Moriarty 1998 đã dùng Bacillus để kiểm soát hiện tượng phát sáng, và tác nhân gây bệnh đã hoàn toàn không có ở đáy ao trong tất cả các giai đoạn phát triển của tôm nuôi với sự có mặt của
Trang 1NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA Bacillus amylolyquefaciens D1768 NHƯ MỘT CHÂT
KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE CỦA TÔM HE NHẬT BẢN
Marsupenaeus japonicus CHỐNG LẠI NHÂN TỐ GÂY SỐC FORMALIN
Nguyễn Thị Huế Linh 1 , Toshiaki Itami 2
1 Khoa Thủy Sản, Trường ĐH Nông Lâm, Huế
2 Khoa Nông nghiệp, Trường ĐH Miyazaki, Nhật Bản
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Giống Bacillus là trực khuẩn Gram dương, thuộc đám vi khuẩn hiếu khí và có khả năng sinh nội bào tử (Stackebrandt & Swiderski, 2002) Các loài vi khuẩn thuộc giống Bacillus có thể
được phân lập từ những môi trường khác nhau như đất, nước ao, nền đáy và hệ vi sinh vật trong
đường ruột của động vật thủy sản (Travers et al., 1987; Balakrishnan et al., 2003; Shakila et al., 2006) Một số loài của giống Bacillus có thể được sử dụng như probiotic dành cho người bao gồm B cereus, B pumilus, B clausii (Duc et al., 2004) Và probiotic được sản xuất từ vi khuẩn
này cũng được sử dụng trong nền công nghiệp nuôi trồng thủy sản Moriarty (1998) đã dùng
Bacillus để kiểm soát hiện tượng phát sáng, và tác nhân gây bệnh đã hoàn toàn không có ở đáy
ao trong tất cả các giai đoạn phát triển của tôm nuôi với sự có mặt của các loài Bacillus Meunpola et al (2003) đã cho thấy hiệu quả của việc kết hợp ozone và probiotic Bacillus 11 để nâng cao tỷ lệ sống của tôm sú Penaeus monodon kháng lại sự cảm nhiễm của Vibrio Mặt khác, Tseng et al (2009) đã thừa nhận hiệu quả ức chế của probiotic B subtlis E20 đối với sự phát triển vi khuẩn Aeromonas hydrophila và probiotic này cũng đã kích thích sự đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào ở tôm thẻ chân trắng Liptopenaeus vannamei với sự tăng lên của hoạt động thực bào và hoạt động của enzyme phenoloxidase hiệu quả kháng lại Vibrio
alginolyticus.
Trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản, formalin là một trong những chất sát trùng phổ
biến ở ao nuôi tôm (Gräslund & Bengtsson, 2001; Gräslund et al., 2003) Formalin được hạn chế
sử dụng trong ao nuôi do tác động của nó ảnh hưởng đến môi trường, con người và thực phẩm
(Boyd & Massaut 1999) Tuy nhiên, Samocha et al (1998) đã kiến nghị rằng sử dụng formalin để
kiểm tra sức khỏe tôm nuôi là một phương pháp nhanh, đơn giản, rẻ tiền, mà không đòi hỏi trang
thiết bị hiện đại hay kỹ thuật cao Benedictal et al (2009) đã sử dụng formalin để đánh giá tỷ lệ sống, sản sinh nauplii và đẻ trứng của Artemia parthenogenetia Tung (2009) cũng đã tiến hành
formalin stress để đánh giá chất lượng của ấu trùng tôm he Nhật Bản sau khi đã cho ăn bằng thức
ăn bổ sung Lactobacillus plantarum Thêm vào đó, Lamela et al (2008) đã chứng minh hiệu quả của formalin đối với một số thông số miễn dịch của tôm Litopenaeus schmitti cũng như sự hoại tử
ở mang và khối gan tụy sau 48 h formalin stress
Như vậy, để nâng cao sức khỏe của tôm nuôi, nghiên cứu này đã sử dụng các thông số miễn dịch để đánh giá hoạt động kháng lại formalin stress sau khi đã cung cấp thức ăn có bổ
sung B amylolyquefaciens D1768 cho vật thí nghiệm Kết quả nghiên cứu đạt được sẽ góp phần
vào sự phát triển ổn định và bền vững của ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản
Trang 22 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Tôm he Nhật Bản (M japonicus) trọng lượng 10-11g, thu từ ao nuôi và đem về phòng thí
nghiệm của trường ĐH Miyazaki, Nhật Bản để thích nghi từ 3-5 ngày trước khi tiến hành thí
