TOÀN VĂN NGHIÊN cứu hóa học cây THUỐC VIỆT NAM có HOẠT TÍNH KHÁNG tế bào KHỐI u THỰC NGHIỆMCÂY tô mộc (CAESALPINIA SAPPAN l ) và cây hà THỦ ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR ) MERR )

Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, trong luận án này, chúng tôi giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



BÙI XUÂN HÀO

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT

(CAESALPINIA SAPPAN L.) VÀ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR.) MERR.)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01

Phản biện 1: PGS TS TRẦN HÙNG Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẠNH Phản biện 3: GS TS NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Phản biện độc lập 1: PGS TS PHẠM THÀNH QUÂN Phản biện độc lập 2: PGS TS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS TS TRẦN LÊ QUAN

2 GS TS NGUYỄN MINH ĐỨC

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, người ta biết được rằng, ung thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo, và sự di căn của tế bào ung thư là nguyên nhân gây ra tử vong cho bệnh nhân Thông thường, ung thư được điều trị bởi phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sau khi điều trị, các khối u vẫn tiếp tục phát triển và

di căn do các tế bào ung thư không bị tiêu diệt hoàn toàn Các tia phóng xạ và hầu hết các thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến các tế bào lành của cơ thể; chúng cũng thường gây ra những hậu quả nghiêm trọng như

rụng tóc, ức chế sự hoạt động của tủy xương, gây nôn mửa Vì thế, các loại thuốc

hỗ trợ điều trị ung thư hữu hiệu vẫn đang được tìm kiếm Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u vẫn đang được sử dụng và cho kết quả điều trị tốt, chẳng hạn như các alkaloid từ cây dừa cạn, taxol từ cây thông đỏ, các alkaloid từ cây trinh nữ hoàng cung Năm 2011, tác giả Marie Jensen

cardenolid và hợp chất bán tổng hợp từ các dẫn xuất cardenolid là các hợp chất mới dùng để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư phổi

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa nên có nguồn dược liệu dồi dào và phong phú Y học cổ truyền Việt Nam từ lâu đã dùng cây cỏ để trị nhiều chứng bệnh khác nhau Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, trong luận án này, chúng tôi giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất tinh khiết cô lập được từ rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc, là hai cây thuốc đã được các nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản khảo sát, đã cho thấy là có độc tính mạnh đối với các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung…

Nội dung chính của luận án bao gồm:

- Cô lập các hợp chất tinh khiết từ rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được

- Thử nghiệm độc tính tế bào trên các hợp chất tinh khiết cô lập được

CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

brps : mũi giả đơn bầu (broad pseudosinglet)

(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

(H-H Correlation Spectroscopy)

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

Trang

 DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây hà thủ ô trắng 3

Hình 1.2 Rễ cây hà thủ ô trắng 3

Hình 1.3 Hóa học lập thể của khung cardenolid 13

Hình 1.4 Quả tô mộc 15

Hình 1.5 Thân cây tô mộc 15

Hình 3.1 Hóa học lập thể tại C-3 của hợp chất cardenolid 42

Hình 3.2 Hóa học lập thể của hợp chất H1 46

Hình 3.3 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H1 48

Hình 3.4 Hóa học lập thể của hợp chất H2 50

Hình 3.5 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H2 50

Hình 3.6 Hóa học lập thể của hợp chất H3 54

Hình 3.7 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H3 55

Hình 3.8 Hóa học lập thể của hợp chất H4 58

Hình 3.9 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H4 58

Hình 3.10 Hóa học lập thể của hợp chất H5 62

Hình 3.11 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H5 64

Hình 3.12 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H6 69

Hình 3.13 Tương quan H-H ROESY quan trọng của H6 70

Hình 3.14 Hóa học lập thể của hợp chất H7 73

Hình 3.15 Tương quan HMBC quan trọng của H7 74

Hình 3.16 Hóa học lập thể của hợp chất H8 77

Hình 3.17 Tương quan HMBC và COSY quan trọng của H8 78

Hình 3.18 Tương quan HMBC và H-H COSY quan trọng của H9 80

Hình 3.19 Hóa học lập thể của hợp chất H9 81

Hình 3.20 Hóa học lập thể của hợp chất H10 85

Hình 3.21 Tương quan HMBC quan trọng của H10 85

Hình 3.22 Hóa học lập thể của hợp chất H11 88

Hình 3.23 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H11 90

Hình 3.24 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H12 92

Hình 3.25 Tương quan H-H ROESY quan trọng của H12 93

Hình 3.26 Hóa học lập thể của hợp chất H13 97

Hình 3.27 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H13 97

Hình 3.28 Hóa học lập thể của hợp chất H14 102

Hình 3.29 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H14 103

Hình 3.30 Hóa học lập thể của hợp chất H15 105

Hình 3.31 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H15 107

Hình 3.32 Hóa học lập thể của hợp chất H16 109

Hình 3.33 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H16 111

Hình 3.34 Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của T1 114

Hình 3.35 Cấu trúc hợp chất sappanon A (T2) 115

Hình 3.36 Cấu trúc hợp chất sappanon B (T3) 117

Hình 3.37 Cấu trúc hợp chất 3-deoxysappanon B (T4) 120

Hình 3.38 Cấu trúc hợp chất brazilin (T5) 122

Hình 3.39 Tương quan HMBC quan trọng của T6 124

Hình 3.40 Hỗn hợp hai xuyên lập thể phân T6 và T7 126

Hình 3.41 Hóa học lập thể các aglycon 127

Hình 3.42 Cấu trúc hóa học các đơn vị đường 129

Hình 3.43 Cấu trúc hóa học các hợp chất phenol 132

 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Cô lập các hợp chất có trong rễ cây hà thủ ô trắng 36

Sơ đồ 2.2 Cô lập các hợp chất có trong lõi gỗ thân cây tô mộc 37

Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát độc tính tế bào bằng phương pháp SRB 40

 DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp chất đã được cô lập từ rễ cây hà thủ ô trắng 4

Bảng 1.2 Các hợp chất đã được cô lập từ rễ cây Streptocaulon tomentosum và Streptocaulon griffithii 8

Bảng 1.3 Các hợp chất được cô lập từ lõi gỗ thân cây tô mộc 17

Bảng 1.4 Các hợp chất được cô lập từ hạt quả cây tô mộc 22

Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao clorofom rễ củ hà thủ ô trắng 30

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột phân đoạn C-II của cao clorofom 31

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột pha đảo phân đoạn C-IIB 31

Bảng 2.4 Kết quả sắc ký cột phân đoạn C-IIB3 31

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột pha đảo phân đoạn C-IIC 31

Bảng 2.6 Kết quả sắc ký cột pha đảo phân đoạn C-IIC2 32

Bảng 2.7 Kết quả sắc ký cột phân đoạn C-IIC2Y 32

Bảng 2.8 Kết quả sắc ký cột Diaion HP-20 dịch sệt nước rễ củ hà thủ ô trắng 32

Bảng 2.9 Kết quả sắc ký cột phân đoạn H-III 33

Bảng 2.10 Kết quả sắc ký cột phân đoạn IIIB 33

Bảng 2.11 Kết quả sắc ký cột pha đảo phân đoạn IIIB2 33

Bảng 2.12 Kết quả sắc ký cột phân đoạn IIIB2Y 33

Bảng 2.13 Kết quả sắc ký cột cao etyl acetat lõi gỗ thân cây tô mộc 34

Bảng 2.14 Kết quả sắc ký cột phân đoạn TM-IV 35

Bảng 2.15 Kết quả sắc ký cột pha đảo phân đoạn TM-IVC 35

Bảng 2.16 Kết quả sắc ký cột phân đoạn TM-IVC2 35

Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR của H1 và digitoxigenin 47

Bảng 3.2 So sánh số liệu phổ NMR của H2 và digitoxigenin 3-O--glucopyranosid 51

Bảng 3.3 So sánh số liệu phổ NMR của H3 và digitoxigenin 3-O--gentiobiosid 54

Bảng 3.4 So sánh số liệu phổ NMR của H4 và digitoxigenin -D-sophorosid 59

Bảng 3.5 So sánh số liệu phổ NMR của H5 và dẫn xuất cardenolid 63

Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của H6 68

Bảng 3.7 So sánh số liệu phổ NMR của H7 và acovenoxigenin A 72

Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của H8 76

Bảng 3.9 So sánh số liệu phổ NMR của H9, acovenosigenin A 3-O-digitalosid và periplogenin 3-O-(4-O--glucopyranosyl- -digitalopyranosid) 82

Bảng 3.10 So sánh số liệu phổ NMR của H10 và periplogenin 86

Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của H11 và periplogenin glucopyranosid 89

Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của H12 94

Bảng 3.13 So sánh số liệu phổ NMR của H13 và periplogenin 3-O- -D-digitoxopyranosyl-(14)-O--D-glucopyranosid 98

Bảng 3.14 So sánh số liệu phổ NMR của H14 và periplogenin-3-O-β-cymaropyranosyl-(14)-O--D-glucopyranosid 101

Bảng 3.15 So sánh số liệu phổ NMR của H15 và periplogenin-3-O-β-digitalopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosid 106

Bảng 3.16 So sánh số liệu phổ NMR của H16 và periplogenin 3-O-β-(2-O-acetyl) digitalopyranosyl-(14)- β-D-glucopyranosid 110

Bảng 3.17 So sánh số liệu phổ NMR của T1 và sappanchalcon 113

Bảng 3.18 So sánh số liệu phổ NMR của T2 và sappanon A 115

Bảng 3.19 So sánh số liệu phổ NMR của T3 và sappanon B 117

Bảng 3.20 So sánh số liệu phổ NMR của T4 và 3-deoxysappanon B 119

Bảng 3.21 So sánh số liệu phổ NMR của T5 và brazilin 121

Bảng 3.22 So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất T6, T7 và protosappanin B, isoprotosappanin B 125

Bảng 3.23 Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào trên các dòng ung thư phổi

NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư vú MCF–7 134

Bảng 3.24 Giá trị IC50 gây độc tế bào trên dòng ung thư phổi NCI–H460 135

Bảng 3.25 So sánh giá trị IC50 gây độc tế bào trên dòng ung thư phổi

NCI–H460 và trên dòng ung thư phổi A549 138

Bảng 3.26 So sánh thu suất cô lập các hợp chất cardenolid 139 Bảng 3.27 So sánh thu suất cô lập các hợp chất phenol 141

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VÀI NÉT CHUNG VỀ CHI STREPTOCAULON 2

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI STREPTOCAULON 4

1.2.1 Thành phần hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng 4

1.2.2 Thành phần hóa học các cây thuộc chi Streptocaulon 8

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG 11

1.3.1 Tính chất dược lý 11

1.3.2 Hoạt tính sinh học 11

1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ HỢP CHẤT CARDENOLID 12

1.4.1 Đại cương 12

1.4.2 Hóa học lập thể của dẫn xuất cardenolid 13

1.4.2.1 Hóa học lập thể của khung aglycon 13

1.4.2.2 Các đơn vị đường có trong dẫn xuất cardenolid 13

1.5 VÀI NÉT CHUNG VỀ CHI CAESALPINIA 14

1.6 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC 14

1.6.1 Thành phần hóa học của lõi gỗ thân cây tô mộc 14

1.6.2 Thành phần hóa học của hạt quả cây tô mộc 22

1.7 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC 23

1.7.1 Tính chất dược lý 23

1.7.2 Hoạt tính sinh học 23

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Phương pháp cô lập các hợp chất 26

2.1.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 26

2.1.3 Phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào 26

2.2 THỰC NGHIỆM 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 41

3.2 PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN CỦA DẪN XUẤT CARDENOLID 41

3.2.1 Phổ 1H và 13C-NMR của khung aglycon 41

3.2.2 Phổ 1H và 13C-NMR của các đơn vị đường 43

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT 44

3.3.1 Hợp chất H1 44

3.3.2 Hợp chất H2 48

3.3.3 Hợp chất H3 52

3.3.4 Hợp chất H4 56

3.3.5 Hợp chất H5 60

3.3.6 Hợp chất H6 65

3.3.7 Hợp chất H7 71

3.3.8 Hợp chất H8 74

3.3.9 Hợp chất H9 78

3.2.10 Hợp chất H10 83

3.3.11 Hợp chất H11 86

3.3.12 Hợp chất H12 90

3.3.13 Hợp chất H13 95

3.3.14 Hợp chất H14 99

3.3.15 Hợp chất H15 103

3.3.16 Hợp chất H16 107

3.3.17 Hợp chất T1 112

3.3.18 Hợp chất T2 114

3.3.19 Hợp chất T3 116

3.3.20 Hợp chất T4 118

3.3.21 Hợp chất T5 120

3.3.22 Hỗn hợp T6 và T7 122

3.4 NHẬN XÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM PHỔ NMR CỦA CÁC HỢP CHẤT CARDENOLID THUỘC LOÀI STRETOCALON JUVENTAS 126

