NGHIÊN cứu cặp mồi TH2 TRÊN BỆNH PHẨM SINH THIẾT dạ dày để CHẨN đoán HELICOBACTER PYLORI

y học thực hành 762 - số 4/2011 54 Nghiên cứu cặp mồi TH2 trên bệnh phẩm sinh thiết dạ dày để chẩn đoán helicobacter pylori Nguyễn thị hồng hạnh, Nguyễn Thuý Vinh Viện Công Nghệ Sinh

y học thực hành (762) - số 4/2011

54

Nghiên cứu cặp mồi TH2 trên bệnh phẩm sinh thiết dạ dày

để chẩn đoán helicobacter pylori

Nguyễn thị hồng hạnh, Nguyễn Thuý Vinh

Viện Công Nghệ Sinh học; Bệnh viện Hữu Nghị

Tóm tắt

Cặp mồi TH2 đã được thiết kế nhằm khuếch đại

gien HP1125 mã hoá cho một trong số 32 protein

màng ngoài của Helicobacter pylori và được thử

nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ sinh thiết hoặc từ

vi khuẩn phân lập từ các bệnh nhân Độ nhậy và độ

đặc hiệu của mồi thiết kế tương ứng là 99.11% và 100

Các bác sĩ có thể sử dụng trực tiếp các sinh thiết dạ

dày để làm PCR không cần nuôi cấy vi khuẩn đòi hỏi

thời gian và tốn kém Trong tương lai, cặp mồi TH2 có

thể được sử dụng để chẩn đoán H pylori

Từ khoá: Helicobacter pylori; gien HP1125; cặp

mồi TH2; PCR; độ nhạy; độ đặc hiệu

SUMMARY

A set of PCR primers named TH2 was

designed and tested on ADN samples of 113

Vietnamese patients to monitor Helicobacter

pylori As shown by the results, the domain

located on HP1125 gene appears to be highly

conserved It is amplified successfully in almost

all cases The sensitivity as well as the

specificity of PCR method are 99 11% and

100% respectively In sum, TH2 primers can be

used to detect Helicobacter pylori

Keywords: Helicobacter pylori; gene HP1125; TH2

primers; PCR; Sensitivity; Specificity

Đặt vấn đề

Vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori ) là căn

nguyên của các bệnh về dạ dày ở người và một số

động vật Trên thế giới cũng như ở Việt nam, có hơn

một nửa số dân cư bị nhiễm vi khuẩn HP Do HP là các

vi sinh vật siêu đột biến, nên các dấu ấn phân tử của

chúng được lựa chọn khác nhau ở các vùng dân cư

khác nhau trên thế giới Chẳng hạn, nếu ở phương

Tây, các vi khuẩn HP mang cagA+ status dường như

liên quan đến các biểu hiện bệnh dạ dày rất nặng như

ung thư, thì ở các nước phương Đông như Nhật, Hàn

quốc, Trung Quốc…, qui luật đó không được xem xét

[1, 2].Hiện nay, các nhà khoa học ước tính, H pylori có

thể có đến 32 gien mã hoá cho protein màng ngoài [3]

Các gien của các protein này được quan tâm nghiên

cứu ở nhiều khía cạnh, trong đó có việc sử dụng chúng

làm dấu ấn phân tử để phát hiện vi khuẩn HP [4,5]

Trong bài báo này, chúng tôi thông báo các

kết quả khảo nghiệm cặp mồi TH2 để phát hiện

vi khuẩn HP Chúng tôi sử dụng phương pháp

PCR để khuếch đại một vùng bảo thủ trên gien

HP1125 của vi khuẩn H pylori

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân : các bệnh nhân có

nhiễm H pylori theo tiêu chuẩn vàng (hoặc nuôi cấy

dương tính, hoặc cả hai phương pháp Clotest và mô

bệnh học dương tính) được lựa chọn cho nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại bệnh nhân:

Dừng kháng sinh chưa được 1 tháng và ức chế bơm proton chưa được 1 tuần

Tổng số 113 bệnh nhân trong đó có 35 nữ và 78 nam Tuổi của các bệnh nhân từ 20 đến 82, tuổi trung bình là 47,1 Các bệnh nhân được chẩn đoán loét dạ dày và hành tá tràng, đáp ứng các tiêu chuẩn chọn lựa và loại trừ được chọn vào nghiên cứu Lấy sinh thiết: sinh thiết được lấy từ 113 bệnh nhân, trong đó 38 mẫu được sử dụng trực tiếp để tách chiết ADN trong vòng một vài tiếng sau khi lấy, còn 75 mẫu được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp đã công bố [6]

Tách ADN từ sinh thiết: ADN được tách từ sinh

thiết và từ vi khuẩn theo các phương pháp đã miêu tả

Phản ứng PCR: Cặp mồi TH2 được thiết kế dựa

trên trình tự đã biết của gien HP1125 của chủng vi khuẩn chuẩn J99 và 26295

Cặp mồi khuếch đại gien HP1125: Sơ đồ hình 1

chỉ vị trí của mồi trên gien HP1125 của chủng chuẩn J99

Hình 1 Vị trí của cặp mồi TH2 ( F+R) trên gien HP1125 của chủng J99

Cặp mồi TH2 có trình tự như sau:

Th2F: 5’- acttgaattccttgatcggattctttgatttc- 3’ TH2R: 5’-tttaggatccccatggataataagactgtggcc-3’ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

94o

C 1 phút

55 o

C 50 giây

72 oC 50 giây Lặp lạị 35 chu kỳ

Xác định độ nhậy của phản ứng PCR

Độ nhậy = số các mẫu dương tính thật / số các mẫu dương tính thật + âm tính giả

Độ đặc thù= số mẫu âm tính thật/ số mẫu âm tính thật + dương tính giả

Kết quả và bàn luận

Giới thiệu về bệnh nhân

113 mẫu ADN được tách từ sinh thiết và từ vi

khuẩn Helicobacter pylori, trong đó số phụ nữ bị nhiễm H pylori là 35 người chiếm 30.97% và nam

giới là 78 người chiếm 69.03%

Kết quả thống kê cho thấy, bệnh dạ dày do vi

khuẩn H pylori có liên quan chặt chẽ đến độ tuổi và

giới tính của các bệnh nhân ở độ tuổi dưới 40 số

bệnh nhân bị nhiễm H pylori chiếm tỷ lệ thấp, sau đó

tăng dần ở độ tuổi 41 đến 50, ở độ tuổi trên 50 tuổi số

bệnh nhân bị nhiễm H pylori tăng một cách đột biến

chiếm 59.29% Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, ở

y học thực hành (762) - số 4/2011 55

bất cứ độ tuổi nào thì số lượng bệnh nhân nam bị

nhiễm H pylori cũng cao số lượng bệnh nhân nữ Sự

liên quan bệnh dạ dày đến độ tuổi, giới tính được chỉ

ra ở hình 2 và bảng 1 dưới đây

Bảng 1 Bệnh dạ dày do vi khuẩn H pylori theo

tuổi và giới

Tuổi

Giới tính < 30 31- 40 41 -

50

> 50 Tổng

Tuổi trung bình

% theo giới tính

% theo độ

tuổi

14.3 11.6 15.2 58.9

Khảo sát cặp mồi TH2 trên 113 mẫu bệnh phẩm

Tất cả 113 mẫu ADN sinh thiết được tách và làm

sạch theo phương pháp cải tiến đơn giản và dễ áp

dụng trong các bệnh viện Tất cả ADN đều đạt tiêu

chuẩn về chất lượng ( hình 3) Chúng đã được sử

dụng có kết quả trong các phản ứng PCR nhằm phát

hiện vi khuẩn H pylori Cặp mồi TH2 được sử dụng

để khuếch đại đầu 5’của gien HP1125 trên 113 mẫu

ADN Trên điện di đồ (hình 3), sản phẩm PCR là một

băng duy nhất có kích thước như mong đợi từ thiết kế

là 220 cặp bazơ

Qua khảo sát PCR trên 113 mẫu ADN, cặp mồi

TH2 đã tỏ ra có khả năng nhận biết gien HP1125 rất

cao, trong đó 112 mẫu ADN cho kết quả PCR dương

tính trên tổng số 113 mẫu ADN nghiên cứu, chiếm tỷ

lệ 99,11% Điều này cũng gián tiếp cho thấy, đoạn

gien được khuếch đại có tính bảo thủ cao

1 2 3 4 5 6 8 7 9 10 11 12 13 14 15 16 M

Hình 3 Điện di đồ một số mẫu ADN tổng số tách

từ các chủng vi khuẩn H pylori

Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16 có một băng ADN tổng số

M là bậc thang ADN chuẩn 100 cặp bazơ

Hình 4 Đầu 5’ của gien HP1125 được khuếch đại trên

mẫu ADN của các bệnh nhân nhiễm khuẩn H pylori

Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 có một băng

ADN kích thước 220bp

M: Thang chuẩn ADN 100 cặp bazơ

Các kết quả PCR trên 113 mẫu ADN, được xử lý bằng chương trình Excel và thống kê sinh học cho thấy độ nhậy của cặp mồi TH2 thiết kế > 99.11% và

độ đặc thù của phản ứng PCR đạt 100% Bảng 2 dưới

đây là kết quả PCR của các mẫu ADN nghiên cứu Bảng 2 : Kết quả PCR nhận được khi khảo sát 113 mẫu ADN

Chỉ tiêu nghiên cứu Kết quả

PCR

Số mẫu ADN cho sản phẩm PCR dương tính thật 112/ 113

Số mẫu AND cho sản phẩm PCR dương tính giả 0/113

Số mẫu AND cho sản phẩm PCR âm tính thật 1/113

Số mẫu ADN cho sản phẩm PCR âm tính giả 0/113

Độ nhậy của cặp mồi TH2 99,11%

Độ đặc thù của cặp mồi TH2 100%

Việc phát hiện các nguồn bệnh bằng khuếch đại một số gien đặc trưng của vi khuẩn bằng phản ứngPCR là một phương pháp nhanh, nhậy, chính xác

và tương đối dễ thao tác Tuy nhiên, vấn đề sẽ khó khăn hơn, nếu các nguồn bệnh có một hệ gienom linh hoạt và luôn thay đổi như virus HIV, nguyên sinh

động vật Trypanosoma, vi khuẩn Helicobacter

pylori…Trong những trường hợp như vậy, các nhà

khoa học bắt buộc phải tìm kiếm các vùng bảo thủ nhất trên hệ gien nhằm đạt một độ nhậy cũng như độ

đặc thù cao cho phải ứng PCR Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi đã may mắn tìm thấy một trong những vùng như vậy trên gien HP1125 của vi khuẩn

Điều đó giải thích độ nhậy đạt 99,11% cũng như độ

đặc thù cao 100% của phương pháp

Chúng tôi cho rằng, cặp mồi TH2 có thể sử dụng

nhằm chẩn đóan vi khuẩn H pylori ở Việt Nam

Kết luận:

Cặp mồi TH2 đã được thiết kế nhằm khuếch đại gien HP1125 mã hoá cho một trong số 32 protein

màng ngoài của Helicobacter pylori và được thử

nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân Độ nhậy và độ đặc hiệu của mồi thiết kế tương ứng là 99.11% và 100 Cặp mồi

TH2 có thể được sử dụng để chẩn đoán H pylori

trực tiếp từ các mảnh sinh thiết dạ dày bằng phương pháp PCR mà không cần nuôi cấy vi khuẩn đòi hỏi thời gian và tốn kém

Tài liệu tham khảo

1 Warburton, V.J., Everett, S., Mapstone, N.P., Axon, A.T and HawkeyP., Dixon, M F (1998) Clinical and Histological associations of cagA and

vacA genotypes in Helicobacter pylori J Clin Pathol 51{1): 55-61

2 Shimoyama, T., Yoshimura, T., Mikami, T., Fukuda, S., Crabtree, J.E., Munakata, A (1998) Evaluation of Helicobacter pylori in Japanese patients

with gastric cancer J Clin Pathol 51(4) : 299- 301 3 Richard, Alm et al (2000) Comparative Genomic of Helicobacter pylori :Analysis of the outer membrane protein families Infect and Immu Vol 68

(7) : 4155- 4167

4 Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001) Sử dụng protein màng ngoài HP1125 của vi khuẩn Helicobacter pylori

làm kháng nguyên đặc hiệu trong các phân tích

220bp

y học thực hành (762) - số 4/2011

56

Western Đại hội lần thứ 2 Hội nghị khoa học Sinh Y

Dược năm 2001, trang 125-129

5 Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003) Sử dụng kháng

nguyên tái tổ hợp HP1125 để chẩn đoán nhiễm khuẩn

Helicobacter pylori Những vấn đề nghiên cứu cơ bản

trong khoa học sự sống Báo cáo khoa học Nhà xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 2003 Tr 889-991

6 Trần Công Tước., Trần Quỳnh Hoa., Nguyễn

Thị Hồng Hạnh., Nguyễn Vân Phủng và Bùi Phương

Thuân (2000) Sự có mặt của vi khuẩn Helicobacter

pylori mang CagA+ trong các sinh thiết dạ dày của

người Việt Nam Tạp chí Sinh học 23 (2) : 51-54

7 Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi (2001) Sự tồn tại của các chủng Helicobacter

pylori khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân

viêm loét và ung thư dạ dày Việt Nam Đại hội lần thứ

hai hội nghị khoa học hoá sinh y dược năm 2001- Các báo cáo khoa học Trang106 -113

KếT QUả BƯớC ĐầU SINH THIếT XUYÊN THàNH NGựC TRONG CHẩN ĐOáN ĐáM Mờ ở PHổI

DƯớI HƯớNG DẫN CủA CHụP CắT LớP VI TíNH TạI BệNH VIệN HữU NGHị

TRịNH MạNH HùNG

Ung thư phổi là một trong những bệnh thường gặp,

cú tỉ lệ mắc và tử vong đứng đầu trong cỏc bệnh về ung

thư Việc chẩn đoỏn mụ bệnh học cú nghĩa vụ cựng

quan trọng trong việc điều trị và tiờn lượng bệnh

Soi phế quản (SPQ) là một phương phỏp hữu ớch khi

nhỡn thấy được tổn thương để lấy bệnh phẩm làm xột

nghiệm Tuy nhiờn rất nhiều trường hợp SPQ khụng gúp

phần vào việc chẩn đoỏn bệnh, lỳc này sinh thiết xuyờn

thành ngực (STXTN) là một biện phỏp lớ tưởng trong

việc tiếp cận khối u STXTN đó được tiến hành ở nhiều

nước trờn thế giới và thể hiện được nhiều ưu điểm Tại

bệnh viện Hữu nghị Hà Nội, kĩ thuật này được triển khai

từ năm 2006 bằng kim Chiba, sau đú từ năm 2008 bằng

kim Tro-cut cú khả năng lấy mảnh tổ chức rất tốt Sau 1

năm nghiờn cứu chỳng tụi thực hiện đề tài này với mục

tiờu sau:

- Đỏnh giỏ kết quả bước đầu của STXTN trong chẩn

đoỏn đỏm mờ ở phổi dưới hướng dẫn của chụp cắt lớp

vi tớnh (CLVT)

- Xõy dựng quy trỡnh kĩ thuật

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU:

1 Đối tượng nghiờn cứu: 30 người bệnh được

điều trị tại Bệnh viện Hữu nghị cú chẩn đoỏn đỏm mờ ở

phổi trờn cắt lớp vi tớnh

1.1 Tiờu chuẩn chọn người bệnh :

- Cú tổn thương hỡnh đỏm mờ ngoại vi trờn phim

chụp CLVT

- Tất cả tổn thương hỡnh đỏm mờ khỏc trờn CLVT mà

SPQ khụng thấy khối u trong lũng phế quản, xột nghiệm

giải phẫu bệnh qua SPQ khụng giỳp ớch cho chẩn đoỏn

- Người khụng cú chống chỉ định với STXTN

1.2 Tiờu chuẩn loại trừ bệnh nhõn: Rối loạn đụng

cầm mỏu Điều trị chống đụng.Tăng ỏp lực động mạch

phổi nặng Suy hụ hấp, suy tim, đang thở mỏy Kộn khớ

lớn cạnh khối u Cắt thựy phổi bờn đối diện khối u Nghi

tổn thương u mạch Nghi ngờ nang nước Người bệnh

khụng kết hợp

2 Thiết kế nghiờn cứu: Nghiờn cứu mụ tả, tiến cứu

3 Phương phỏp tiờn hành:

3.1 Chuẩn bị người bệnh :

- Giải thớch cho người bệnh và gia đỡnh người bệnh

về sự cần thiết tiến hành kĩ thuật đồng thời kớ vào giấy

đồng ý làm thủ thuật

- Trước khi tiến hành kĩ thuật phải cú phim chụp phổi

thẳng nghiờng, phim chụp CLVT, xột nghiệm cụng thức

mỏu, đụng mỏu cơ bản

- Kĩ thuật được tiến hành tại phũng chụp CLVT

- Người bệnh được nằm sấp, nghiờng hay ngửa tựy thuộc vào vị trớ khối u hay là sự thuận lợi đối với thủ thuật viờn

3.2 Chuẩn bị dụng cụ: - Kim sinh thiết - Dao phẫu thuật - Kim tiờm cỏc loại, bơm tiờm 50ml - Lọ đựng bệnh phẩm, lam kớnh - Săng cú lỗ và khụng lỗ, bong cồn, gạc, ỏo thủ thuật, mũ, khẩu trang - Thuốc gõy tờ tại chỗ: Lidocain hoặc Novocain

3.3 Phương phỏp tiến hành:

Định vị vị trớ chọc trờn CLVT, đo khoảng cỏch từ khối

u đến mặt da, đo gúc tạo bởi giữa mặt phẳng ngang và hướng kim Sỏt khuẩn vị trớ chọc khoảng 20 cm Trải săng cú lỗ lờn vị trớ sinh thiết Gõy tờ tại chỗ Tiến hành sinh thiết: Chọc kim sinh thiết vào vị trớ đó được định vị:

độ sõu, gúc Chụp CLVT lại để xỏc định vị trớ đầu kim sinh thiết Khi đầu kim sinh thiết vào vị trớ khối u, tiến hành sinh thiết lấy 1-2 mảnh tổ chức

Hỡnh ảnh tiến hành sinh thiết

3.4 Theo dừi và xử trớ tai biến:

- Khi sinh thiết xong chụp CLVT lại một lần nữa để kiểm tra tai biến sau quỏ trỡnh sinh thiết: chảy mỏu, tràn khớ màng phổi

- Sau 4h cần chụp phim X quang thường để kiểm tra lại tai biến một lần nữa

- Người bệnh cần thiết phải được theo dừi trong 24h

để phỏt hiện kịp thời những tai biến muộn cú thể xảy ra

KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ BÀN LUẬN:

- Phõn bố người bệnh theo tuổi: Bảng 1

Tuổi cao nhất: 82, tuổi thấp nhất: 54 Trong 30 trường hợp cú đỏm mờ trờn CLVT, lứa tuổi chỳng tụi hay gặp nhất ở độ tuổi từ 60-79, đõy là điểm đặc trưng của Bệnh viện Hữu nghị đa phần điều trị cho người bệnh cao tuổi

1 Phõn bố người bệnh theo giới: