Nhân giống cây sâm dây (codonopsis javanica) (blume) hook f ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa các chất thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến hiệu quả nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm ...32 3.3.

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TỐNG XUÂN HOA

NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014

Trang 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TỐNG XUÂN HOA

NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên - 2014

Trang 3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Thúy Hường, Trại Thực nghiệm Sinh học thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình cùng bạn bè đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái nguyên, tháng 8 năm 2014

Tác giả luận văn

Tống Xuân Hoa

Trang 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn

trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Thái nguyên, tháng 8 năm 2014

Tác giả luận văn

Tống Xuân Hoa

Trang 5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Sâm dây 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây 3

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 9

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 9

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 12

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 14

1.3.1 Auxin 15

1.3.2 Cytokinin 16

1.4 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước và ngoài nước 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu 21

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 21

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

Trang 6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21

2.2.2 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 24

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 26

3.1.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm 26

3.1.2 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 29

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 30

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa các chất thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến hiệu quả nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32

3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32

3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 33

3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 35

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 44

Trang 7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trang 8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi

Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) 27

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi

Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) 29

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 31

Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh

trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 32

Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh

trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 34

Bảng 3.6 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự

sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 35

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây Sâm dây in

vitro trong vườn ươm (sau 4 tuần) 38

Trang 9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây Sâm dây 3 Hình 3.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của

chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 27

Hình 3.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng

của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng kết hợp của BAP và IBA đến khả năng nhân chồi và sự

sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 33

Hình 3.5 Ảnh hưởng kết hợp của kinetin và IBA khả năng nhân chồi, sự sinh

trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng kết hợp của BAP , kinetin, IBA đến khả năng nhân chồi

và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 36

Hình 3.7 Cây Sâm dây đưa ra môi trường tự nhiên (sau 4 tuần) 38

Trang 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1

Mặc dù có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng và kinh nghiệm

sử dụng dược liệu làm thuốc của nhân dân ta đã có từ xa xưa, nhưng nguồn tài nguyên đó đang ngày càng suy giảm nghiêm trọng, đa số các cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng Nguyên nhân là do sự khai thác một cách ồ ạt, không có kế hoạch và chưa chú ý đến việc tái sinh, bảo vệ rừng làm nguồn cây thuốc Việt Nam bị tàn phá nhanh và cạn kiệt

Sâm dây hay còn gọi là Đảng sâm là loại dược liệu quý được đưa vào sách đỏ Việt Nam từ năm 1996 Công dụng của Sâm dây đã được nghiên cứu

và được y học dân tộc đưa vào các bài thuốc chữa bệnh Sâm dây là một vị thuốc có rất nhiều công dụng chữa bệnh và phòng ngừa bệnh, giúp cho cơ thể khỏe mạnh và đề kháng tốt Đông y coi Sâm dây là nhân sâm của người nghèo

vì có mọi công dụng của nhân sâm nhưng lại rẻ tiền hơn Vì thế việc dùng Sâm dây trở nên phổ biến rộng rãi, đáp ứng được nhu cầu sử dụng gần như không

giới hạn trong y học dân tộc Tuy nhiên, nạn tàn phá rừng làm nương rẫy quá

mức trong tự nhiên làm cho vùng phân bố của cây Sâm dây bị thu hẹp nhanh chóng, có nguy cơ cạn kiệt Vì vậy, việc bảo tồn cây Sâm dây là cần thiết

: “Nhân giống

cây Sâm dây (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô thực vật”

Trang 11

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được môi trường nhân giống cây Sâm dây trong ống nghiệm

- Xác định được giá thể đưa cây ra trồng ngoài môi trường tự nhiên

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin lên khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng ra rễ của cây Sâm dây trong ống nghiệm

- Nghiên cứu giá thể và các điều kiện thích hợp để đưa cây ra môi trường

tự nhiên

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Sâm dây

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây

Cây Sâm dây có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook.f., tên thường gọi: Đảng sâm, Vú chó, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm, Đảng sâm

nam, cây Đùi gà, Mằn rầy cấy (Tày), Cang hô (Mèo)

Sâm dây thuộc Chi Codonopsis

Họ Hoa chuông (Campanulaceae)

Bộ Hoa chuông (Campanulales)

Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Ngành Hạt kín (Magnoliophyta) Giới Thực vật (Plantae) [13], [16]

(Nguồn: cơ sở tài nguyên của Viện dược liệu (http://www.vienduoclieu.org.vn/)[32]

Hình 1.1 Cây Sâm dây

Sâm dây thường mọc ở ven rừng, nương rẫy đã bỏ hoang lâu ngày, trảng

cỏ tranh ở độ cao khoảng 700m trở lên đối với các tỉnh phía bắc và độ cao 1.300m đối với các tỉnh phía nam Sâm dây là loài cây ưa ẩm, ưa sáng, có thể chịu bóng, ưa mọc nơi đất tốt, nhiều mùn

Trang 13

Ở Việt Nam, Sâm dây mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc nước

ta Trước đây có nhiều ở một số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang và một số ít ở Cao Bằng và Lạng Sơn.Ở các tỉnh phía Nam, Sâm dây tập trung ở cao nguyên Langbiang (Tỉnh Lâm Đồng) và xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Glay - Kon Tum) và Quảng Nam - Đà Nẵng [5]

Trong 44 loài thuộc chi Codonopsis Việt Nam có 2 loài được mô tả và dùng làm thuốc với tên Đảng sâm Thứ nhất là loài Codonopsis pilosula (Đảng

sâm leo, Phòng Đảng sâm, Đảng sâm bắc) còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy

Codonopsis pilosula mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi Đông

Bắc và Tây Bắc Việt Nam, ở Lạng Sơn, Cao Bằng và khu Tây Bắc Thứ hai là

loài Codonopsis javanica Blume (Đảng Sâm, Kim tiền báo, Thổ Đảng Sâm,

Đảng Sâm nam) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (mèo),

có nhiều ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Yên Bái Ở miền núi người dân tộc đã trồng xen Sâm dây với ngô mang lại hiệu quả cao [4]

Sâm dây là loại dây leo thảo, sống nhiều năm Toàn cây có nhựa mủ trắng, nhất là bộ phận non và lá Rễ củ hình trụ dài, phân nhánh, nạc Lá mọc đối, có cuống, phiến lá mỏng, hình tim hoặc gần hình trứng, dài 2,0cm - 5,0cm, rộng 1,5cm - 3,5cm, mép lá khía răng cưa, mặt trên lá màu xanh nhạt, mặt dưới màu trắng xanh Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hình chuông, màu trắng, hoặc hơi vàng, họng có vân tím Lá đài 5, hình mác nhọn Tràng hoa chia thành 5 thùy tam giác nhọn Nhị 5 Bầu 5 ô Quả nang, có núm, khi chín màu tím đen Hạt nhiều, nhỏ, màu vàng nâu [16]

1.1.2

a)

Trang 14

-

3 [6], [28]

-Ngoài ra có thể trồng Sâm dây bằng đầu củ (sau khi thu hoạch rễ củ, bỏ dây, cắt lấy phần đầu củ làm giống) Cây có thể lụi vào mùa đông hoặc mùa khô (đối với các tỉnh phía nam) Đến mùa xuân hoặc đầu mùa mưa, từ gốc mọc lên 1 - 2 chồi và sinh trưởng rất nhanh [16]

Trang 15

,

-[6], [28]

Cũng chính hai tác giả Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh cũng đã công bố kết quả những nghiên cứu về hợp chất saponin có trong Sâm dây Loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm lượng saponin vào khoảng 3,12% Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã công bố về hàm lượng đường khử

Trang 16

khoảng 14,6% đối với các mẫu cây sống, và 29,5% đối với các mẫu đã qua chế biến [3]

1.1.3.2 Giá trị dƣợc liệu của cây Sâm dây

Từ xa xưa, trong y học cổ truyền, lang y đã biết dùng củ sâm phơi khô để dùng trong các bài thuốc chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe Ngày nay, với sự phát triển của khoa học, con người đã biết tách chiết riêng những thành phần có tính chất dược trong củ sâm tạo thành thuốc Công nghệ tách chiết hoạt chất đã giúp cho việc không phải sử dụng nguyên củ sâm cùng những thành phần không có công dụng chữa bệnh cũng như bồi bổ sức khoẻ

Các loài sâm nói chung cũng như Sâm dây nói riêng chứa rất nhiều hoạt chất sinh học Các hoạt chất này có nhiều tính chất dược và được sử dụng nhiều

để làm thuốc Trong các loài sâm thường chứa các hoạt chất như: terpen, acid amin, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid và hợp chất saponin là hoạt chất chính tạo nên những công dụng của nhân sâm [3]

Củ sâm đất có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, làm long đờm , nhưng với liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi Dân gian thường lấy củ sâm đất ngâm rượu uống; lá nấu canh ăn giúp giải nhiệt cơ thể, làm mát gan Canh rau sâm đất ăn có vị ngọt, hơi chua giống như rau mồng tơi, nhưng không có nhớt Sâm đất có các tác dụng trị liệu, như trong chứng viêm khớp nó giúp giảm viêm sưng và giảm đau Sâm đất còn giúp giảm táo bón Dùng sâm đất giúp giảm cơn ho và suyễn; dùng cho một số trường hợp nam giới bất lực Sâm đất được dùng nhiều trong những bệnh về da như ghẻ; dùng làm bài thuốc trị giun sán; dùng trong bệnh sỏi thận, viêm thận; giải độc cho gan Bộ phận dùng toàn cây (phần thân trên mặt đất) và rễ: Lá có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít độc (gây nôn nếu dùng liều cao) Rễ có vị ngọt, cay, tính mát Công dụng: thanh nhiệt (hạ sốt), lợi niệu, giải độc Chủ trị, toàn cây chữa tiểu đường dạng

2 Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu [5], [13]

Trang 17

Đối với các hệ cơ quan trong cơ thể, Sâm dây có tác dụng chống mệt mỏi

và tăng cường sự thích nghi của cơ thể đối với môi trường nhiệt độ cao Đối với

hệ tiêu hóa, Sâm dây có tác dụng tăng cường trương lực của hối tràng và cường

độ co bóp càng tăng nếu tăng nồng độ thuốc Đối với hệ tim mạch: làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng Đối với máu và hệ thống máu: tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đông khô mà không có tác dụng tán huyết Ngoài ra, Sâm dây còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn…[13],[31]

Các bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng Sâm dây

(1) Trị phế hư, ích phế khí, tỳ vị hư yếu, khí huyết đều suy, không có

sức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang

(2) Trị trung khí suy nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da do

huyết hư, tiêu ra máu, rong kinh

(3) Trị thiếu máu, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng

(4) Trị hư lao, nội thương, trường vị trung lãnh, hoặc tả lỵ lâu ngày, khí

suyễn, phiền khát, phát sốt, mồ hôi tự ra, băng huyết, các chứng thai sản

Một số đơn thuốc có sử dụng Sâm dây

(1) Chữa cơ thể suy yếu, mệt mỏi: Dùng Sâm dây 15 - 30g, sơn dược (củ

mài), đại táo (táo tàu), mỗi thứ 9 - 15g, sắc nước uống trong ngày

(2) Chữa ho do yếu phổi: Dùng Sâm dây tươi 30g, bách bộ 9g, sắc nước uống trong ngày

(3) Chữa sản phụ thiếu sữa: Dùng Sâm dây, đương quy, mỗi thứ 10 - 15g, hầm với thịt gà ăn Hoặc dùng Sâm dây, trái vẩy ốc (tức “quả xộp”), mỗi

vị 30g, sắc uống

(4) Chữa khí hư: Dùng Sâm dây, rễ bùng bục, mỗi thứ 15g, hải phiêu tiêu (mai cá mực) 24g, rễ rau dền gai 30g, sắc nước uống mỗi ngày trong một tháng

Trang 18

(5) Chữa trẻ nhỏ đái dầm: Dùng Sâm dây 20 - 30g, thịt lợn nạc 50 - 100g, hầm chín ăn (uống nước canh, ăn thịt)

(6) Chữa trẻ nhỏ cam tích: Dùng Sâm dây 15g, thịt lợn nạc 50 – 70g, cùng hầm chín, chia ra ăn trong ngày [13], [31]

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật

Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính

của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây Theo các công trình nghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1]

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau: (1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công tác chọn giống

(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây cảnh, cây dược liệu…

(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virus

(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai

(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1],[27]

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong

những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng cây giống tăng lên nhanh chóng trên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường toàn cầu

Trang 19

Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân

giống nào có được

Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản

xuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ

nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây Tốc độ này khoảng 36

- 1012/ năm như khoai tây từ 50 ống của ngân hàng giống thế giới sau 6 tháng nhân giống được 10 vạn cây khoai tây

Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây

Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh

vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh

Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây cũng chỉ nặng 15kg); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ 40

C trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%

Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [21]

Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô

phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống cây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩm hoàn toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mất trong

tự nhiên [21]

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng:

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng [1] Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy

Trang 20

rất khó thành công Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy là làm sạch virus cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10 mm [21]

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi

vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồi cũng giảm Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng, hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng

Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ [21]

Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên, trong thực

tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh

Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là: + Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm như dứa sợi, mía…

+ Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm)

Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phong lan, dứa, huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người

ta có thể thu được hàng triệu cá thể Do đó đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn như

ở phong lan vì có phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành (protocorm) nên nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng

Trang 21

rãi Nhờ đó mà hoa Cymdium vốn đắt trở nên có giá phải chăng và được nhiều người ưa chuộng

Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông,

bồ đề… Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây:

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ thể thực

vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được Các bộ phận đó là:

Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh… mảnh lá ở thuốc lá, cà chua, bắp cải cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…

và nhánh củ ở tỏi, hành…

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo:

Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cây cũng khá đồng đều về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Do đó nhất thiết phải sử dụng các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [14], [21], [26]

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai

đoạn sau [26]:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng

của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan để lấy

Trang 22

mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non… Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị Tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng [26]

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiến hành theo các bước:

(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn

môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro)

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các

cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ít nhất

4 lần cấy các mảnh [26]

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người

ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy Thành phần

và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 - 2 tháng tùy loài cây Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu Ví dụ, từ một đỉnh sinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên 2000

- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma Đối với các cây

Trang 23

khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu [26]

Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần [26]

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng

ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro Đối với một số loài có thể chuyển

cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [26]

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin [9], [12]

Trang 24

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [2], [12]

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin

là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [2], [12]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh vật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của

Trang 25

những lát cắt thân Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [12]

Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric axit), IAA (3-indol axetic axit), NAA (naphthalen axetic axit), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy axetic axit) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [12]

1.3.2 Cytokinin

Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt ADN [12]

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950 Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng

độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [12] Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside [12]

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein Cytokinin điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái

Trang 26

ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào [26]

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, tạo

và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là: kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [26]

1.4 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước và ngoài nước

Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm nay Nhân giống thương mại quy mô lớn

đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệu cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía mới nhập nội năng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm Công nghệ nhân giống cũng được áp dụng trên nhiều cây trồng khác nhau như dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý, các loài lan

và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả…Việc thương mại hóa các quy trình công nghệ trên đây là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng dụng công nghiệp vi nhân giống ở nước ta trong những năm tới [14]

Đối với tài nguyên cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng Nhiều loài cây thuốc đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác quá mức Với những ưu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng dụng vào bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được nhiều tác giả quan tâm như:

Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phú Lịch và cs đã tiến hành

nhân giống Thanh hao hoa vàng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro Nghiên cứu

cho thấy có thể sử dụng môi trường MS cơ bản hoặc môi trường MS bổ sung BAP 1,5 mg/l hay kinetin 1,5 mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng, môi

Trang 27

trường bổ sung NAA 0,3 mg/l là môi trường ra rễ thích hợp nhất [11] Trong một nghiên cứu khác về cây Thanh hao hoa vàng của tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên và cs (2007) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự nhân chồi là LV có

bổ sung BAP 0,3 mg/l, môi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma là LV + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l [25]

Nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh của tác giả Nguyễn Trung Thành và cs (2007) đã cho thấy môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l là tối ưu cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh; số rễ bất định hình thành cao nhất và tăng trưởng tốt ở nồng độ IBA 2 mg/l; nồng độ đường 50 g/l là tối ưu cho sự sinh trưởng của rễ bất định [22]

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2008) đã tiến hành nhân

giống vô tính in vitro cây Lô hội và thu được kết quả: Môi trường MS bổ sung

BAP 2,5 mg/l cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt Bổ sung than hoạt tính

1,5 - 2 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt [20]

Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã đưa ra môi trường

tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25 mg/l, môi

trường nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trường tạo

rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [23]

Vũ Thị Lan và cs (2011) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là: SB1 (MS + NAA 2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP); SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10% nước dừa) và SN10 (MS + NAA 2,0 mg/l + 20% nước dừa) [10] Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo để

nhân nhanh in vitro cây Hoắc hương, tác giả Vũ Thanh Sắc và cs (2012) đã đi

đến kết luận: Môi trường phù hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá và thân cây Hoắc hương là môi trường MS bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l; nồng độ than hoạt tính thích

Trang 28

hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá hoắc hương in vitro là 0,5 g/l; môi trường tái sinh

chồi từ mô sẹo cây hoắc hương tốt nhất là MS bổ sung than hoạt tính 0,5 mg/l, kinetin 1,0 mg/l [17]

Nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) đã cho thấy: môi

trường thích hợp nhất để thực hiện nhân nhanh in vitro Lan Kim Tuyến là

Knud* + BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,3 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + dịch chiết khoai tây 100 ml/l + agar 7g/l Môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh là: Knud*

+ IBA 0,5 - 1 mg/l hoặc NAA 1 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 5% + agar 7g/l [19]

Kỹ thuật nhân giống cây Sa nhân tím của Nguyễn Văn Hồng và cs (2013) đã cho thấy khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất; môi trường phù hợp cho quá trình nhân nhanh chồi là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung BAP ở nồng độ 4 mg/l kết hợp với IAA ở nồng độ 0,1 mg/l; môi trường phù hợp cho quá trình ra rễ là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung 0,1 mg/l IBA [8]

