Nghiên cứu một số nhóm vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong chu trình nitơ và phospho nhằm mục đích ứng dụng để xử lý ô nhiễm môi trường

Kết quả nghiên cứu 1.1 Mô tả kết quả nghiên cứu 1.1.1 Vi khuẩn tham gia chu trình nitơ trong các mẫu nghiên cứu 1.1.1.1 Vi khuẩn ôxy hoá ammonium AOB Đa dạng vi khuẩn tham gia chu tr

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

BÁO CÁO TỔNG HỢP KÉT QUẢ THỰC HIỆN CỦA ĐỀ TÀI

Tên đề tài: Nghiên cứu một số nhóm vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong

chu trình Nitơ và Phospho nhằm mục đích ứng dụng để xử lý ô nhiễm môi trường

Chủ nhiệm đề tài: TS Đinh Thuý Hằng

Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

Đại học Quốc gia Hà nội

Hà nội, tháng 1 năm 2009

MỤC LỤC

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI……… 1

II KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA ĐỀ TÀI……… 1

1 Kết quả nghiên cứu 1.1 Mô tả kết quả nghiên cứu……….1

1.1.1 Vi khuẩn tham gia chu trình nitơ trong các mẫu nghiên cứu……… 1

1.1.1.1 Vi khuẩn ôxy hoá ammonium (AOB)……….1

1.1.1.2 Vi khuẩn khử nitrat (NRB)……… 4

1.1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ……… 7

1.1.2 Vi khuẩn tham gia chu trình phospho……… 8

1.1.2.1 Vi khuẩn tích luỹ phosphat hiếu khí……… 8

1.1.2.2 Vi khuẩn tích luỹ phosphat kỵ khí……… 11

1.2 Ý nghĩa khoa hoc của kết quả nghiên cứu……… 11

1.3 Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng kết quả khoa học……… 11

2 Các sản phẩm khoa học……… 12

3 Kết quả tham gia đào tạo sau đại học……… 12

III TÌNH HÌNH TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ……… 13

IV ĐÁNH GIÁ, KIẾN NGHỊ……… 13

1 Đánh giá về việc thực hiện đề tài……… 13

2 Về nội dung nghiên cứu tiếp của đề tài……… 13

3 Kiến nghị về quản lý, tổ chức thực hiện ở các cấp……… 13

V PHỤ LỤC: Các công trình đã hoàn thành sẽ công bố

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ THỰC HIỆN

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

trình Nitơ và Phospho nhằm mục đích ứng dụng để xử lý ô nhiễm môi trường

2 Chủ nhiệm đề tài: TS Đinh Thúy Hằng

4 Danh sách cán bộ tham gia chính:

môi trường

hóa thực phẩm

5 Thời gian thực hiện đã được phê duyệt:

6 Thời gian kết thúc thực tế: tháng 1 năm 2009

7 Kinh phí thực hiện: 60 000 000 (sáu mươi triệu đồng)

II KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA ĐỀ TÀI

1 Kết quả nghiên cứu

1.1 Mô tả kết quả nghiên cứu

1.1.1 Vi khuẩn tham gia chu trình nitơ trong các mẫu nghiên cứu

1.1.1.1 Vi khuẩn ôxy hoá ammonium (AOB)

Đa dạng vi khuẩn tham gia chu trình nitơ được nghiên cứu trên mẫu nước và bùn đại diện cho 3 dạng môi trường sinh thái khác nhau, gồm có hồ Ba Mẫu (môi trường nước ngọt), bùn đáy đầm tôm ở Quảng ninh (môi trường nước lợ) và dịch thu từ bể khí sinh học tại

nhà máy bia Thanh hóa (môi trường nhiễm hữu cơ nặng) Hai nhóm vi khuẩn được tập trung nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài là vi khuẩn ôxy hóa ammonium (AOB) và vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí khử nitrat

Kết quả phân tích cho thấy trong số các mẫu được chọn để nghiên cứu, mẫu từ

mẫu dịch từ bể xử lý kỵ khí nước thải nhà máy bia Thanh hóa hoàn toàn không có AOB Như vậy số lượng AOB tỷ lệ nghịch với nồng độ chất hữu cơ, hay nói cách khác số lượng AOB phụ thuộc rõ ràng vào nồng độ ôxy hòa tan trong các mẫu (Bảng 1)

