL-1, collagen XVIII, IL-10, các nhân tố ức chế mô metalloprotease (TIMP-1, -2, -3, -4) Màng đáy của màng ối giàu PEDF (pigment epithelium-derived factor), một yếu tố kháng tạo mạch mới được phát hiện [10]

1.1.2.3 Đặc điểm miễn dịch

Màng ối có tính sinh miễn dịch thấp

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch trong suốt quá trình mang thai là bước quan trọng đầu tiên để chứng minh tính sinh miễn dịch của màng ối Điều thần kỳ của tạo hóa thể hiện trong quá trình mang thai ADN của hợp tử có một nửa từ cha, do đó thai có các kháng nguyên bán đồng sinh đối với cơ thể mẹ Tuy nhiên, hợp tử hay thai không hề bị thải loại Có thể có vài cơ chế liên quan đến việc bảo vệ thai không

bị tác động bởi hệ miễn dịch của mẹ Các cơ chế ức chế không đặc hiệu có tính hệ thống cũng như tại chỗ đã được mô tả Chúng làm giảm đáp ứng miễn dịch mà không gây tổn hại đến hệ miễn dịch của người mẹ Một hàng rào nhau thai ngăn cản

sự lưu thông của các tế bào cũng như các kháng thể gây độc tế bào trước khi chúng

đi vào vòng tuần hoàn của thai Nhân tố chính ngăn chặn sự thải loại của dưỡng bào

là HLA-G (Human leukocyte antigen) Trái ngược với các gen HLA-A và HLA-B lớp I bị ức chế ở dưỡng bào, HLA-G biểu hiện trên các sợi lông nhung ngoài dưỡng bào cũng như trên các tế bào của màng ối và dịch ối Vai trò của HLA-A, HLA-B, HLA-C là gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bằng cách trình diện kháng nguyên cho các tế bào T Ngược lại, HLA-G lại liên quan đến sự chịu đựng miễn dịch do chúng làm phối tử (ligand) cho các thụ thể ức chế hiện diện trên tế bào diệt tự nhiên

và đại thực bào [27], [108] Các tế bào biểu mô màng ối không biểu hiện các kháng nguyên HLA-A, -B, -C và -DR nhưng biểu hiện HLA-G trên bề mặt Do đó, sự thải

loại cấp tính sẽ không xảy ra sau khi ghép Mặc dù còn nhiều tranh cãi nhưng người

ta vẫn tin rằng tính sinh miễn dịch của màng ối thấp [68]

Hơn thế nữa, màng ối được bảo quản lạnh sâu có tính sinh miễn dịch thấp hơn so với màng ối tươi vì các tế bào sống giảm đến 90% Điều này giúp các nhà nghiên cứu sử dụng màng ối bảo quản lạnh sâu hơn là màng ối tươi [88]

1.1.2.4 Đặc điểm gây chết tế bào được lập trình (pro-apoptosis)

Màng ối tiết một số chất hoạt động như là tác nhân gây chết tế bào được lập

nó phải chịu áp lực nhiều hơn so với màng đệm Do đó, khả năng chống chịu áp lực

của màng thai chủ yếu phụ thuộc vào màng ối Do tầm quan trọng như vậy in vivo

nên màng thai, đặc biệt là màng ối, là tâm điểm của nhiều nghiên cứu về đặc điểm

cơ học in vitro

Màng ối có tính mềm dẻo và nhớt Đây là đặc tính quan trọng của khung nâng đỡ trong hầu hết các mô như mô mạch máu (nếu khung nâng đỡ cứng, thiếu tính mềm dẻo thì sẽ kích thích áo trong của mạch tăng sản và làm nghẽn mạch) [68], [88] Đại lượng đo độ mềm dẻo là modul Young Đây là đại lượng được sử dụng nhiều trong vật lý cơ, được định nghĩa là tỉ lệ ứng suất trên sức căng Modul

Young của màng ối 26 đến 36 tuần là 3,6 MPa, màng ối 36-40 tuần là 2,29 MPa Sự thay đổi này có thể do lượng collagen hoặc elastin bên trong [18], [64], [94]

1.1.3 Một số ứng dụng của màng ối

1.1.3.1 Thu nhận tế bào gốc

Các tế bào biểu mô màng ối - AEC (Amniotic epithelial cells) là một nguồn

tế bào gốc đầy tiềm năng cho kỹ nghệ mô Tương tự như ba lớp mầm của phôi là ngoại phôi bì, trung phôi bì và nội phôi bì, biểu mô màng ối cũng tách khỏi lá phôi ngoài (epiblast) trước quá trình tạo phôi ba lá [110] Điều này cho thấy biểu mô màng ối có khả năng duy trì một nguồn tế bào gốc trong suốt quá trình mang thai [62] Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy AEC biểu hiện các yếu tố đánh dấu bề mặt tương tự với tế bào gốc phôi là SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 cũng như biểu hiện các nhân tố phiên mã chuyên biệt tế bào gốc đa năng là Oct-4 và Nanog [101], [102] Tính đa tiềm năng của AEC được kiểm chứng thông qua việc

tạo các thể khảm (chimera) dị sinh từ AEC và tế bào gốc phôi chuột in vitro [140]

Thể khảm này tăng sinh thành các tế bào của cả ba lớp mầm Nhiều thí nghiệm khác

cũng đã chứng minh khả năng biệt hóa in vitro của các AEC thành các tế bào ở cả 3

lớp mầm, đó là tế bào tim (dòng trung bì), nơron và tế bào thần kinh đệm (dòng ngoại bì), tế bào tụy và tế bào gan (dòng nội bì) [74], [101] Tất cả các tế bào trên đều dương tính với yếu tố đánh dấu chuyên biệt Ví dụ, các AEC sản xuất và tiết ra albumin, dự trữ glycogen tương tự như dữ liệu biểu hiện gen của các tế bào gan khác [139]

Tạo dòng là khả năng hình thành một dòng tế bào từ một tế bào đơn, đây là chức năng quan trọng thể hiện tính tự làm mới của tế bào gốc Các AEC có khả năng tạo dòng và khả năng này được so sánh với các dòng tế bào gốc phôi người hESC (Human embryonic stem cell) [74] Tính sinh khối u là một hạn chế đáng kể của các tế bào gốc phôi người đa tiềm năng trong kỹ nghệ mô Trong khi đó, mặc

dù cũng là các tế bào đa tiềm năng nhưng các AEC không tạo thành khối u khi cấy vào tinh hoàn chuột SCID [74], [104] Điều này đã được chứng minh trong các

nghiên cứu sử dụng AEC điều trị tổn thương thị giác [133], [143], [146] Trong cơ

thể, hiện tượng ức chế khối u có thể do telomerase của các AEC thiếu hoạt tính

[101], [105] Người ta cũng chứng minh các AEC tự nhiên biểu hiện loại kháng

nguyên bạch cầu người là HLA-G Loại kháng nguyên này không đa hình [33]

AEC không có các kháng nguyên đa hình như A, B (lớp IA) và

HLA-DR (lớp II) [126] Những khám phá này cho thấy các AEC có khả năng trơ, làm

giảm nguy cơ thải loại hoặc đáp ứng miễn dịch sau khi cấy ghép Một ưu điểm quan

trọng khác của các AEC so với hESC là các tế bào này có khả năng tăng sinh mà

không cần một loại tế bào khác làm lớp nuôi dưỡng (feeder layer) Các AEC tự tạo

lớp nuôi dưỡng cho riêng chúng với vài tế bào trãi rộng trên bề mặt đĩa nuôi Lớp

nuôi dưỡng tự thân này hỗ trợ AEC bám dính, tiết ra các nhân tố duy trì AEC ở tình

trạng không biệt hóa [101]

Hình 1.3 Minh họa vai trò của các tế bào tách từ màng ối

trong chữa tổn thương [149]

Ưu điểm khác của AEC là số lượng tế bào lớn (hơn một trăm triệu AEC trên

1 màng ối) [101] Những tế bào này lại có khả năng tăng sinh rất nhanh dưới sự

Tiểu đường loại 1

Tiểu đảo, tụy Ghép bắt cầu trong

viêm gan, xơ gan, tổn thương

Tế bào gan, gan

hiện diện của một vài nhân tố tăng trưởng như EGF [142] Như vậy, một số lượng lớn tế bào gốc có thể thu nhận khi sử dụng màng ối Hơn nữa, màng ối là sản phẩm thải sau sinh nên việc sử dụng màng ối không ảnh hưởng đến vấn đề y đức

1.1.3.2 Ứng dụng màng ối làm khung nâng đỡ trong kỹ nghệ mô

Một thành phần quan trọng của kỹ nghệ mô là khung nâng đỡ giúp các tế bào

và mô tăng trưởng Các khung nâng đỡ này phải sáp nhập với mô chủ và cung cấp một môi trường lý tưởng cho tế bào tăng trưởng và biệt hóa Phần lớn vật liệu tạo khung nâng đỡ có nguồn gốc tự nhiên từ mô động vật có vú Với cấu trúc đặc biệt

và hoạt tính sinh học, màng ối trở thành ứng viên lý tưởng, một nguồn có tiềm năng làm vật liệu khung nâng đỡ cho kỹ nghệ mô Thành phần nền ngoại bào của màng đáy màng ối tạo ra một khung tự nhiên cho cấy tế bào trong kỹ nghệ mô Ngoài ra, màng ối có các đặc tính sinh học khác quan trọng cho kỹ nghệ mô như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng xơ hóa, kháng sẹo và tính sinh miễn dịch thấp…