3.4.1 Đặc điểm của khung aglycon 126

3.4.1.1 Đặc điểm về hóa học lập thể 126

3.4.1.2 Đặc điểm phổ NMR của khung aglycon 127

3.4.2 Đặc điểm phổ NMR của các đơn vị đường 128

3.5 NHẬN XÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM PHỔ NMR CỦA CÁC HỢP CHẤT PHENOL THUỘC LOÀI CAESALPINIASAPPAN LINN 131

3.6 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 134

3.6.1 Hoạt tính gây độc tế bào 134

3.6.2 Nhận xét về hoạt tính gây độc tế bào 135

3.7 NHẬN XÉT VỀ THU SUẤT CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 139

3.7.1 Nhận xét về thu suất cô lập các hợp chất cardenolid 139

3.7.2 Nhận xét về thu suất cô lập các hợp chất phenol 141

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 142

TÀI LIỆU THAM KHẢO 147

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 155 PHỤ LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VÀI NÉT CHUNG VỀ CHI STREPTOCAULON

Chi Streptocaulon thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) gồm năm loài, được phân

bố khắp Đông Nam Á, gồm có Streptocaulon juventas (Lour.) Merr.,

Streptocaulon griffithii Hook f., Streptocaulon horsfieldii Miq., Streptocaulon kleinii W  Arn và Streptocaulon Wallichii Wight.[4]

Năm 2004, Myint Myint

Khine đã xác định tên và nghiên cứu thành phần hóa học của loài Streptocaulon

tomentosum cũng thuộc chi Streptocaulon.[41], [42] Theo Phạm Hoàng Hộ,[4] Võ

(Lour.) Merr., Streptocaulon horsfieldii Miq và Streptocaulon kleinii W  Arn Cây hà thủ ô trắng có tên khoa học là Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., thuộc

họ Thiên lý (Asclepiadaceae), còn được gọi là cây hà thủ ô nam, dây sữa bò, củ

đến 5 m, thân và cành có màu hơi đỏ hay nâu đỏ, có rất nhiều lông Lá hà thủ ô mọc đối nhau, có hình trứng ngược, gốc tròn hoặc hơi hình nón cụt, mặt trên có màu xanh sẫm, ít lông, mặt dưới trắng nhạt, có phủ lông rất mịn Phiến lá dài

Hoa có màu nâu nhạt hoặc vàng tía, mọc thành xim Quả hà thủ ô lớn, tách đôi ngang ra trông như sừng bò, có dạng hình thoi, màu xám, dài khoảng 7 đến 11

cm, rộng khoảng 8 mm Hạt quả hà thủ ô dẹt, phồng ở lưng, dài khoảng 5 đến 7

Ở Việt Nam, hà thủ ô trắng mọc hoang ở các vùng đất cao, đồi núi, rừng thứ sinh, mọc nhiều ở các tỉnh miền núi và trung du như Bắc Giang, Hòa Bình, Thái

vùng Tịnh Biên tỉnh An Giang, cây mọc hoang trên các đồi núi và nương rẫy

Hình 1.1 Cây hà thủ ô trắng thu hái tại ấp Phú Hòa, xã An Phú,

huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2007

Hình 1.2 Rễ cây hà thủ ô trắng thu hái tại ấp Phú Hòa, xã An Phú,

huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2007

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI STREPTOCAULON

Các cây thuộc chi Streptocaulon ít được nghiên cứu mặc dù từ lâu chúng đã được

dùng làm thuốc trong y học cổ truyền Cho đến nay, chỉ thấy có ba loài là

Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., Streptocaulon tomentosum và Streptocaulon griffithii Hook f đã được nghiên cứu về thành phần hóa học.[24],

[41], [42], [60], [68]

1.2.1 Thành phần hóa học của rễ cây hà thủ ô trắng

Năm 2002, Tam và cộng sự đã cô lập từ rễ cây hà thủ ô trắng các hợp chất

đã cô lập được từ rễ cây hà thủ ô trắng mười

18, 19; hai hợp chất hemiterpenoid là 20, 21; hai hợp chất phenylpropanoid là 22,