nghiệm Bacillus amylolyquefaciens D1768 được bổ sung vào thức ăn tôm với một lượng lần
lượt là 6.3 x 105, 2.3 x 106 và 2.4 x 107 cfu /g
2.2 Bố trí thí nghiệm
Cho ăn
Có 3 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng (n = 20) Tôm được cho ăn thức ăn có bào tử (6.3 x
105, 2.3 x 106 và 2.4 x 107 cfu /g) và không bổ sung bào tử của B amylolyquefaciens D1768
trong 1 tuần với tỷ lệ 2 % trọng lượng cơ thể / 1 lần / 1 ngày Tôm được nuôi trong điều kiện
thay hàng ngày
Phân tích các thông số miễn dịch
Tại ngày nuôi thứ 8, tiến hành formalin stress đối với vật thí nghiệm tại nồng độ 200 ppm Dung dịch máu tôm ở lô đối chứng và 3 lô thí nghiệm được thu trước và trong khi stress tại thời điểm 0 h, 12 h, 24 h, 48 h để đánh giá tổng số tế bào máu (THC), hoạt động thực bào và hoạt động của hệ thống enzyme prophenoloxidase (PO) của vật thí nghiệm Nước không được thay trong khoảng thời gian thí nghiệm
Tổng số tế bào máu được xác định bằng cách sử dụng buồng đếm hồng cầu Bürker-Türk
kết hợp với kính hiển vi quang học (Cheng et al., 2005).
Hoạt động thực bào được xác định dựa vào hoạt động tiêu hóa của các tế bào máu đối với các hạt polyme hình cầu được hình thành từ các hạt polyme vô định hình (Latex bead)
Hoạt động của hệ thống enzyme prophenoloxidase được phân tích dựa vào đo sự hình
thành dopachrome từ L-DOPA (L-3, 4-dihydroxyphenylalanine, Sigma) (Sung et al., 1994; Pan
et al., 2008).
Phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm xử lý thống kê SPSS
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
D1768 105), 2.3 x 106 cfu/g (lô D1768 106), 2.4 x 107 cfu/g (lô D1768 107) lần lượt biến đổi từ 10.4 ± 7.0 x 106 đến 19.6 ± 2.7 x 106 cells mL-1, 8 ± 0.7 x 106 đến 8.2 ± 2.6 x 106 cells mL-1, 7.4 ± 2.7 x 106 đến 11.8 ± 4.5 x 106 cells mL-1 Việc giảm và thay đổi số lượng tế bào máu trong vòng tuần hoàn của giáp xác là sự đáp ứng đối với nhiều yếu tố stress, tương ứng với sự giảm nguy cơ cảm nhiễm tác nhân gây bệnh (Le Moullac & Haffner, 2000; Cheng & Chen, 2001) Hsu & Chen
(2007) đã chứng minh sự nhạy cảm của P vannamei đối với V alginolyticus có liên quan đến
Trang 3Hình 1 Sự thay đổi tổng số tế bào máu ở tôm cho ăn thức ăn có và không có Bacillus amylolyquefaciens D1768 của 3 lô đối chứng và 1 lô thí nghiệm trong thời gian gây stress bằng formalin.
Hình 2 Sự thay đổi hoạt động thực bào ở tôm cho ăn thức ăn có và không có Bacillus amylolyquefaciens D1768 của 3 lô đối chứng và 1 lô thí nghiệm trong thời gian gây stress bằng formalin Ký tự trên mỗi cột với cùng mốc thời gian biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê hơn các cột khác (p<0.05)
việc giảm các thông số miễn dịch bao gồm THC và tế bào máu không hạt khi tôm được ngâm
chứng minh khi tôm L schmitti được tiến hành formalin stress (25 và 50 ppm) trong 48 h đã dẫn
đến hoại tử mang, khối gan tụy, giảm lượng máu tuần hoàn tại vị trí tổn thương và là nguyên
nhân của việc giảm số lượng tế bào máu trong huyết thanh Cũng giống với các kết quả trên,
THC của lô đối chứng trong thí nghiệm của chúng tôi đã giảm trong 12 h và dao động trong suốt
36 h, trong khi đó THC của 3 lô thí nghiệm vẫn giữ ổn định trong 24 h của formalin stress
Dường như formalin nồng độ 200 ppm không có ảnh hưởng nhiều đến tôm nuôi ở cả 3 lô thí
nghiệm này
Hoạt động thực bào của tôm he Nhật Bản ở cả 1 lô đối chứng và 3 lô thí nghiệm hầu như không
các lô khác từ 13.6 ~ 26.5% tại 48 h (p<0.05)
a a
Trang 4Hoạt động PO của tôm ở 4 lô thí nghiệm giảm trong khoảng 48 h formalin stress
trong thời gian thí nghiệm ngoài trừ tại thời điểm 24 h