Một yêu cầu quan trọng trong lựa chọn khung nâng đỡ là tính tương hợp sinh học [15] Ngoài ra, một số đặc tính khác cũng cần được lưu ý, đó là tính thấm, tính

ổn định, độ đàn hồi, độ mềm dẻo, khả năng tạo hình và khả năng phân hủy sinh học với tốc độ bằng với tốc độ thay thế của mô [157] Bên cạnh đó, khung nâng đỡ sẽ lí tưởng hơn nếu tế bào có thể bám dính và giải phóng các nhân tố tăng trưởng [150]

Khả năng bám dính của tế bào lên khung nâng đỡ chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần nền ngoại bào (ECM – extracellular matrix) của khung nâng đỡ đó Sự hiện diện hay vắng mặt một số phân tử ECM như collagen, laminin, fibronectin, và vitronectin sẽ gây ảnh hưởng lớn đến sự bám dính, tăng trưởng, di cư của các tế bào nằm trên Các phân tử ECM này đóng vai trò phối tử bám dính, cho phép truyền tín hiệu thông qua quá trình tương tác với các thụ thể bề mặt tế bào Do vậy, tế bào phụ thuộc rất nhiều vào những đặc điểm của ECM như thành phần, độ cứng cơ học, tổ chức không gian [62]

Các thụ thể xuyên màng trên bề mặt của tế bào tương tác với ECM chủ yếu

là integrin Integrin có một vùng ngoại bào gắn lên ECM và một vùng nội bào gắn

với bộ xương của tế bào Sau khi gắn với ECM, integrin tập trung lại thành những

vi vùng trên màng tế bào, gọi là những bám dính tập trung [14] Tại đây, integrin tương tác với nhiều phân tử cấu trúc và tín hiệu đặc hiệu Một số protein như talin, filamin, paxillin, vinculin, integrin làm tác nhân liên kết giữa các integrin và actin

bộ xương tế bào Tiếp theo đó, các sợi actin này kết nối với màng nhân, màng các bào quan và nhiều enzymeee khác nhau Do đó, integrin ảnh hưởng lớn tới các quá trình nội bào quan trọng như vận chuyển (nhập bào và xuất bào), tăng sinh, biệt hóa,

và chết được lập trình [9], [104]

Màng ối là một loại khung nâng đỡ có chứa ECM do các AEC tiết ra gồm collagen loại III, loại IV và các glycoprotein (laminin, nidogen, fibronectin) tạo thành màng đáy [62] Bên cạnh đó, lớp xốp cũng chứa những proteoglycans, glycoproteins và collagen loại III [111]

Màng ối có thể được sử dụng dưới dạng nguyên thủy hoặc đã loại bỏ biểu

C và cạo sạch tế bào dưới kính hiển vi Một yêu cầu quan trọng là phải loại bỏ hoàn toàn lớp tế bào biểu mô nhưng vẫn giữ lại các thành phần cầu trúc khung nâng đỡ của màng ối, có thể sử dụng chất tẩy SDS (sodium dodecyl sulfate) cho yêu cầu này [144]

Nếu sử dụng màng ối tươi để cấy ghép cho người thì cần một quá trình xử lí

và khử trùng đặc biệt để đảm bảo chất lượng của màng ối Có nhiều phương pháp bảo quản màng ối như trữ lạnh (4oC), đông khô, khử trùng bằng tia γ, bảo quản bằng glycerol và làm lạnh sâu Ảnh hưởng của các phương pháp này lên sức sống của tế bào và các nhân tố tăng trưởng đã được kiểm chứng [62] Bảo quản trong

(dimethylsulphoxide) ở -80oC cho phép tế bào sống trên màng ối 50% trong vài

[87] Nhìn chung, sức sống của tế bào màng ối phụ thuộc vào môi trường, nhiệt độ

và quá trình bảo quản Khử trùng bằng tia γ ảnh hưởng không đáng kể lên các nhân

tố tăng trưởng [20]

Ngoài ra, khả năng ngăn thấm vi sinh vật của màng ối không thay đổi với các liều chiếu xạ khác nhau [121]