Bảng 1 Số lượng vi khuẩn AOB và NRB trong các mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu Số lượng AOB

(tế bào/ml)

Số lượng NRB (tế bào/ml) Na-Lactat Na-Acetat Na-Benzoat

Hai mươi chủng AOB được phân lập từ các mẫu khác nhau dựa trên sự khác biệt

về đặc điểm hình thái khuẩn lạc Sau khi quan sát hình thái tế bào và đánh giá sơ bộ về khả năng sinh trưởng trên môi trường ammonium, các chủng này được phân thành 6 nhóm khác nhau (Bảng 2)

Bảng 2 Các nhóm vi khuẩn AOB phân lập được trong nghiên cứu này

STT Chủng đại diện Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường

phân lập

Sinh trưởng nhờ ôxy hóa NH 4 +

trắng đục, mỏng, kích thước 3 mm

++

màu trắng, kích thước 2 - 4 mm

++

thước 1-5 mm có 2 phần lồi, phần ngoài lồi tạo thành vòng tròn và phần giữa ướt, màu trắng

++

thước 1-5 mm, màu trắng, có 2 phần lồi, phần ngoài lồi tạo thành vòng tròn và phần giữa ướt màu sẫm

+

5 AOB 15 Khuẩn lạc tròn, lồi phần nhỏ ở giữa, riềm

nhăn, khô, kích thước 0,5 - 2,5 mm

++

màu nâu, phần riềm trắng đục, kích thước 0,5 – 2 mm

+

Hoạt tính sinh học của các chủng AOB đại diện được đánh giá thông qua xác định

sự thay đổi hàm lượng ammonium trong môi trường nuôi cấy theo thời gian Kết quả được trình bày trên biểu đồ dưới đây

0 2 4 6 8 10 12

Thời gian (h)

AOB-3 AOB-12 AOB-10 AOB-15 AOB 13 AOB-18

Hình 1 Khả năng chuyển hóa ammonium của các chủng AOB đại diện

Như vậy hoạt tính sinh học của các chủng AOB cũng rất khác nhau Hai chủng có hoạt tính cao là AOB3 và AOB15 được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phân loại dựa trên phân tích trình tự 16S rADN

Quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học, chủng AOB3 gồm các tế bào trực khuẩn ngắn (kích thước 1 2-3 m), trong khi đó chủng AOB15 gồm các tế bào trực khuẩn dài (kích thước 13-5 m) có xu hướng kết nối với nhau tạo chuỗi ở giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy (Hình 2)

Hình 2 Hình thái tế bào của hai chủng vi khuẩn AOB3 và AOB15 quan sát dưới

kính hiển vi quang học Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng vi khuẩn này cũng được tiến hành nghiên cứu, kết quả được tổng hợp trong bảng 3

Bảng 3 Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng vi khuẩn AOB3 và AOB15

Như vậy hai chủng AOB3 và AOB15 đều thuộc nhóm vi khuẩn ưa ấm điển hình Đáng chú ý là các chủng này có khả năng sinh trưởng ở dải pH rộng, đặc biệt là pH kiềm (8, 9), đây cũng là môi trường mà ammonium tồn tại ở dạng NH4+

Dựa trên trình tự 16S rADN chủng AOB3 được xếp vào chi Delftia (độ tương đồng 96% với Delftia sp.), do vậy được đặt tên là Delftia sp.; chủng AOB15 được xếp vào chi Thermomonas (độ tương đồng 96% với Thermomonas koreensis), do vậy được đặt tên

là Thermomonas sp

1.1.1.2 Vi khuẩn khử nitrat (NRB)

Khác với vi khuẩn AOB, vi khuẩn khử nitrat (NRB) có mặt với số lượng tương đối cao ở các mẫu phân tích, đặc biệt là mẫu bùn từ hồ Ba Mẫu và đầm tôm ở Quảng ninh (Hình 3) Mẫu lấy từ bể xử lý kỵ khí có số lượng NRB thấp hơn 100 lần, có thể giải thích bằng sự cạnh tranh cao của các nhóm vi sinh vật kỵ khí khác như sinh metan hay khử sulfat trong dạng môi trường này

0 100 200 300

Hồ Ba Mẫu Bể xử lý nước

thải

Đầm tôm Quảng ninh

Na-lactat Na-benzoat

Hình 3 Số lượng NRB trong các mẫu thu thập từ các môi trường sinh thái khác nhau

Thông qua phương pháp làm dãy pha loãng trên môi trường kỵ khí thạch bán lỏng, hiện tại chúng tôi đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn kỵ khí khử nitrat trên các nguồn cơ chất khác nhau (Bảng 4)

Bảng 4 NRB phân lập được trên các nguồn cơ chất khác nhau

STT Chất cho điện tử Số chủng phân lập được

Môi trường nước ngọt Môi trường nước lợ

Phân tích tính đa dạng của các chủng NRB đã phân lập bằng phương pháp RFLP

sử dụng 2 enzyme giới hạn HaeIII và MspI cho thấy phần lớn các chủng này được xếp

vào các nhóm di truyền khác nhau, không phụ thuộc vào nguồn gốc và cơ chất sử dụng để phân lập (Hình 4)

Song song với việc xác định số lượng và phân lập chủng đơn NRB, chúng tôi tiến hành nuôi tích lũy nhóm vi khuẩn này trên hai nguồn cơ chất khác nhau là Na-lactat và Na-benzoat đối với mẫu đáy từ hồ Ba Mẫu (là mẫu tự nhiên có số lượng NRB cao nhất)

để nghiên cứu sự thay đổi của quần thể NRB qua các bước nuôi tích lũy và đa dạng loài trong các mẫu này Cấu trúc quần thể trong các mẫu làm giàu được phân tích bằng phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rADN (Hình 5)

Hình 4 Phổ điện di 16S rADN của 12 chủng NRB sau khi xử lý bằng enzym giới hạn MspI và

HaeIII trong phân tích RFLP

Hình 5.Phổ băng điện di biến tính (DGGE) của các mẫu nuôi tích lũy và các chủng đơn NRB (A) Na-lactat: L0-L2 là kí hiệu các mẫu nuôi tích lũy; LF1, LF3, LF4, N1, N2, N3, LB2,

LB4 là kí hiệu các chủng đơn (B) Na-benzoat: B0-B2 là kí hiệu các mẫu nuôi tích lũy;

BF1, BF3, BB2, BB3 là kí hiệu các chủng đơn 1-18: tên các băng điện di

Kết quả thu được cho thấy một số nhóm vi khuẩn đã được tích luỹ trong quá trình làm giàu (được thể hiện bằng các băng điện di ở lần làm giàu cuối cùng) Hai chủng LF1 (băng điện di số 8) và BB3 (băng điện di số 14) đại diện cho các nhóm vi khuẩn đã được làm giàu trên hai nguồn cơ chất khác nhau là Na-lactat và Na-benzoat được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu sâu về khả năng ứng dụng

Xác định hoạt tính khử nitrat của hai chủng này theo thời gian (với nguồn cơ chất tương ứng là Na-lactat và Na-benzoat) (Hình 6) cho thấy tốc độ khử ở chủng LF1 cao hơn

rõ rệt so với chủng BB3 Tuy nhiên điều này có thể do sự khác nhau về cơ chất dẫn đến, benzoat là hợp chất có vòng thơm, khó bị ôxy hoá hơn so với lactat Ở cả hai chủng, hoạt tính khử nitrat cao nhất trong 5 ngày đầu nuôi cấy Cả hai chủng đều có tiềm năng ứng dụng trong việc xử lý nguồn thải nhiễm nitrat cao

LF1 LF3 LF4 N1 N2 N3 LB2 LB4 BF1 BF3 BB2 BB3 M

HaeIII

M LF1 LF3 LF4 N1 N2 N3 LB2 LB4 BF1 BF3 BB2 BB3

MspI

1000

bp

1500

500

100

L0 L1 L2 LF1 LF3 LF4 N1 N2 N3 LB2 LB4 B0 B1 B2 BF1 BF3 BB2 BB3

1 2

3 4

5

6 7

8

9

16

18

17

15

14

10

12

11

13

6

8 8 8

9

11 11

14 14

0.000 0.700 1.400 2.100 2.800 3.500 4.200

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

Thời gian (h)

LF1 BB3

Hình 6 Khả năng khử nitrat của hai chủng LF1 và BB3

So sánh trình tự 16S rADN cho phép đặt tên chủng LF1 là Ochrobactrum sp (loài gần nhất là Ochrobactrum cytisi, 99% tương đồng) và chủng BB3 là Paracoccus sp (loài gần nhất là Paracoccus sp KS-11, 96% tương đồng) Cả hai chi Ochrobactrum và

Paracoccus đều thuộc lớp α - Proteobacteria và được biết đến với nhiều loài có khả năng

hô hấp với nitrat trong điều kiện không có ôxy

1.1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ

Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn cố định nitơ trong môi trường rừng ngập mặn, là môi trường còn ít được nghiên cứu về nhóm

vi sinh vật này Mẫu trầm tích để nghiên cứu được thu thập tại rừng phòng hộ Cần Giờ,

Tp HCM Để đánh giá mức đa dạng của vi khuẩn cố định nitơ chúng tôi đã sử dụng

phương pháp thiết lập và đánh giá thư viện gen nifH mã cho dinitrogenase reductase của

phức hợp enzyme nitrognase Phương pháp này cho phép đánh giá sự đa dạng không qua bước phân lập và nuôi cấy chủng đơn, đồng thời cho phép phát hiện những loài hiện còn chưa phân lập được trong phòng thí nghiệm

Hai thư viện gen nifH với 60 clone trong mỗi thư viện đã được thiết lập đối với

mẫu trầm tích bề mặt và mẫu trầm tích ở độ sâu dưới 5 cm Kết quả phân tích thư viện gen cho thấy mức đa dạng cao của vi sinh vật cố định nitơ trong cả hai mẫu (Hình 7) Khác với quần thể các vi sinh vật cố định nitơ trong khu hệ rễ lúa hay cây họ đậu (do các

loài hiếu khí như Rhizobium, Agrobacterium chiếm ưu thế), quần thể vi sinh vật cố định nitơ tại rừng ngập mặn do các loài kỵ khí Desulfovibrio, Geobacter chiếm ưu thế Tuy nhiên các loài quang dưỡng như Cyanobacteria, Rhodobacter lại không tìm thấy tại đây

Hình 7 Đa dạng vi khuẩn cố định nitơ trong mẫu bùn tại rừng ngập mặn Cần giờ theo

phương pháp phân tích thư viện gen nifH

1.1.2 Vi khuẩn tham gia chu trình phospho

Nhóm vi khuẩn tham gia chu trình phospho được nghiên cứu trong đề tài này là vi khuẩn

có khả năng tích lũy phospho dưới dạng polyphosphat trong tế bào (hay còn gọi là vi khuẩn poly P) Vi khuẩn polyP bao gồm cả các loài hiếu khí và kỵ khí, có vai trò trong các pha xử lý khác nhau của chu trình xử lý nước thải

1.1.2.1 Vi khuẩn tích luỹ phosphat hiếu khí

Để phân lập các chủng polyP hiếu khí, chúng tôi tiến hành nuôi tích lũy trên môi trường khoáng có nồng độ phosphat cao (10 mM Ca3(PO4)2), sau đó phân lập trên môi trường thạch đĩa tương ứng Ba chủng ký hiệu là FW-Pp2, FW-Pp4 và FW-Pp5 được phân lập và tinh sạch Khả năng tích lũy phosphat của các chủng được đánh giá một cách định tính thông qua phương pháp nhuộm tế bào bằng dung dịch toluidin xanh, cho phép phát hiện các hạt dự trữ poly P phân biệt với các cấu trúc khác của tế bào dưới kính hiển vi quang học (Hình 8) Các chủng có tỷ lệ tế bào chứa hạt polyphosphat cao sau 48 h nuôi cấy được

0%

10%

20%

30%

40%

0%

10%

20%

30%

40%

0 – 5 cm

5 – 15 cm

coi là các chủng có hoạt tính cao Trong số 3 chủng đã phân lập, chủng FW-Pp5 thể hiện khả năng tích luỹ phosphat kém hơn cả, hai chủng còn lại được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

Hình 8 Tế bào vi khuẩn FW-Pp2 sau khi nhuộm toluidine blue

Khả năng tích luỹ phoshat của hai chủng hiếu khí FW-Pp2 và FW-Pp4 được đánh giá một cách định lượng thông qua phương pháp xác định sự thay đổi của nồng độ phosphat trong môi trường nuôi cấy (Hình 9)

0 50 100 150 200 250

Thời gian (h)