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3) lên

sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của

Nguyễn Việt Cường và cs cho thấy dịch chiết chuối ở nồng độ 10 g/l, tảo spirulina ở nồng độ 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng sinh

trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh

trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở nồng độ 2 mg/l [4]

Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu nuôi

cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng oxi hóa cao

Trang 29

nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và flavonoid, đồng thời xác

định được NAA 2 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tam thất [15]

Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng; ánh sáng đèn LED đỏ và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho

sự hình thành cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [18]

Đối với cây Sâm dây hiện nay các tài liệu nghiên cứu rất hạn chế Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu, nhất là dược liệu hoang dại

là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật Do đó việc nghiên cứu nhân giống cây Sâm dây bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn Hi vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn để có thể xác định được loại, hàm lượng của các hợp chất hóa học trong cây và tác dụng chữa bệnh của nó Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn và ứng dụng nhiều hơn của cây Sâm dây trong y học

Các nghiên cứu ngoài nước chủ yếu được thực hiện trên các loài họ hàng

của cây đảng sâm Việt Nam Codonopsis sp Do điều kiện khoa học tiến bộ nên

các khía cạnh nghiên cứu cũng rất đa dạng Slupki và đtg (2011) đã công bố về

quá trình vi nhân giống cây Codonopsis pilosula Nhóm nghiên cứu đã tìm ra

môi trường tối ưu cho sự phát sinh chồi từ chồi nách là BAP 0,1 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l số lượng chồi có thể thu được lên tới 69 chồi/ nách Tỉ lệ cây tạo rễ in vitro là 98% trong môi trường MS bổ sung IAA 0,5 mg/l [30] Peng Jin Huan và đtg (2010) đã công bố qui trình tạo mô sẹo từ lá là tốt nhất

trong các nguồn nguyên liệu đoạn thân, hạt ở Codonopsis lanceolata [29] Bên

cạnh đó còn rất nhiều nghiên cứu về xác định thành phần hóa học và công dụng

của chúng, các phương pháp chiết xuất hợp chất trong các loài Codonopsis sp

ứng dụng trong lĩnh vực y dược

Trang 30

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Sử dụng cây Sâm dây đã được khử trùng sạch bệnh do Trại thực nghiệm

sinh học Cổ Nhuế - Từ Liêm – Hà Nội cung cấp

2.1.2 Hoá chất, thiết bị

Hoá chất

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường

cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [26]

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin, NAA, IBA, nước dừa, đường sucrose, thạch, ethanol, NaOH…

Thiết bị

Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh -

Kỹ thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

Sử dụng các đoạn thân mang chồi nách của các cây Sâm dây mẫu làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ cây Sâm dây, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng

Trang 31

nền môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 25 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa

50 ml/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng Các công thức được

bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức nuôi cấy 30 mô, lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy

(1) Nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng

thuộc nhóm Cytokinin lên khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, kinetin đến khả năng nhân chồi và

sự sinh trưởng của chồi: Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với các nồng độ: 0,2 mg; 0,4 mg; 0,6 mg; 0,8 mg; 1 mg cho 1 lít môi trường hoặc kinetin với các nồng độ: 0,1 mg; 0,2 mg; 0,3 mg; 0,4 mg; 0,5 mg cho 1 lít môi trường

Đối với hai loại kích thích sinh trưởng này, chúng tôi theo dõi sau 4 tuần

và 8 tuần nuôi cấy bằng các chỉ số sau:

+ Số chồi/mẫu

+ Chiều cao của chồi

+ Chất lượng chồi:

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng

(2) Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây

trong ống nghiệm

Sử dụng chồi Sâm dây sinh trưởng tốt được tạo ra trên môi trường bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có chiều cao 4 – 5 cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung IBA với các nồng độ: 0,2 mg; 0,4 mg; 0,6 mg; 0,8 mg cho 1 lít môi trường

Kết quả được đánh giá sau 8 tuần bằng cách theo dõi các chỉ số:

+ Tỉ lệ chồi ra rễ

Trang 32

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng sự tác động của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng BAP + IBA, kinetin + IBA và BAP + kinetin + IBA đến hệ số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Chúng tôi thực hiện cấy lên môi trường

bổ sung tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP + IBA, kinetin + IBA, BAP + kinetin + IBA và theo dõi kết quả thí nghiệm sau 8 tuần qua các chỉ số sau: + Số chồi/mẫu

+ Chiều cao của chồi

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	1,75 MB