Bảng 1.1 Hiệu quả của các liều chiếu xạ gamma khác nhau lên khả năng

ngăn thấm vi sinh vật của màng ối [121]

Dòng vi khuẩn Loại Liều (kGy)

0 25 36 50

+ = Ngăn thấm ; − = Thấm

Như vậy, màng ối chứa rất nhiều các nhân tố tăng trưởng như EGF, KGF, HGF, bFGF, TNF-α, NGF, BDNF tập chung chủ yếu ở lớp biểu mô [75], [84], [146] Do đó, biểu mô màng ối chứa các cytokine đóng vai trò cốt yếu trong ổ tế bào tiền thân [59] Tuy nhiên, sự hiện diện của lớp biểu mô màng ối ban đầu có thể ngăn cản sự phát triển đồng nhất của mảnh mô được nuôi cấy trên màng và ngăn

cản sự tạo thành các bám dính hemidesmosome [24] Do đó, việc chọn lựa loại màng ối sử dụng (nguyên hay trần) phụ thuộc vào tế bào hay mô sẽ ứng dụng

1.1.3.3 Ứng dụng màng ối trong điều trị tổn thương biểu mô giác mạc

Hiện nay, màng ối người được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng để tái cấu trúc

bề mặt biểu mô giác mạc, điều trị tổn thương biểu mô, bỏng hóa chất, suy giảm một phần các tế bào rìa, hội chứng Stevens-Johnson Màng ối được loại bỏ hoàn toàn lớp tế bào biểu mô Sau đó, các tế bào vùng rìa giác mạc hoặc tế bào niêm mạc má được phân lập và nuôi cấy trên màng ối trần để ứng dụng ghép [13], [30], [83], [143], [144], [145]

Gần đây, năm 2008, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu, thử nghiệm màng ối có nuôi cấy tế bào vùng rìa giác mạc nhằm điều trị các bệnh lý giác mạc Kết quả bước đầu cho thấy màng ối có hiệu quả trong tái tạo mô trong điều trị các tổn thương giác mạc

1.1.3.4 Ứng dụng màng ối trong điều trị tổn thương mất da

Y văn đã ghi nhận có nhiều nghiên cứu ứng dụng màng ối trong điều trị tổn thương mất da

Màng bọc thai bao gồm màng ối và màng đệm đã được sử dụng trong phẫu thuật từ năm 1910 bởi Davis trên da bị loét và bỏng

Sau đó, nhiều nghiên cứu đã sử dụng màng ối như màng sinh học phủ tạm thời vết bỏng với bệnh nhân ở các độ tuổi khác nhau và mức độ bỏng khác nhau Kết quả cho thấy màng ối thúc đẩy nhanh sự tái tạo biểu mô, sự hình thành mô hạt, làm giảm sự hình thành sẹo lồi, giảm đau, giảm số lượng vi khuẩn tại vết thương, sử dụng màng ối ít phức tạp hơn các vật phủ da tổng hợp Màng ối liên kết chặt với bề mặt vết thương và khô đi nhanh chóng hình thành một lớp mày cứng ngăn chặn sự thoát hơi nước, giảm đau và ngăn cản sự xâm nhập của vi khuẩn từ bên ngoài [12], [75], [93], [100]

Tại Việt Nam, từ năm 1968, các bác sĩ tại Bệnh viện Việt Tiệp - Hải Phòng, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh Viện Saint Paul Hà Nội đã dùng màng ối điều trị bệnh nhân bỏng, bệnh nhân có vết thương mất da hoặc tại vùng bào da mỏng để ghép da, giúp cứu sống được nhiều bệnh nhân mà không gây một phản ứng xấu nào cho cơ thể người bệnh

Năm 2000, các bác sĩ đã sử dụng màng ối đông khô, khử trùng bằng bức xạ gamma để thử nghiệm cho các bệnh nhân bị mất da tại Trung tâm Chấn thương Chỉnh hình Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả thu nhận cho thấy màng ối đông khô thật sự là loại vật liệu sinh học che phủ cho vết thương mất da hiệu quả

Hình 1.4 Bé trai 3 tuổi bị bỏng 3% độ 2 tại mặt, sử dụng màng ối sau khi đã rửa sạch và sấy khô (a và b) màng ối được đưa vào vết thương, (c và d) sự bám dính

lí tưởng của màng ối (e) phủ gạc chứa thuốc mỡ Poly/Myco nhằm chống cho màng ối khỏi bong ra (f) hàn gắn vết thương 3 ngày sau bỏng [95]