Trang 5Hình 3 Sự thay đổi hoạt động của enzyme phenoloxidase ở tôm cho ăn thức ăn có và không có Bacillus amylolyquefaciens D1768 của 3 lô đối chứng và 1 lô thí nghiệm trong thời gian gây stress bằng formalin Các cột khác nhau có cùng mốc thời gian với các ký tự khác nhau biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Các tế bào máu của giáp xác đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân
gây bệnh Có 3 hình thái khác nhau của tế bào máu với tế bào không hạt có chức năng thực bào,
tế bào bán hạt và tế bào hạt chứa hệ thống enzyme prophenoloxidase (proPO) là nguyên nhân
gây ra hiện tượng melanin hóa, hiện tượng gói gọn liên quan đến cơ chế nhận biết những chất lạ
và đóng vai trò quan trọng trong tính độc của tế bào (Hose et al., 1990; Johansson, 1995;
Johansson et al., 2000; Vargas-Albores et al., 2005) Vì vậy sự biến đổi của 3 thành phần tế bào
máu có thể được dùng để đánh giá sức khỏe của tôm và khả năng đáp ứng miễn dịch tế bào
Trong báo cáo của Lamela et al (2008) không có sự biến đổi hoạt động của enzyme PO của tôm
L schmitti ngâm trong formalin (25 and 50 ppm) 48 h Tuy nhiên, thí nghiệm của chúng tôi cho
thấy rằng hoạt động của enzyme PO giảm trong vòng 48 h formalin stress (p<0.05), điều này có
thể do nồng độ của formalin là 200ppm cao hơn 25 và 50 ppm so với nghiên cứu trước
Như vậy, so sánh giữa 3 lượng bào tử khác nhau của vi khuẩn B amylolyquefaciens
quả giúp tôm he Nhật Bản chống lại độc lực của formalin (200 ppm) tối thiểu trong vòng 12 h
4 KẾT LUẬN
B amylolyquefaciens D1768 (6.3 x 105 cfu/g) bổ sung vào thức ăn để nâng cao sức khỏe của tôm he Nhật Bản có hiệu quả giúp vật nuôi chống lại formalin stress Việc sử dụng probiotic
Trang 6như một phương pháp phòng bệnh ở động vật thủy sản và để cạnh tranh, loại trừ tác nhân gây bệnh khỏi ao nuôi hiện rất phổ biến trong ngành công nghiệp thủy sản Trong tương lai, việc sử dụng probiotic và các chất kích thích miễn dịch khác sẽ là một biện pháp tối ưu và thân thiện với môi trường hơn so với việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất tràn lan trong ao nuôi trình nuôi hiện nay
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Balakrishnan S., John K R and George M R (2003) Antibiotic susceptibility of Bacillus spp.
from shrimp (Penaeus monodon) cultured ponds Indian Journal of Marine Sciences 32 (1),
81-84
2 Benedictal A., Veluraja K., Palavesam A., Immanuel G (2009) Formalin and salinity stress
induced cyst induction in Artemia parthenogenetica Roumanian Biotechnological Letters Vol.
14, No.3, pp 4370-4380.
3 Boyd C E., Massaut L (1999) Risks associated with the use of chemicals in pond aquaculture
Aquacultural Engineering 20, 113–132.
4 Cheng W and Chen J.-C (2001) Effects of intrinsic and extrinsic factors on the haemocyte
profile of the prawn, Macrobrachium rosenbergii Fish & Shellfish Immunology 11, 53–63.
5 Cheng W., Wang L.-U., Chen J.-C (2005) Effect of water temperature on the immune
592– 601
6 Duc L H., Hong H A., Barbosa T.M., Henriques A O and Cutting S M (2004)
Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use Applied and Environmental
Microbiology 70, 2161–2171
7 Gräslund S., Bengtsson B.-E (2001) Chemicals and biological products used in south-east
Asian shrimp farming, and their potential impact on the environment _ a review The Science of
the Total Environment 280, 93-131.
8 Gräslund S., Holmström K., Wahlström A (2003) A field survey of chemicals and biological
products used in shrimp farming Marine Pollution Bulletin 46, 81–90.
9 Hose J E., Martin G G and Gerard A S (1990) A decapod hemocyte classification scheme
integrating morphology, cytochemistry, and function The Biological Bulletin 178 (1): 33-45.
10 Hsu S.-W., Chen J.-C (2007) The immune response of white shrimp Penaeus vannamei and
11 Johansson M W (1995) Cellular immune reactions in crustaceans: method for in vitro studies In: Stolen J S., Fletcher T C., Smith S A., Zelikoff J T., Kaattari S L., Anderson R S., Söderhäll K., Weeks-Perkins B A (Eds.), Techniques in Fish Immunology-4 SOS Publications, Fair Haven, NJ, USA, pp 147–154
12 Johansson M W., Keyser P., Sritunyalucksana K., Söderhäll K (2000) Crustacean
haemocytes and haematopoiesis Aquaculture 191, 45–52.
13 Lamela R E L., Quintana Y C., Coffigny R S., Martínez M & Herrate N G (2008) Effects
of formalin on total haemocytes count and histopathological changes in the shrimp Litopenaeus
schmitti (Pe´rez-Farfante & Kensley 1997) Aquaculture Research 39, 1316-1321.
14 Le Moullac G., Haffner P (2000) Environmental factors affecting immune responses in
Crustacea Aquaculture 191, 121–131.
15 Moriarty D J W (1998) Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds
Aquaculture 164, 351–358.
Trang 716 Meunpola O., Lopinyosiri K., Menasveta P (2003) The effects of ozone and probiotics on
the survival of black tiger shrimp (Penaeus monodon) Aquaculture 220, 437–448.
17 Samocha T M., Guajardo H., Lawrence A L., Castille F L., Speed M., McKee D A., Page
K I (1998) A simple stress test for Penaeus vannamei postlarvae Aquaculture 165, 233-242.
18 Shakila R J., Saravanakumar R., Vyla S A P., Jeyasekaran G and Jasmine G I (2006)
Antagonistic Activity of the Gut Microflora Isolated from Farmed Tiger Shrimp (Penaeus
monodon) Asian Fisheries Science 19:247-255.
19 Stackebrandt E and Swiderski J (2002) Book of Applications and Systematics of Bacillus
and Relatives, chapter 2, p 8-22
20 Sung H H., Kou G H and Song Y L (1994) Vibriosis Resistance Induced by Glucan
Treatment in Tiger Shrimp (Penaeus monodon) Fish Pathology 29 (1), 11-17.
21 Travers R S., Martin P.A W and Reichelderfer C F (1987) Selective Process for Efficient
Isolation of Soil Bacillus spp Applied and Environmental Microbiology 53, 1263-1266.
22 Tseng D.-Y., Ho P.-L., Huang S.-Y., Cheng S.-C., Shiu Y.-L., Chiu C.-S., Liu C.-H (2009)
Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus
vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20 Fish & Shellfish Immunology 26, 339–344.
23 Tung H T (2009) Study on effect of heat-killed Lactobacillus plantarum on response in growth and defense system of kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus PhD thesis, Kagoshima
University, Japan
24 Vargas-Albores F., Gollas-Galván T & Hernández-López J (2005) Functional
characterization of Farfantepenaeus californiensis, Litopenaeus vannamei and L stylirostris
haemocyte separated using density gradient centrifugation Aquaculture Research 36, 352-360.
ABSTRACT
Using immune-stimulants Bacillus amylolyquefaciens D1768 to examine the effect on immune response anti-stress
of kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus was conducted in this study Shrimp was feed by without and with B amylolyquefaciens D1768 spore containing 6.3 x 10 5 (group D1768 10 5 ), 2.3 x 10 6 (group D1768 10 6 ) and 2.4 x 10 7 (group D1768 10 7 ) cfu/g of dry products, respectively After one week of feeding, the shrimp were stress by formalin (200 ppm of concentration) and were analyzed for changes in various immunological parameters at 0 h, 12 h, 24 h,
were higher than that of control group at 12 h and no difference significant between four experimental groups from
24 h to 48 h Phagocytic activity almost no change for 12 h among these groups; phagocytic activity of group D1768 10 7 strongly decreased at 24 h and lower significantly than that of other three groups at 48 h Phenoloxidase activity almost decreased for 48 h, in there phenoloxidase activity of control group was lower significantly than that
of group D1768 10 5 and D1768 10 7 , difference significantly than that of group D1768 10 6 during stress period except at 24 h In conclusion, B amylolyquefaciens D1768 spore 6.3 x 10 5 cfu/g can use to enhance shrimp health and ability anti-formalin stress for 12 h at least.
Key words: formalin, Bacillus amylolyquefaciens¸ Marsupenaeus japonicus