23 và một hợp chất phenyletanoid là 24

hợp chất là 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31

Các hợp chất cô lập được từ rễ cây hà thủ ô trắng được ghi trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các hợp chất đã được cô lập từ rễ cây hà thủ ô trắng

10 Digitoxigenin 3-O-[O--D-glucopyranosyl-(16)-O-

Các hợp chất dẫn xuất cardenolid

Hợp chất hemiterpenoid

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Streptocaulon tomentosum và Streptocaulon griffithii Hook f

Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy các hợp chất chủ yếu cô lập được từ các cây thuộc chi Streptocaulon là các dẫn xuất cardenolid, các hợp chất khác như

4)-2-O-acetyldigitalopyranosid

Dưới đây là cấu trúc của các hợp chất đã được cô lập từ cây Streptocaulon

tomentosum và Streptocaulon griffithii

Như vậy, các kết quả nghiên cứu trước đây về chi Streptocaulon đã cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của các rễ cây thuộc chi này là các hợp chất dẫn xuất

cardenolid, có các nhóm OH thường gắn ở vị trí C-3, C-14, còn nhóm OH ở C-5

có thể có hoặc không Các hợp chất glycosid có phần đường thường gắn vào vị trí C-3 của khung aglycon

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG

1.3.1 Tính chất dƣợc lý

ô trắng để chữa trị nhiều chứng bệnh khác nhau như cảm mạo, sốt, viêm ruột, tiêu chảy, viêm thận mạn tính; chữa các bệnh thận, gan yếu, chứng thiếu máu, thần kinh suy nhược, ăn ngủ kém, sốt rét kinh niên, phong thấp, tê bại, đau nhức gân xương, phụ nữ kinh nguyệt không đều, tiêu trừ nọc rắn, bệnh tóc bạc sớm

Rễ hà thủ ô trắng còn được sắc để uống, chữa cảm sốt, làm thuốc lợi sữa Lá cây

hà thủ ô đun với nước dùng để tắm trị các chứng lở ngứa Ngoài ra, rễ hà thủ ô

1.3.2 Hoạt tính sinh học

đã thử nghiệm hoạt tính hạ lipid huyết của cao chiết etanol rễ cây hà thủ ô trắng trên chuột nhắt trắng Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết etanol 70% của rễ cây hà thủ ô trắng có tác dụng làm giảm cholesterol xấu

thuốc Việt Nam Kết quả sàng lọc sơ bộ cho thấy dịch chiết metanol của rễ củ hà thủ ô trắng có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào khối u ác tính dạng sợi sarcoma HT-1080 ở người, tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ở người, ung thư ruột kết 26-L5, ung thư phổi ở chuột

đã thử nghiệm độc tính tế bào của mười sáu hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết cô lập được từ dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng, trên các dòng tế bào ung thư, như tế bào khối u ác tính dạng sợi sarcoma HT-1080, ung thư phổi A549, ung thư cổ tử cung HeLa ở người, tế bào ung thư biểu mô 26-L5, ung thư phổi Lewis, tế bào khối u ác tính B16-BL6 ở

chuột Thử nghiệm của Ueda cho thấy các hợp chất dẫn xuất cardenolid 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 cô lập được từ rễ củ hà thủ ô trắng, có

hoạt tính ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào khối u ác tính dạng sợi sarcoma

đã khảo sát độc tính tế bào của dịch chiết cao

Nam của Trung Quốc Tác giả cũng khảo sát độc tính của các phân đoạn thu

được từ quá trình sắc ký cao này trong cả hai thử nghiệm in vitro (đối với dòng tế bào ung thư phổi A549), và in vivo (trên chuột đã được tiêm tế bào ung thư phổi

7,82 g/ml; còn phân đoạn có độc tính tế bào mạnh nhất điều chế được từ cao etanol 75% (phân đoạn thu được với hệ dung môi giải ly diclorometan : metanol,

đã được tiêm tế bào ung thư phổi A549 của Na Han cho thấy sau thời gian 10 ngày, kể từ lúc bắt đầu điều trị bằng cách tiêm dịch chiết của phân đoạn có độc tính tế bào mạnh nhất vào chuột, khi soi dưới kính hiển vi, cho thấy hầu hết các

tế bào ung thư phổi A549 đã bị tiêu diệt bởi các thực bào Bằng phương pháp sắc

ký trên phân đoạn có độc tính tế bào mạnh nhất, Na Han đã cô lập được ba hợp chất dẫn xuất cardenolid, là thành chính có trong phân đoạn này, gồm digitoxigenin, periplogenin và periplogenin glucopyranosid Từ đó tác giả kết luận rằng, các hợp chất này đóng vai trò chủ yếu trong việc ức chế sự phát triển

tế bào ung thư phổi A549 ở chuột

1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ HỢP CHẤT CARDENOLID

1.4.1 Đại cương

Cardenolid là dẫn xuất của steroid gồm 23 carbon, có hoạt tính đối với các chức năng của tim, nên các glycosid có aglycon là khung cardenolid còn được gọi là

C-17 Sự liên hợp của vòng A và B thường gặp ở dạng cis, còn dạng liên hợp

trans của vòng A và B ít gặp hơn

Trong tự nhiên, các hợp chất cardenolid thường thấy hiện diện trong các loài thuộc các họ như: Asclepiadaceae, Apocynaceae, Scrophulariaceae, Celastraceae, Iridaceae, Liliaceae, Ranunculaceae, Scrophulariaceae và Tiliaceae Các glycosid tim đã được dùng hàng trăm năm nay để trị suy tim

1.4.2 Hóa học lập thể của dẫn xuất cardenolid

1.4.2.1 Hóa học lập thể của khung aglycon

Trong tự nhiên, các hợp chất dẫn xuất cardenolid cô lập được từ thực vật có các

1.4.2.2 Các đơn vị đường có trong dẫn xuất cardenolid

Một số loại đường thường hiện diện trong các dẫn xuất cardenolid cô lập được từ chi Streptocaulon là β-D-glucopyranose, β-D-digitoxopyranose, β-D-

1.5 VÀI NÉT CHUNG VỀ CHI CAESALPINIA

Chi Caesalpinia có khoảng 100 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới châu Á, châu Phi và châu Mỹ Ở Việt Nam có khoảng 20 loài và được coi là

Cây tô mộc có tên khoa học là Caesalpinia sappan L., thuộc họ Đậu

Tô mộc là loại cây thân gỗ, cứng Thân mọc thẳng, cao từ 7 đến 10 m, có nhiều cành Thân và cành có nhiều gai, cành non có lông mịn, cành già nhẵn, không có lông Gỗ rắn, chắc, có màu vàng hơi đỏ Lá tô mộc có hình dạng lá kép lông chim, mọc so le, gồm 9 đôi cuống lá phụ, mỗi cuống phụ có 12 đôi lá chét hoặc nhiều hơn, lá dài khoảng 12 đến 20 mm, rộng khoảng 6 đến 7 mm, gốc lá cụt, đầu lá tròn, mặt lá

có gân chính chéo, lá nhẵn ở mặt trên, có lông mịn ở mặt dưới Cuống lá dài khoảng 50 cm, có ít gai ngắn Hoa có 5 cánh màu vàng mọc thành chùm, nhị hơi lồi ra, bầu hoa phủ đầy lông xám Quả rất cứng, dai, dày, dài khoảng 5 đến 6 cm, rộng khoảng 3 đến 4 cm, hình dạng giống con dao bầu, có sừng nhọn ở đầu, bên

Cây tô mộc ra hoa trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 6 Cây được trồng hoặc mọc hoang dại ở hầu hết các nước như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia Ở Việt Nam, cây tô mộc thường mọc hoang trên nương rẫy Cây tô mộc thường được người dân trồng làm hàng rào

1.6 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC

1.6.1 Thành phần hóa học của lõi gỗ thân cây tô mộc

Các nghiên cứu trước đây cho thấy lõi gỗ thân cây tô mộc có chứa các hợp chất

Hình 1.4 Quả tô mộc thu hái tại ấp Phú Hòa, xã An Phú, huyện

Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 04 năm 2005

Hình 1.5 Thân cây tô mộc thu hái tại ấp Phú Hòa, xã An Phú, huyện

Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 04 năm 2005

Năm 1977, Hiroshi Hikino và cộng sự [14] đã cô lập được hợp chất 56

và 59

đã xác định cấu trúc hợp chất 58

bằng phương pháp nhiễu xạ tia X

52, 81

58, 59, 61, 62, 63, 64, 66

chất 54, 56, 66, 67, 72, 64, 65, 68, 69, 70, 80, 84, 85, 86 từ lõi gỗ thân cây tô

mộc

và 88

và hỗn hợp gồm hai chất 51, 52

hợp chất 51, 56, 57, 61, 63, 64, 65, 66, 79, 86, 88, 89, 90, 91 và hỗn hợp gồm 52

và 53

77, 86, 56, 63, 61, 94, 95, 96, hỗn hợp gồm 52, 53 từ lõi gỗ cây tô mộc

61, 63, 81, 72, 71, 73, 74, 75, 76, hỗn hợp gồm 52 và 53

Các hợp chất được cô lập từ lõi gỗ thân cây tô mộc được ghi trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Các hợp chất được cô lập từ lõi gỗ thân cây tô mộc

Brazilin và các dẫn xuất brazilin

Các hợp chất có khung homoisoflavon

Các hợp chất chalcon

Các hợp chất phenol

Một số hợp chất khác

Như vậy, các kết quả nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học cho thấy, lõi

gỗ thân cây tô mộc chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid và các dẫn xuất của chúng Ngoài ra, brazilin, dẫn xuất của brazilin và hợp chất khung dibenz[b,d]oxocin cũng được tìm thấy trong lõi gỗ của thân cây này

1.6.2 Thành phần hóa học của hạt quả cây tô mộc

sự [43] đã cô lập được 11 hợp chất diterpenoid là 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,

104, 105, 106, 107 Các hợp chất này được ghi trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Các hợp chất được cô lập từ hạt quả cây tô mộc

1.7 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC

1.7.1 Tính chất dược lý

Từ lâu, y học dân tộc ở các nước như Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Miến Điện, Indonesia đã dùng lõi gỗ cây tô mộc làm thuốc bổ máu, trị long đờm.[1], [2], [6] Trong y học cổ truyền Trung Quốc, tô mộc được dùng làm thuốc

oketsu (hội chứng làm tắc nghẽn lưu thông máu) Các nghiên cứu về tính chất dược lý và thử nghiệm lâm sàng trước đây cho thấy tô mộc có độc tính đối với

1.7.2 Hoạt tính sinh học

Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy dịch chiết metanol từ lõi gỗ thân cây tô

hóa,[8], [50] kháng khuẩn,[8]

Các hợp chất phenol cô lập được từ lõi gỗ thân cây tô mộc như sappanchalcon, deoxysappanchalcon có hoạt tính chống dị ứng mạnh Các hợp chất brazilin,

Beauveria bassiana của các hợp chất phenol cô lập được từ cây tô mộc Kết quả

nghiên cứu cho thấy hợp chất 4-O-metylsappanol có hoạt tính ức chế loại nấm

này

ức chế enzym xanthin oxidase của các hợp chất phenol được cô lập từ cây tô mộc Enzym xanthin oxidase xúc tác cho quá trình oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric, do đó gây nên bệnh gút ở người Kết quả thử nghiệm của tác giả cho thấy, sappanchalcon có hoạt tính ức chế mạnh nhất

quả này, tác giả nhận xét rằng, dân gian sử dụng lõi gỗ thân cây tô mộc để điều trị các bệnh viêm nhiễm, thấp khớp có hiệu quả là do thành phần của nó có chứa các hợp chất phenol như sappanchalcon

kết quả cho thấy brazilein cô lập được từ cây tô mộc có tác dụng bảo vệ não, chống lại sự tổn thương do thiếu máu não cục bộ gây ra

trypsin và chymotrypsin của dịch chiết từ phần vỏ và gỗ thân cây tô mộc, kết quả nghiên cứu cho thấy các dịch chiết này có hoạt tính ức chế trypsin và chymotrypsin

kháng viêm của bảy hợp chất phenol, được cô lập từ dịch chiết metanol lõi gỗ thân cây tô mộc Kết quả cho thấy các hợp chất này đều có hoạt tính kháng viêm

Năm 2009, Orapun [43] và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống dị ứng của các hợp chất chalcon và homoisoflavon, được cô lập từ dịch chiết diclorometan của

rễ và lõi gỗ thân cây tô mộc Kết quả nghiên cứu cho thấy, sappanchalcon có hoạt

trên chuột của các hợp chất phenol, được cô lập từ dịch chiết metanol của lõi gỗ thân cây tô mộc Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất này có hoạt tính làm giãn mạch ở động mạch chủ và động mạch mạc treo ruột ở chuột

triển của tế bào ung thư miệng ở người trên hai hợp chất isoliquiritigenin metyl eter và sappanchalcon Kết quả nghiên cứu cho thấy isoliquiritigenin 2-metyl eter và sappanchalcon đều có tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư miệng

2-ở người

đã nghiên cứu tác dụng ức chế sự sinh sản của virus bệnh cúm, của hợp chất 3-deoxysappanchalcon cô lập được từ lõi gỗ thân cây tô mộc Qua kết quả thử nghiệm in vitro, tác giả kết luận rằng, cơ chế ức chế

sự hoạt động của virus cúm của hợp chất 3-deoxysappanchalcon liên quan đến việc kiểm soát sự sinh sản của virus cúm

ký cột RP-18, sắc ký cột Diaion HP-20, phương pháp kết tinh phân đoạn

2.1.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Phương pháp chung xác định cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập được là dùng các phương pháp quang phổ hiện đại, bao gồm phổ khối lượng phân giải cao, phổ khối lượng phân giải thấp, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, kết hợp với các phương pháp đo các thông số vật lý khác như đo điểm nóng chảy

Trong phương pháp xác định phổ khối lượng phân giải cao, đã dùng các kỹ thuật sau:

Kỹ thuật ion hóa ESI (Electrospray Ionization) hay AP-ESI (Atmospheric Electrospray Ionization), là kỹ thuật ion hóa ở áp suất thường bằng cách phun sương dung dịch mẫu trong trường điện thế ở nhiệt độ thích hợp Trong kỹ thuật này, các chất phân tích được ion hóa trong lòng các hạt sương nhờ các phản ứng trao đổi ion Các phản ứng trao đổi ion này được hỗ trợ bởi trường điện thế, quá trình bay hơi dung môi và bản chất của các chất phân tích:

Trong kỹ thuật ESI, ESI (+) hay ESI dương dùng để thu hút các ion [M+H+]+ hay

2.1.3 Phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào

Việc xác định độc tính tế bào của hợp chất ở nồng độ 100 g/ml với dung môi hòa tan là DMSO trên các dòng tế bào ung thư người đã được Viện ung thư Hoa Kỳ sử dụng cho chương trình sàng lọc của mình Về nguyên tắc, thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một hợp chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

và hơ nóng từ từ cho đến khi hiện màu

2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

mỏng và giải ly bằng dung môi thích hợp được phát hiện bằng đèn tử ngoại, hoặc

hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel (hoặc lớp RP-18 nếu là bản pha đảo) có chất, giải hấp phụ chất cô lập được bằng dung môi thích hợp

Kích thước bản mỏng dùng để phát hiện vết chất và trong sắc ký lớp mỏng điều chế như sau:

Kích thước cột dùng cho sắc ký pha đảo: (40 x 1,5 cm), (30 x 1,0 cm)

2.2.1.5 Phổ khối lƣợng

Phổ khối lượng phân giải cao được đo trên máy HR-ESI-MS (Bruker MicroOTOF–

Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (tần số 500

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy cộng hưởng từ hạt nhân (BRUKER AVANCE) (tần số 500 MHz đối với phổ

1

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

2.2.1.7 Điểm nóng chảy

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

2.2.1.8 Đèn UV hai bước sóng

Sau khi khai triển sắc ký lớp mỏng, các vệt chất trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn UV 2 bước sóng ở 365nm và 254nm (spectroline model ENF-240C/FE) của Bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

2.2.1.9 Thử nghiệm độc tính tế bào

Các chất tinh khiết cô lập được từ dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng và từ dịch chiết metanol của lõi gỗ thân cây tô mộc được thử nghiệm độc tính trên ba dòng tế bào ung thư, gồm tế bào ung thư phổi NCI-H460, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7 tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

2.2.2 Mẫu thực vật

Đối tượng nghiên cứu là rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc Rễ cây hà thủ ô trắng được thu hái vào tháng 10, năm 2007; lõi gỗ thân cây tô mộc được thu hái vào tháng 04, năm 2005, tại cùng địa điểm ở ấp Phú Hòa, xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Mẫu cây được nhận danh bởi Tiến sĩ Hoàng Việt, Bộ môn thực vật, khoa Sinh, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên TP.HCM