Đến nay, màng ối đã được sử dụng để điều trị cho các bệnh nhân bị bỏng và tổn thương mất da Hàng năm, chỉ riêng Ngân hàng mô, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, đã cung cấp khoảng 6000 đơn vị màng ối cho lâm sàng (10cm x 10cm/ đơn vị)

1.2 SINH HỌC TẾ BÀO SỪNG

1.2.1 Lớp biểu bì của da - cấu tạo và chức năng

1.2.1.1 Cấu tạo

biểu bì và trung bì

Hình 1.5 Cấu trúc cơ bản của da người [130]

Lớp biểu bì là lớp ngoài cùng, dày từ 0,07 mm đến 1,8 mm Từ trong ra ngoài, biểu bì được phân thành bốn lớp: lớp đáy, lớp sợi, lớp hạt, lớp sừng Các lớp được phân biệt dựa vào các đặc điểm hình thái của các tế bào sừng đang trưởng thành

Màng đáy

Biểu bì được cấu tạo bởi các cột có chiều rộng khoảng 10 tế bào kéo từ lớp đáy đến lớp vảy sừng Các cột này được gọi là đơn vị tăng sinh biểu bì (Epidermal proliferative unit - EPU) Đơn vị tăng sinh biểu bì được duy trì nhờ các tế bào sừng

ở lớp đáy biểu bì Điều này chứng tỏ trong lớp đáy có tế bào gốc hiện diện [33], [56], [89], [135]

Ngoài ra, lớp biểu bì còn chứa các tế bào Merkel, tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans…

Màng đáy nằm ngay bên dưới lớp biểu bì Màng đáy là ranh giới giữa lớp biểu bì và trung bì, có hình thể uốn lượn Thành phần của màng đáy gồm các chất kháng nguyên bullous pemphigoid (một loại glycoprotein), chất laminin, collagen loại IV và VII

Hình 1.6 Đơn vị tăng sinh biểu bì EPU [33]

Lớp đáy Lớp sợi Lớp hạt Lớp sừng

1.2.1.2 Chức năng

Lớp biểu bì tạo thành một hàng rào sinh học có chức năng:

- Bảo vệ cơ thể chống các tác động vật lý, sinh học, hóa học có hại của môi trường bên ngoài như tia UV, vi sinh vật, chất độc Các tế bào hắc sắc tố tạo màu của da và bảo vệ da khỏi tia UV của ánh nắng mặt trời Sau khi được các tế bào hắc sắc tố sản xuất, các gói hắc sắc tố (melanosome) chuyển đến và giúp bảo vệ ADN của các tế bào sừng

- Ngăn ngừa mất nước: nếu mất lớp biểu bì, sự mất nước qua da sẽ tăng

1.2.2 Đặc điểm tế bào sừng

Tế bào sừng chiếm 90% tổng số tế bào của lớp biểu bì [11] Các tế bào sừng sản xuất chất sừng, là một protein sợi cứng [89] Đây là protein cấu trúc chính của biểu bì, cung cấp nhiều đặc tính bảo vệ của da

Tế bào sừng ở các lớp khác nhau có tính chất khác nhau

Các tế bào sừng lớp đáy chứa các cấu trúc tương bào và các bào quan như ty thể, lưới nội chất, thể Golgi, không bào chứa các hạt sắc tố Các tế bào sừng này có khả năng phân chia Các tế bào con sẽ rời khỏi màng đáy, mất khả năng tăng sinh và bắt đầu quá trình biệt hóa Thay đổi đầu tiên xảy ra là củng cố mạng lưới sợi tơ sừng để làm tăng độ bền của mỗi tế bào Các tế bào tổng hợp lượng lớn chất sừng tập trung thành các sợi tơ sừng và thành các bó tơ sừng đàn hồi hơn Các sợi tơ sừng neo với các thể liên kết (desmosome), thể bán liên kết (hemidesmosome) Các sợi tơ

sừng này được cấu tạo bằng các chất sừng K5, K14, K19 [89]

Lớp sợi gồm các tế bào sừng có nhiều thể liên kết tạo độ bền, trong bào tương chứa các bào quan mới là các thể lá mỏng Các thể lá mỏng này chứa đầy

lipid Các tế bào sừng lớp sợi tổng hợp các cặp chất sừng mới K1/K10

Các tế bào sừng lớp hạt chứa các protein involucrin, loricrin keratolinin và lipid bao quanh hạt

Vùng chuyển tiếp là vùng ranh giới giữa biểu bì sống và chết Trong vùng này, các nội bào quan bị protease và nuclease phá hủy

Kết thúc quá trình biệt hóa trong lớp sừng, tế bào gốc biểu bì trở thành tế bào không nhân (anucleate cell), còn gọi là tế bào vảy Các tế bào vảy gồm hai cấu trúc chính: một mạng lưới các bó sợi tơ sừng ổn định nối disulfide được protein nối đồng trị bao bọc và lipid, tạo nên hàng rào ngăn cách môi trường bên ngoài với lớp

tế bào sống bên dưới da [120]

Hình 1.7 Các lớp tế bào sừng của biểu bì [89]

Tế bào lớp đáy

Tế bào lớp sợi

Tế bào lớp hạt

Tế bào

Phóng thích thể lá mỏng Thể lá mỏng

Các tế bào sừng liên kết chặt chẽ với nhau thông qua các thể liên kết Tuy nhiên, các liên kết này cũng dễ dàng bị phá vỡ và cũng tự tái tạo để các tế bào sừng mới sản sinh có thể di chuyển ra các lớp phía ngoài [73]

Các tế bào của lớp đáy được neo trên màng đáy (hay màng đáy) nhờ các thể bán liên kết thông qua các integrin Tế bào lớp đáy biểu hiện ba integrin 1 là 51

(thụ thể fibronectin), 21 (liên kết collagen), 31 (thụ thể laminin) Các integrin giúp cho tế bào đáy bám dính vào màng đáy và đáp ứng với các yếu tố vi ổ, các integrin này là các yếu tố điều hòa quá trình biệt hóa cuối cùng và di cư lên trên Quá trình biệt hóa cuối cùng và di chuyển lên trên của các tế bào đáy liên quan đến quá trình giảm điều hòa của integrin 1, kết quả là làm giảm khả năng bám dính với màng đáy [47], [69], [78], [91]

Quá trình từ lúc hình thành tế bào sừng lớp đáy đến khi rụng thành vảy kéo dài khoảng 45 – 75 ngày Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào môi trường làm lành mô thích hợp gồm các tín hiệu tiếp xúc để tế bào sao chép, di chuyển và các kích thích hóa học của các nhân tố tăng trưởng Nhiều tín hiệu xuất phát từ các nhân tố của lớp trung bì, đặc biệt là protein fibronectin nền, và các hợp chất nền như hyaluronic acid

1.2.3 Tế bào gốc biểu bì

Biểu bì là một trong những mô có ổ tế bào gốc hiện diện Bởi vì trong suốt đời sống, cơ thể cần phải tạo ra tế bào mới để thay thế cho lớp vảy bong ra khỏi bề mặt da liên tục [98]

Tế bào gốc biểu bì là một dạng tế bào sừng có tính gốc, chúng có khả năng

tự đổi mới không có giới hạn và tạo ra những tế bào con có khả năng biệt hóa cuối cùng Trong lớp đáy, 10% là tế bào gốc biểu bì (epidermal stem cell), 50% là các tế bào khuếch đại chuyển ở thời điểm giao thời của sinh trưởng (transient amplifying cell), 40% là các tế bào ở hậu kỳ của gián phân (postmitotic cell)

1.2.3.1 Sự phân bố của tế bào gốc biểu bì

Sự phân bố của các tế bào gốc trong biểu bì không phải là ngẫu nhiên Các tế bào gốc tồn tại ở ba vị trí: hành lông, lớp đáy và tuyến bã nhờn [44], [95]

Ở nang lông, những tế bào gốc nằm bên ngoài chân lông tại vùng hành lông hoặc ở vị trí thấp hơn [38], [47]

Ở hầu hết các vị trí trong cơ thể, những tế bào gốc biểu bì được tìm thấy ở vùng nông nhất của biểu bì (trên nhú trung bì) Tuy nhiên, ở lớp biểu bì của lòng bàn tay và gan bàn chân, các tế bào này được tìm thấy ở chóp đỉnh mạng lưới sâu, nơi mà lớp cơ bản được coi là nằm sâu nhất trong da [33]

Hình 1.8 Tế bào gốc biểu bì ở vùng sâu nhất và nông nhất trong da [33]

1.2.3.2 Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa của tế bào gốc biểu bì

Trong quá trình biệt hóa, tế bào gốc biểu bì sẽ sinh ra các tế bào tế bào gốc con

và những tế bào khác Trong đó tế bào khuếch đại chuyển là dạng trung gian của tế

bào gốc và tế bào biệt hóa cuối cùng

Tế bào gốc biểu bì

Tế bào gốc biểu bì có các đặc tính: (i) chu kỳ chậm in vivo; (ii) có khả năng tự

làm mới và có vai trò duy trì lâu dài của mô; (iii) có thể được hoạt hóa do tổn

thương hoặc các điều kiện nuôi cấy in vitro để tăng sinh và tái tạo mô; (iv) có tiềm

năng tăng sinh cao

Lớp sừng

Lớp sợi Lớp hạt

Lớp đáy

Các tế bào gốc biểu bì là những tế bào có chu kỳ chậm hay tế bào giữ chất

H] thymidine hoặc bromodeoxyuridine (BrdUrd) Thuộc tính chu kỳ chậm có tầm quan trọng đặc biệt trong sinh học nhờ bảo tồn tiềm năng tăng sinh của tế bào và hạn chế tối thiểu các sai sót sao chép ADN [22], [89], [122]

Các tế bào gốc biểu bì có sự phân chia bất đối xứng sinh ra hai tế bào con, một

tế bào giống hệt tế bào gốc đang phân chia và một tế bào khuếch đại chuyển Sự phân chia bất đối xứng của tế bào do sự phân tách không đều của các yếu tố quyết định số phận tế bào (các protein hoặc mARN) cho mỗi tế bào con hoặc do sự đáp ứng chọn lọc của mỗi tế bào con với gradient các phân tử tín hiệu hiện diện trong môi trường Sự phân chia này tạo ra một quần thể không cân xứng cho phép biểu bì đáp ứng các nhu cầu sinh lý khác nhau của mô khi bị nguy hiểm do tổn thương Tuy nhiên, sự phân chia cũng có thể tạo ra hai tế bào gốc con hoặc hai tế bào đều có khả năng biệt hóa [90]

Các tế bào gốc biểu bì tương tác với các tế bào khác thông qua các con đường tín hiệu để điều hòa sự tự làm mới và tăng sinh trong suốt quá trình phân bào bất đối xứng như con đường Notch, con đường Wnt, con đường Hedgehog [32], [41]

Tế bào khuếch đại chuyển

Các tế bào khuếch đại chuyển là các tế bào sừng đang tăng sinh, có khả năng

tự làm mới bị giới hạn (khoảng 3 lần phân chia), có khả năng rút khỏi chu kỳ tế bào

và chịu sự biệt hóa cuối cùng [47] Chức năng chính của các tế bào khuếch đại chuyển là làm tăng số lượng tế bào biệt hóa từ một tế bào gốc ban đầu Các tế bào khuếch đại chuyển cho phép các tế bào gốc biểu bì ở trạng thái im lặng để hạn chế tối thiểu đột biến Do đó, các tế bào khuếch đại chuyển là con cháu của các tế bào gốc trong biểu bì và có vai trò làm mới mô dưới các điều kiện bình thường cũng như sửa chữa mô sau tổn thương [44]

Tế bào biệt hóa cuối cùng

Tế bào biệt hóa cuối cùng là những tế bào không có khả năng tự làm mới và có khả năng biệt hóa cao nhất Ví dụ như tế bào vảy, lông, tóc không có khả năng tăng sinh và đã có chức năng chuyên biệt

Hình 1.9 Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa tế bào gốc biểu bì [44]

Các tế bào có những yếu tố đánh dấu (marker) Trong biểu bì, các yếu tố đánh dấu này tương ứng với sự thay đổi mức biểu hiện chất sừng trong quá trình biệt hóa của tế bào từ lớp đáy

Bằng phương pháp nhuộm miễn dịch, người ta xác định vị trí của p63 Sự bắt

màu mạnh giới hạn trong nhân tế bào lớp đáy hay ngay trên lớp đáy của biểu bì

Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh p63 là một yếu tố đánh dấu của tế bào gốc

thành dương tính p63 khi được cấy chuyền lần hai [58], [116], [117]

Tế bào gốc

biểu bì

Tế bào khuếch đại chuyển

Tế bào con tự làm mới

Các tế bào biểu

bì đã biệt hóa

Tế bào con tự làm mới

Tế bào khuếch đại chuyển

Hình 1.10 Các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng tương ứng chương trình

biệt hóa biểu bì [32]

Sự biểu hiện của chất sừng (K) thay đổi trong suốt quá trình biệt hóa của

biểu bì Những tế bào sừng ở lớp đáy biểu hiện K5 và K14 Khi rời khỏi lớp đáy,

các tế bào sừng tổng hợp K1 và K10 Khi di chuyển đến lớp hạt, các tế bào sừng

tổng hợp các protein quan trọng cho giai đoạn cuối cùng của quá trình biệt hóa biểu

bì gồm profilagrin, loricrin, involucrin, corfinin [46], [48]

Hình 1.11 Sự phân bố của p63 (đỏ) và involucrin (xanh)

trong biểu bì người bình thường [117]

Tế bào gốc

Tự làm mới

Tế bào khuếch đại chuyển

Biệt hóa Tế bào đang biệt

hóa ở hậu kỳ của gián phân

Tế bào lớp sợi

Tế bào lớp hạt

Tế bào lớp vảy sừng

1.2.4 Vai trò của tế bào sừng trong tái tạo biểu bì da

Các cơ thể sống cần phải có một cơ chế để có thể duy trì tính toàn vẹn về chức năng của các mô Cơ chế đó là sự tái tạo Sự tái tạo sẽ giúp duy trì hoặc hồi phục cấu trúc và chức năng ban đầu của một mô Một vài mô như là máu và biểu

mô sẽ tự thay mới liên tục Quá trình này được gọi là sự tái tạo duy trì hay sự tái tạo nội cân bằng Các mô này và nhiều mô khác cũng tái tạo trên một quy mô lớn hơn khi bị tổn thương, gọi là sự tái tạo được cảm ứng bởi tổn thương

1.2.4.1 Tái tạo duy trì

Lớp đáy của biểu bì gồm các tế bào gốc biểu bì, các tế bào khuếch đại chuyển và các tế bào hậu kỳ gián phân để trải qua sự biệt hóa cuối cùng Sự tái tạo biểu bì được duy trì nhờ các tế bào gốc biểu bì Các tế bào khuếch đại chuyển từ tế bào gốc biểu bì tách khỏi ổ của chúng trong màng đáy, tăng sinh và di chuyển lên trên, trải qua sự biệt hóa thành lớp vảy sừng, chết [115]

Sự lựa chọn trạng thái bất hoạt và hoạt động của các tế bào gốc biểu bì liên quan đến con đường truyền tín hiệu Wnt kết thúc với Tcf/Lef1 [151] Gen Wnt3 được biểu hiện trong nang lông đang phát triển và trưởng thành Disheveled 2 (Dvl2) là thụ thể của Wnt3 được biểu hiện trong những tế bào tiền thân của hành lông Trong giai đoạn nang lông ngừng phát triển, Lef-1 ngăn chặn hoạt động của các tế bào gốc biểu bì, bởi vì GSK-3 hoạt hóa sẽ ngăn chặn -catenin tách ra khỏi protein APC mà phân hủy -catenin Trong giai đoạn đầu của chu trình tóc, Wnt hoạt hóa tế bào gốc biểu bì bằng cách ức chế enzymeee GSK-3 thông qua Dvl2, cho phép -catenin tách ra khỏi APC và tạo phức với Lef-1 để hoạt hóa các gene giúp giải phóng các tế bào gốc biểu bì khỏi tình trạng im lặng

Hình 1.12 Protein Wnt hoạt hóa các tế bào gốc biểu bì (EpSC) bất hoạt

thành các tế bào khuếch đại chuyển (TA) [151]

phosphoryl hóa GSK-3 tại đầu N làm tăng tỷ lệ tế bào gốc biểu bì biểu hiện 1

integrin gần 90% của những quần thể có khả năng tăng sinh in vitro, trong khi

[151]

1.2.4.2 Sự tái tạo được cảm ứng bởi tổn thương của biểu bì

Trong các vết thương cắt bỏ da, biểu bì sẽ phủ vết thương thông qua sự di cư hướng tâm của tế bào lớp đáy Các tế bào lớp đáy của biểu bì tách khỏi màng đáy và bắt đầu di cư vào khuôn nền fibrin của vết thương trong vòng một hoặc hai ngày sau tổn thương Những tín hiệu khởi đầu của sự di cư có thể là một hiệu ứng “bờ tự do”, trong đó sự thiếu vắng của những tế bào lân cận trong một mặt sẽ kích thích tế bào thay đổi hình thái và cấu trúc bên trong để thích nghi với sự di cư [155] Những tế bào đang di cư bị mất sự phân cực đỉnh-đáy và hủy những thể liên kết mặt bên cũng như những thể bán liên kết trên màng đáy Đồng thời, các tế bào biểu bì hình thành

bộ máy di động actin ngoại vi, giúp cho chúng thêm di động thông qua sự nhô ra của lamellapodia và filolopodia, một quá trình qua trung gian bởi GTPase Rac nhỏ

và Cdc42 [45] Các tế bào có thể di chuyển như một tấm hoặc ở dạng nhảy cóc, tức

là những tế bào ngay phía sau bờ hướng dẫn sẽ di chuyển vượt qua các tế bào hướng dẫn để thành lập một bờ mới Những tế bào đang di chuyển thì không phân chia để gia tăng khu vực biểu bì Ngược lại, vùng tái tạo biểu bì gia tăng nhờ sự