Hiện tại, vắc xin phòng nhiễm vi rút cúm AH1N1pdm09 là một trong vắc xin cúm mùa hàng năm và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn được yêu cầu cập nhật thường xuyên trong hệ thốn
Trang 1Bộ Y tế, tổng số 11.104 trường hợp nhiễm với 53 trường hợp tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009) Tương tự các đại dịch cúm đã xảy ra ở giai đoạn trước, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lưu hành và cùng với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm
B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chương trình giám sát cúm quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được ghi nhận với tỷ lệ là 46,6% (2009), giảm với tỷ lệ 28% (2010) Năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ lệ 74,1%, rải rác năm
2012 và đạt 30% (2013) Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm 2009, những phân tích về di truyền học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch Những sự thay đổi được ghi nhận như tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA (D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đường hô hấp Các đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện tượng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng được ghi nhận Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh hưởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế bào chủ Khả năng tiềm tàng của hiện tượng trao đổi và tích hợp (reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể sẽ tăng độc tính của vi rút hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới
Hiện tại, vắc xin phòng nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 là một trong vắc xin cúm mùa hàng năm và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn được yêu cầu cập nhật thường xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của TCYTTG Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang được phát triển tại một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo của TCYTTG
Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào chiến
lược phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Một số
đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 –
2013” với các mục tiêu:
1 Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013
2 Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09
3 Đề xuất chủng vi rút dự tuyển vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Trang 2Những đóng góp mới của luận án:
1 Đây là công trình nghiên cứu khoa học thực hiện có hệ thống để xác định đặc điểm
di truyền, đặc tính kháng nguyên và đề xuất chủng dự tuyển vắc xin cho vi rút lưu hành tại Việt Nam
2 Chứng minh sự tương đồng về mặt di truyền và kháng nguyên giữa các vi rút lưu
hành tại Việt Nam và các vi rút lưu hành tại các nước láng giềng trên thế giới trong giai đoạn nghiên cứu 2009 - 2013
3 Phát hiện một số đột biến liên quan đến thay đổi kiểu hình: làm tăng tiến triển nặng
của bệnh (đột biến vị trí D222N), giảm tương tác ngưng kết hồng cầu (đột biến vị trí G155E, N156K) trên protein HA và giảm độ nhạy với oseltamivir (H275Y) trên protein NA phát hiện trên một số vi rút A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu lưu hành tại Việt Nam
4 Không phát hiện sự trao đổi và tích hợp giữa các phân đoạn gen của vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác lưu hành trên người và động vật
5 Lựa chọn đề xuất 2 chủng vi rút dự tuyển phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09
tại Việt Nam
Bố cục luận án: Luận án dày 120 trang gồm:
Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 20 trang
1.1.1 Đặc điểm vi rút học
Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi
rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa Vi rút cúm A được chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng nguyên bề mặt là HA (H1–H17) và NA (N1-N9) Vi rút cúm B ít có sự thay đổi về kháng nguyên bề mặt Bộ gen của vi rút cúm
A, B gồm 8 phân đoạn và vi rút cúm C là 7 phân đoạn ARN sợi đơn âm Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: (7 protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc - nonstructureral protein: NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B - chỉ thấy
ở tế bào nhiễm vi rút) Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc gắn vi rút vào tế bào chủ, protein NA có chức năng phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào chủ để giải phóng vi rút ra khỏi tế bào nhiễm
Heamaglutinin (HA): Heamaglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã
hóa bởi đoạn RNA số 4 có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể Trên bề mặt tế bào người, HA gắn vào
Trang 3thụ thể α 2,6 axit sialic; trên tế bào gia cầm, HA gắn vào thụ thể α 2,3 axit sialic; trên
tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể
Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme
neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6 NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α 2,3 hoặc α 2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ
1.1.2 Quá trình nhân lên của vi rút cúm A
Vi rút cúm A nhân lên qua bốn giai đoạn: (1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép genom vi rút, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) quá trình đóng gói, nảy chồi và giải phóng vi rút thế hệ mới Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamoglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào (α 2,3 hoặc α 2,6 axit sialic) Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, phá vỡ vỏ giải phóng RNP vào tế bào chất của
tế bào chủ RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào, các RNP
và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút Hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của enzyme neuraminidase
1.2 Đại dịch cúm A/H1N1/09
1.2.1 Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới
Tại Mexico: Cuối tháng 3 năm 2009 các nhà khoa học ghi nhận sự tăng đột biến các
trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính có liên quan đến cúm tại Veracruz, Mexico và được Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ xác định là vi rút cúm A có nguồn gốc từ lợn phân týp H1N1 Ngày 17/4/2009 Bộ Y tế Mexico cảnh báo đại dịch cúm A/H1N1/09 tiếp diễn tại Mexico được ghi nhận đến tháng 12/2009 với 3 làn sóng dịch với tổng số mắc được khẳng định bằng chẩn đoán PTN là 27.440 trường
1- 15/4: CDC xác nhận trường hợp đầu tiên
2-17/4: CDC xác nhận bệnh nhân thứ 2, báo cáo Chính phủ và TCYTTG
3- 23/4: CDC đưa những thông tin đầu tiên liên quan đến dịch
Trang 44- 25/4: TCYTTG thông báo về nguy cơ bùng phát dịch trên toàn cầu
5- 26/4: TCYTTG xác định mức cảnh báo đại dịch tại mức độ 3
6- 26/4: Mỹ tuyên bố tình trạng khẩn cấp về sức khỏe cộng đồng
7- 27/4: TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 4
8- 29/4 : TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 5
9- 11/6 : TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 6
Đến ngày 31/5/2009 có 22 quốc gia của châu Mỹ thông báo có sự xuất hiện của cúm mới A(H1N1)pdm09 với tổng số mắc là 16.018 người và 115 trường hợp tử
vong Trong năm 2009 - 2010, một số nước đã chứng kiến làn sóng thứ 2 và thứ 3 của đại dịch này trước khi đại dịch thoái lui Đến ngày 10 tháng 8 năm 2010, TCYTTG chính thức công bố đại dịch cúm A/H1N1/09 này đã chuyển sang giai đoạn hậu đại dịch
1.2.2 Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam
Việt Nam là nước thứ 54 thông báo các trường hợp nhiễm cúm A(H1N1)pdm09, sau đó liên tục phát hiện các ca bệnh mới nhập cảnh từ Mỹ, Hàn Quốc có tiền sử tiếp xúc gần với bệnh nhân trước đó và xuất hiện các chùm ca bệnh trên diện rộng Giữa tháng 7/2009 dịch bắt đầu có dấu hiệu lan ra cộng đồng, tăng số người mắc tại các nơi tập trung đông người như trường học, cơ quan công sở và nơi công cộng Ngày 3 tháng 8 năm 2009 ghi nhận ca tử vong đầu tiên do cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam Đến tháng 6 năm 2011, cả nước ghi nhận 66 trường hợp tử vong, tuy nhiên số ca bệnh ghi nhận được trên thực tế có thể sẽ cao hơn nhiều lần, tính từ đầu
vụ dịch cho đến trung tuần tháng 9/2009, tỷ lệ chết/mắc do cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam là 0,17%
Trang 5gia của các gen M và NA từ các dòng vi rút cúm lợn Á-Âu đã tạo ra một phân týp vi rút cúm A hoàn toàn mới, thể hiện sự trao đổi giữa các loài và đã đáp ứng đầy đủ về
vi rút học trong cơ chế gây đại dịch cúm ở người Tuy nhiên vi rút cúm này vẫn có xuất phát điểm là sự tiến hóa của vi rút cúm đại dịch A/H1N1/1918
1.3 Các phương pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 phòng thí nghiệm 1.3.1 Phân lập vi rút
Phân lập vi rút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm Hiện nay, có 2
hệ thống phân lập được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thường trực thận chó (Mardin - Darby canine kidney cells - MDCK) Vi rút sau khi phân lập được xác định đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
1.3.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền
- Phương pháp RT-PCR: có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua xác
định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng
- Phương pháp Real time RT-PCR: được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn
đoán các vi rút gây bệnh như vi rút cúm A/H5N1, A/H1N1/09 đại dịch…
- Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược LAMP): khuếch đại ADN trong điều kiện đẳng nhiệt, thời gian tiến hành phản ứng
(RT-ngắn
- Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence): xác định đặc điểm di truyền học,
xây dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA và M của vi rút cúm, từ đó xác định tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của vi rút, giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút cũng như phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đang lưu hành
1.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể
- Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test - HI): xác
định kháng thể kháng HA đặc hiệu vi rút cúm (anti heamagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1, A/H3, A/H5, B…)
- Phản ứng trung hoà vi lượng (Microneutralization test - MN): phát hiện kháng thể
kháng đặc hiệu vi rút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân týp vi rút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát hiện được
1.4 Vắc xin
1.4.1 Các loại vắc xin cúm
Vắc xin cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 và B) hiện tại có nhiều loại khác nhau: vắc xin bất hoạt (inactivated vaccine), vắc xin sống giảm độc lực (Live attenuated influenza virus - LAIV) và vắc xin bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (reassortment vaccine) Hiện tại, vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin bất hoạt, đa giá (thành phần vắc xin bao gồm vi rút cúm A/H1N1,
A/H3N2 và B)
Vắc xin cúm A(H1N1)pdm09: Vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm
A(H1N1)pdm09 đầu tiên (IDCDC-RG15) được TCYTTG thông báo vào ngày
Trang 627/5/2009 phát triển tại PTN chuẩn thức CDC- Atlanta, Mỹ, đó là một vi rút được tạo bằng công nghệ di truyền ngược (reassortant virus) từ vi rút A/Texas/5/2009 Tháng 10/2009 vi rút cúm A/California/07/09 được giới thiệu là vi rút dự tuyển cho sản xuất vắc xin cúm theo công nghệ vắc xin bất hoạt thông dụng và các sinh phẩm kiểm chuẩn (kháng huyết thanh chuẩn), được cung cấp tại các PTN chuẩn thức của TCYTTG cho các công ty, viện vắc xin được sẵn sàng vào tháng 11/2009
1.4.2 Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin
Hàng năm, vắc xin cúm mùa đều phải cập nhật để thành phần vi rút trong vắc xin tương thích với vi rút cúm lưu hành và gây bệnh trên phạm vi toàn cầu Theo khuyến cáo hàng năm của TCYTTG về chủng vi rút cúm dự tuyển cho thành phần vắc xin cúm cho mùa dịch sắp tới tại khu vực Bắc bán cầu hoặc Nam bán cầu, các công ty sản xuất vắc xin sẽ nhận được các thông tin về đặc điểm vi rút cúm lưu hành thu thập từ các trung tâm giám sát cúm gần nhất và các thông tin về các sinh phẩm liên quan để đánh giá chất lượng vắc xin tại các PTN chuẩn thức của TCYTTG Quá trình bắt đầu sản xuất đến khi lưu hành vắc xin cúm sẽ được thực hiện trong 6 tháng (tháng 3 đến tháng 9 hàng năm cho khu vực Bắc bán cầu, tháng 9 đến tháng 3 năm sau cho khu vực Nam bán cầu)
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 phân lập được tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân có hội chứng cúm (sốt trên 380C, ho và/hoặc đau họng) giai đoạn 2009-2013 từ đề tài nhánh cấp nhà nước (2009-2011) và chương trình Giám sát Cúm quốc gia phối hợp với Cơ quan Kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ - CDC/US (2006-2012)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Cỡ mẫu: Nghiên cứu mô tả và tiến cứu với 75 chủng vi rút được lựa chọn để đảm
bảo tính đại diện cho vụ dịch theo địa điểm (miền Bắc, Trung và Tây Nguyên) và thời
gian xảy ra dịch (2009-2013) Chủng cúm A(H1N1)pdm09 đạt hiệu giá HA ≥ 8 sau 72-96 giờ khuếch đại trên tế bào MDCK
Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Năm Miền Bắc Miền Trung Tây Nguyên Địa điểm thu thập Số vi rút
Kỹ thuật xét nghiệm: Phân lập và khuếch đại vi rút, phân tích đặc điểm di truyền
bằng kỹ thuật giải trình tự gen (Sanger sequence) và xác định đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
Trang 7Sinh phẩm: Tế bào MDCK (CDC)/ trứng phân lập vi rút cúm; Giải trình tự gen sử
dụng bộ kit của hãng ABI, Mỹ, mồi được cung cấp bởi CDC; xác định đặc tính kháng nguyên bằng kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera) trong bộ sinh phẩm của TCYYTG cung cấp hàng năm
Phân tích số liệu:
Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa của các vi rút sau khi được giải trình
tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến thay đổi kiểu hình bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA và Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia
hệ 6 phân đoạn gen được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood Các trình tự phân đoạn gen tham chiếu được thu thập từ ngân
hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com)
Đặc tính kháng nguyên của vi rút được xác định tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu giá ngăn ngưng kết hồng cầu cao nhất
Vi rút được lựa chọn để phát triển vắc xin phải đảm bảo: đại diện cho đa phần các chủng lưu hành tại Việt Nam về di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên; có khả năng khuếch đại tốt trên các hệ thống nuôi (tế bào hoặc trứng) và có tính ổn định
về di truyền và đặc tính kháng nguyên
2.3 Vấn đề Y đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu là một nhánh của đề tài nghiên cứu cấp nhà nước (Mã số ĐTĐL 2009G/55) và chương trình giám sát cúm quốc gia giai đoạn 2009-2011 tại khu vực miền Bắc Việt Nam, phối hợp với Cơ quan phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US) giai đoạn 2006-2012 Vì vậy Y đức trong nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Hội đồng Y đức - Bộ Y tế và Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US)
CHƯƠNG III - KẾT QUẢ 3.1 Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu
75 chủng vi rút nghiên cứu được phân lập và khuếch đại trên dòng tế bào MDCK với hiệu giá HA ≥ 8 từ mẫu bệnh phẩm dịch họng dương tính với vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phương pháp RT-PCR hoặc Realtime PCR
Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu
Trang 83.2 Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09
Do cấu trúc hệ gen của vi rút cúm gồm 8 phân đoạn với kích cỡ và cấu trúc khác nhau nên khả năng thành công khi tổng hợp từng phân đoạn bằng phản ứng PCR sẽ thay đổi theo từng phân đoạn Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế cho phân tách (tách biệt) các phân đoạn gen độc lập của vi rút cúm A kết hợp với DNA polymerase Hifi có khả năng khuếch đại và hiệu chuẩn sản phẩm PCR với kích cỡ lớn, các phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được phân tách và khuếch đại với độ đặc hiệu, chính xác cao
Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR Phân đoạn
gen
Độ dài thu đƣợc (bp)
Số vi rút (n) Tổng
(N=75)
Tỷ lệ (%)
3.2.1 Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA
*Cây gia hệ phân đoạn gen HA: được xây dựng với vi rút gốc là A/California/07/09
và 75 chủng vi rút với phân đoạn gen HA có độ dài 1778 nucleotide sử dụng trong nghiên cứu cùng với các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại các nước láng giềng trong cùng giai đoạn (Thái Lan, Trung Quốc…) Cho đến hiện tại, các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới được nhóm thành 7 nhóm chính (nhóm 1 đến 7), trong
đó nhóm 6 được tách thành các phân nhóm 6A; 6B và 6C Các vi rút tập trung trong từng nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tương đồng về trình tự nucleotide của gen HA
từ 99,7% (nhóm) hoặc 99,9% (phân nhóm) với độ lặp lại (boostrap) 1000 lần trong quá trình so sánh trình tự giữa các vi rút Kết hợp với phân tích sự tương đồng trên các vi rút lưu hành trong khu vực và trên thế giới, các vi rút sử dụng trong nghiên cứu được tập hợp trong nhóm/phân nhóm của cây gia hệ như sau (Hình 3.1):
- Nhóm 1: gồm 1 vi rút phân lập năm 2009
- Nhóm 2: 2 vi rút phân lập năm 2009, 2 vi rút phân lập năm 2010
- Nhóm 3: 3 vi rút phân lập năm 2009 và 8 vi rút phân lập năm 2010
- Nhóm 4: 8 vi rút còn lại phân lập năm 2009
- Nhóm 5: 9 vi rút còn lại phân lập năm 2010
- Phân nhóm 6A: 7 vi rút phân lập năm 2013
- Phân nhóm 6B: không có vi rút nào xuất hiện trong nghiên cứu
Trang 9- Phân nhóm 6C: là phân nhóm lớn gồm 23 vi rút phân lập (2013) và 1 vi rút phân lập năm 2011
- Nhóm 7: 6 vi rút phân lập (2011), 4 vi rút (2012) và 1 vi rút (2013)
*Protein HA: Kết quả phân tích protein HA của 75 chủng vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu cho thấy sự thay đổi axit amin trong từng nhóm, phân nhóm so với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.3) cho thấy: nhóm 1
có 2 axit amin thay đổi đó là (P83S, I321V), nhóm 2 có 3 axit amin thay đổi (P83S, I321V và S203T); nhóm 3 và nhóm 5 có 5 axit amin thay đổi; nhóm 4 có 4 axit amin thay đổi, phân nhóm 6A có 11 axit amin thay đổi; phân nhóm 6C có 16 axit amin
thay đổi và nhóm 7 có 12 axit amin thay đổi
Tần xuất thay đổi (đột biến) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam so với vi rút gốc A/California/07/09 được ghi nhận tại một số vị trí axit amin số
83 thay đổi từ Proline thành Serine (P83S) và Isoleucine thành Valine tại axit amin số
321 (I321V) xuất hiện trong toàn bộ 75 chủng vi rút (100%) sử dụng trong nghiên cứu Tiếp theo thay đổi S203T được xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7 với tần suất 87,5%, các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất đạt 50% và D97N, S451N được xác định trong 3 nhóm/phân nhóm (37,5%) Các thay đổi (đột biến) khác xuất hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm (bảng 3.3)
Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA
P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, S143G, S185T, A197T, N260D, E374K, S451N, E499K
Trang 10Hình 3.1 Cây gia hệ HA của vi rút
cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam,
Trang 113.2.2 Đặc điểm di truyền gen NA (Neuraminidase)
*Cây gia hệ phân đoạn gen NA: xây dựng trên 52 chủng vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và một số vi rút lưu hành cùng thời gian trên một
số nước trên thế giới: Thái Lan, Hông Kông, Mỹ, Canada Cây gia hệ cho thấy gen
NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sau 4 năm lưu hành (2009-2013) tập hợp trong
10 nhóm/phân nhóm: 1; 2; 3; 4; 5; 6A; 6B; 6C; 7A và 7B:
- Nhóm 2: gồm 3 vi rút phân lập năm 2009 và 4 vi rút phân lập năm 2010
- Nhóm 3: gồm 3 vi rút phân lập năm 2009 và 12 vi rút phân lập năm 2010
- Nhóm 5: gồm 5 vi rút phân lập năm 2013
- Phân nhóm 6B: gồm 5 vi rút phân lập năm 2013
- Phân nhóm 6C: gồm 10 vi rút phân lập năm 2013
- Phân nhóm 7A: gồm 3 vi rút phân lập (2011); 1 vi rút (2012) và 1 vi rút (2013)
- Phân nhóm 7B: 1 vi rút phân lập (2011); 1 vi rút (2012) và 3 vi rút (2013)
Các vi rút phân lập năm 2009-2010 có độ tương đồng cao và tập trung trong nhóm 2
và 3 Các vi rút cúm phân lập năm 2013 phân tách nhiều thể hiện trong sự có mặt của những vi rút này tại các nhóm/phân nhóm 5; 6B, 6C, 7A và 7B (hình 3.2)
*Protein NA: So với chủng vi rút vắc xin A/California/07/09, phân đoạn gen NA
của 52 chủng A(H1N1)pdm09 tập trung trong các nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tương đồng về axit amin từ 99,3% đến 99,9% Các vi rút lưu hành tại Việt Nam có
sự thay đổi (đột biến) so với vi rút vắc xin A/California/07/09 từ 1 axit amin (nhóm 2) đến 9 axit amin (nhóm 5) Sự thay đổi từ Asparagine (N) thành Aspartic (D) tại vị trí 248 trên protein NA được ghi nhận toàn bộ các nhóm/phân nhóm trên cây gia hệ
và đạt tần suất 100% Tiếp theo là sự thay đổi từ Valine (V) thành Isoleusine (I) tại vị trí 241 được ghi nhận tại 6/7 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ (85,7%), các sự thay đổi của N369K, N44S hoặc V106I xuất hiện trên 3 đến 5 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ với tần suất thay đổi ghi nhận từ 42,8% - 71,4% Ngoài ra sự đa dạng thay đổi tại một vị trí cũng được ghi nhận trên protein NA khi sự thay đổi V83L (nhóm 5) và V83A (phân nhóm 6C) (bảng 3.4)
Bảng 3.4 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein NA
Nhóm/
Phân
nhóm
so với vi rút vắcxin A/California/07/09
Trang 123.2.3 Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2
*Cây gia hệ phân đoạn gen M (Matrix): được xây dựng bởi 50 chủng vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 trong tổng số 75 chủng vi rút trong nghiên cứu và một số vi rút lưu hành trên thế giới trong cùng thời gian, được chia thành 6 nhóm trong đó các vi rút trong nghiên cứu được chia 4 nhóm (nhóm 2, 3, 5 và 6) (Hình 3.3)
*Cây gia hệ phân đoạn gen NS (Non-structure): với 47 chủng vi rút nghiên cứu bắt
đầu phát triển từ vi rút gốc A/California/07/09 có thể phân tách thành 7 nhóm/phân nhóm, trong đó các vi rút sử dụng nghiên cứu được tập trung trong 5 nhóm/phân nhóm (Hình 3.4)
Hình 3.3 Cây gia hệ M của vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009-2013
Hình 3.4 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009-2013.
*Cây gia hệ phân đoạn gen PB1 (Polymerasse): được xây dựng dựa trên 36 chủng
vi rút phân lập trong nghiên cứu và một số vi rút lưu hành trên thế giới, phân thành 5 nhóm, trong đó các vi rút lưu hành tại Việt Nam được tập trung trong 4 nhóm 1,2,4,5, (Hình 3.5)
*Cây gia hệ phân đoạn gen PB2 (Polymerasse PB2): được xây dựng dựa trên 45
chủng vi rút phân lập trong nghiên cứu và một số vi rút lưu hành trên thế giới, phân thành 8 nhóm/phân nhóm, trong đó các vi rút trong nghiên cứu tại Việt Nam được tập hợp trong 5 nhóm/phân nhóm 1, 3, 6A, 6B, 6C, (Hình 3.6)