FW4 FW2 Control

Hình 9 Sự thay đổi nồng độ phosphat trong môi trường nuôi cấy của hai chủng

FW-Pp2 và FW-Pp4

Như vậy khi có mặt vi khuẩn Poly-P (chủng FW-Pp2 và FW-Pp4), nồng độ phosphat trong môi trường nuôi cấy giảm rõ rệt so với đối chứng không có vi sinh vật

Đặc biệt trong trường hợp chủng FW-Pp2, nồng độ phosphat giảm tới trên 90% sau 2 ngày nuôi cấy Đây là những kết quả trong phòng thí nghiệm cho thấy khả năng ứng dụng các chủng vi khuẩn đang nghiên cứu vào việc loại phosphat từ nguồn ô nhiễm bên ngoài

Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng FW-Pp2 và FW-Pp4 cũng được xác định để làm cơ sở cho việc kiểm soát hoạt động của chúng khi được đưa ra môi trường (Bảng 5) Kết quả cho thấy cả hai chủng đều có khả năng sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ, độ pH và nồng độ muối thay đổi trong biên độ lớn, đây là một trong những yếu tố thuận lợi tạo điều kiện sống sót và cạnh tranh cao của chúng khi được đưa ra môi trường bên ngoài

Bảng 5 Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng vi khuẩn FW-Pp2 và FW-Pp4

Về hình thái, cả hai chủng FW-Pp2 và FW-Pp4 đều gồm các tế bào trực khuẩn ngắn (Hình 10), chuyển động chậm trong môi trường dịch thể

Hình 10 Hình thái tế bào của hai chủng vi khuẩn tích luỹ phosphat Pp2 và

FW-Pp4 quan sát dưới kính hiển vi quang học

So sánh trình tự 16S rADN cả hai chủng này đều được xếp vào chi Bacillus (loài gàn gũi nhất là B subtilis, độ tương đồng là 97% và 96% tương ứng) Hai chủng vi khuẩn polyP này do vậy được đặt tên là Bacillus sp FW-Pp2 và Bacillus sp FW-Pp4

1.1.2.2 Vi khuẩn tích luỹ phosphat kỵ khí

Song song với vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn polyP kỵ khí khử nitrat cũng được nuôi tích tũy trong môi trường khoáng chứa nitrat làm chất nhận điện tử, sau đó phân lập trên ống môi trường thạch bán lỏng Bằng các phương pháp này, 4 chủng polyP kỵ khí khử nitrat đã được phân lập, trong đó hai chủng có nguồn gốc từ môi trường nước ngọt (FW-PN2 và FW-PN7) và hai chủng có nguồn gốc tư môi trường nước lợ ((FW-PN2 và BW-PN9) Tuy nhiên thí nghiệm xác định khả năng tích luỹ phosphat định tính thông qua phép nhuộm toluidin blue đối với cả 4 chủng này chưa cho kết quả dương tính

1.2 Ý nghĩa khoa hoc của kết quả nghiên cứu

Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các nhóm vi khuẩn chính tham gia hai chu trình nitơ và phospho ở 3 dạng môi trường đại diện là nước ngọt, nước lợ và nước nhiễm hữu cơ cao Kết quả thu được của đề tài đã thể hiện một số điểm mới so với các nghiên cứu đã tiến hành trước đây như sau:

- Áp dụng một số phương pháp sinh học phân tử (như RFLP, DGGE, thiết lập và phân tích thư viện gen) để nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật mà không thông qua bước phân lập

- Xác định được tính đa dạng cao của các nhóm tham gia chu trình nitơ, đặc biệt là

vi khuẩn khử nitrat và vi khuẩn cố định nitơ Bên cạnh đó cũng xác định được các nhóm chiếm ưu thế đối với mỗi nhóm chức năng

- Bằng phương pháp vi sinh truyền thống đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn ôxy hoá ammonium, khử nitrat và tích luỹ phosphat đại diện

- Đã xác định được hoạt tính sinh học, nghiên cứu điều kiện sinh trưởng cũng như đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn đã phân lập nhằm đánh giá khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý ô nhiễm môi trường

1.3 Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng kết quả khoa học

Nitơ và phospho là hai yếu tố hoá học quan trọng đối với mỗi quá trình xử lý ô nhiễm Việc làm cân bằn hai yếu tố này cùng với các yếu tố xử lý khác như nguồn cacbon, ôxy, quyết định thành công của quá trình xử lý Trên cơ sở đó, những kết quả thu được trong nghiên cứu này có một số ý nghĩa quan trong sau: