Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12

Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN HOÀNH

PHÂN LẬP, TUYẾN CHỌN, PHÂN LOẠI MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS

SINH ACID LACTIC MANH VÀ

NHAY CAM VOI VITAMIN B12

LUAN VAN THAC SI DUGC HOC

HA NOI -2006

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN HOÀNH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, PHÂN LOẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TỪ MINH KOÓNG

HÀ NỘI -2006

PGS.TS Tir Minh Koong- ngwéi thây đã trực Hếp tận tình hướng

dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này Toi citing xin chan thanh cam on PGS Ts Cao Văn Thu, TS Dam Thanh Xuân, đã đóng góp những ý Riến quí báu cho tôi rong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn Tế Vii Nguyén Thanh- Viện công nghiệp thực phẩm cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của thâỳ

cho tôi trong quá frình thực hiện đề tài

Toàn thành luận văn này tôi cũng đã nhận được nhiều sự giúp

đỡ của các thây cô và đồng nghiệp bộ môn €ông nghiệp Được,

phòng Dao tao sau đại học frường Đại học Được Bà Bội

Cuối cùng tôi xin gửi lời cam ơn sâu sac tới gia đình, bạn bè

những người đã luôn Rhích lệ và động viên tôi đạt được những thành công ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 12 năm 2006

DS LÊ XUÂN HOÀNH

người, đặc biệt trong lĩnh vực y học, dược học Tuy vậy ở Việt Nam nói chung, trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, nguyên liệu làm thuốc vẫn

chưa được chú ý và phát triển mạnh mẽ

Ở Việt Nam, do đặc điểm khí hậu nên nhóm vi khuẩn lactic có ở khắp mọi

nơi Vì thế mà ngành công nghiệp thực phẩm dùng các quá trình lên men

lactic để chế biến, bảo quản thực phẩm, ngành dược nghiên cứu quá trình lên

men lactic và sử dụng vi khuẩn lactic vào nhiều mục đích khác nhau Ví dụ

san xuat acid lactic tir Lactobacillus chiém 35% trong céc nguồn sản xuất acid

nay, tao calcilactat, sữa chua có chứa calcilactat và vitamm B12 làm thực

phẩm chức năng điều trị còi xương Thêm vào đó nhóm vi khuẩn lactic còn

được dùng sản xuất nhiều chế phẩm thuốc như: Antibio, Lactomin Đặc biệt nhóm vi khuẩn này còn được dùng làm vi khuẩn kiểm định để định lượng vitamin B12 ở nồng độ thấp và trong dạng hỗn hợp nhiều thành phần mà các

phương pháp phân tích hoá lý không thực hiện được Chính vì vậy, chúng tôi

chon dé tai: “Phan láp, tuyển chọn, phân loại một số chủng Lactobacillus

sinh acid lactic manh va nhay cam voi vitamin B12” theo các mục tiêu:

1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lacfobacilius cho hiệu suất tổng hợp

acid lactic manh

2 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus nhay cảm vitamin B12

3 Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử chung Lactobacillus tuyển chọn được

Nhằm tìm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp lên men lactic và chủng Lactobacillus dé dinh luong vitamin B12 bằng phương pháp vi sinh vật

1.1.1 Đặc điểm vi khudn lactic

Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobarterium, Lactococcus Viéc phân loại vi khuẩn lactic được mô tả khá rõ trong khoá phân loại của Bergey và khoá phân loại Prokaryot Ngoài ra một số loài nấm thuộc chi Rh¡zopus cũng có khả năng tạo acid lactic từ các nguồn khác nhau Nhìn chung tất cả các vi khuẩn

lactic đều là những chủng ưa nhiệt, hô hấp yếm khí hoặc vi hiếu khí Đa số các vi

khuẩn trong nhóm này là Gram dương, chúng không có khả năng di động và hầu hết không tạo bào tử [10],[1]

Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic tương đối đa dạng, có thể là hình

cầu, hình que, có thể là các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi Nhóm vi

khuẩn này có thể sinh trưởng tốt trong điều kiện pH thấp, pH tối thích của chúng

là từ 3,5-5, chúng có khả năng đồng hoá nhiều loại đường khác nhau như đường ølucose, lactose, manfose, saccarose Nhờ những đặc điểm này mà nhóm vi

khuẩn lactic có nhiều ưu thế trong bảo quản thực phẩm, đã có từ rất lâu đời trong

lịch sử phát triển của loài người [12],[1] Cho đến những năm đầu của thế ký 20,

các nghiên cứu về quá trình lên men lactic mới được nghiên cứu nhiều và áp

dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là thực phẩm và dược phẩm Đến nay, những nghiên cứu về sự lên men lactic vẫn tiếp tục được nghiên

cứu trên thế giới

1.1.2 Chi Lactobacillus

Day là chi lớn nhất trong họ vi khuẩn lactic với rất nhiều các chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất Dựa trên cơ sở về sự chuyển hoá gluxit

hình Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là acid lactic, chiếm khoảng 90- 98% các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ Trong quá trình

chuyển hoá, acid lactic được tạo thành thông qua chu trình EMP Hình thái và kích thước của nhóm này phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, thông

thường có dạng hình que, hình sợi, sinh sản theo hình thức phân chia tế bào

Nhiệt độ thích hợp cho nhóm này phát triển là 40-60°C đối với loài ưa nhiệt và 28-35°C với loài ưa ấm Đại diện điển hình cho nhóm này 1a L acidophillus, L

bulgaricus, L delbrueckii [12],[17]

Nhóm II: Gồm những chủng thuộc loại lên men lactic dị hình không bắt buộc,

sản phẩm quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic, va

ethanol Việc lên men là đồng hình hay dị hình tuỳ thuộc vào loại đường cung cấp trong môi trường Nếu là đường sáu C như glucose, hexose, frutose thì được lên men đồng hình, còn nếu là các đường khác như pentose thì lên men dị hình tạo acid lactic nhờ sự cảm ứng của enzym phosphoketolase Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm này có xu thế sử dụng quá trình lên men đồng hình hơn và một số loài có thể tồn tại cả hai quá trình lên men theo hai cơ chế khác nhau Đại diện cho nhóm này là các chủng L pÏantarwm, L casei, L helvesficus,

L leichmanii [30],[10]

Nhóm II: Nhóm này là các chủng lên men di hình bắt buộc, chuyển hoá

ølucose theo con đường ED, tạo ra sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là

acid lactic, acid acetic, CO;, ethanol trong đó đường 5C được chuyển hoá thành

acid lactic và acid acetic Các vi khuẩn trong nhóm này chủ yếu dạng hình que

đài hoặc mảnh, không tạo bào tử, có khả năng tồn tại ở nhiệt độ khá rộng là

2-Bang 1.1: Mét s6 chung Lactobacillus dùng trong sản xuất lactic

STT Ching Nhiệtđộ | Khả năng chuyển | Sản phẩm

ưa thích | hoá đường

1 L acidophillus | 37-45°C lactose L(+) lactic

3 L delbrueckii | 48-52°C saccarose L(+) lactic

4 L plantarum 30-35°C_ | glucose, pentose | L(_) lactic

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus

1.1.3 Ung dụng của vi khuẩn lactic trong đời sống

Trong thực tế, vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lên men lactic

để bảo quản thực phẩm Bản chất là việc tạo ra môi trường acid giúp ngăn cản sự

phát triển của các vi sinh vật gây thối, đồng thời tạo hương vị chua phù hợp với khẩu vị Acid lactic và vi khuẩn lactic còn giúp kích thích tiêu hoá, tạo sự ngon miệng và góp phần duy trì sự cân bằng hệ vi khuẩn có lợi trong đường ruột Lên men lactic được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm như làm nem

chua, hoa quả muối, công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa - điển hình là sữa

chua, bơ, pho mất [13],[14],[21].

cho các thuốc giàu calci để bổ xung cho bệnh nhân bị thiếu calci dẫn đến co giật,

rối loạn tâm thần hoặc bồi bổ cho phụ nữ có thai và trẻ nhỏ để tránh còi xương,

chậm lớn

Ching Lactobacillus acidophilius còn được sử dụng nhiều trong các chế

phẩm men tiêu hoá như Antibio, Lactomin để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hoá do loạn khuẩn ruột vì dùng kháng sinh dài ngày Sản phẩm này sẽ giúp lập

lại hệ cân bằng vi sinh trong ruột [10]

Acid lactic cũng đóng một vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp như đệt, sản xuất sơn và acid lactic tỉnh khiết còn sử dụng để sản xuất các sản

phẩm cao cấp khác

1.1.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng mới của chi Lactobacillus

Mặc dù các nghiên cứu về lên men lactic đã được triển khai rộng rãi và ứng dụng nhiều trong sản xuất acid lactic phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp khác

nhau song các nghiên cứu về lên men lactic vẫn tiếp tục được tiến hành trên thế

giới Đã có thêm rất nhiều chủng vi khuẩn lactic mới được phân lập, định tên và

đưa vào sản xuất acid lactic [31] Không chỉ vậy, hiện nay các nghiên cứu về lên men liên tục để thay thế cho lên men gián đoạn đã được triển khai Điển hình là

các nghiên cứu về bất động tế bào như bất động L delbrueckii, Rhiropus oryzea

để sản xuất acid lactic bằng lên men liên tục [16],[26]

LactobacilÏlus còn được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất một số enzym nhu phospho ÿ glycosidase từ chung L delbrueckii, purine 2’ deoxyribosyltransferase tir chung L leichmanii, san xuat xylo-oligo saccharides

tir chung L plantarum [22]

ức chế sự phát triển của mot s6 vi khuan vi du nhu S aureus, E coli, Shigella Các kháng sinh điển hình được chiết suất và nghiên cứu là: caseicin từ

chủng L casei, plantaricin tử chung L plantarum, curvacin ttt chung L curvatus,

brevicin tir chung L bravis [30]

Một mảng nghiên cứu lớn khác thuộc lĩnh vực công nghệ gen, rất nhiều các chủng thuộc chỉ Løcfobacilius đã được giải trình tự gen tong hop ARN ribosom 1S, một số gen tổng hợp các enzym như phospho _ glycosidase, deoxyribosyltransferase cũng đã được nghiên cứu sâu [33] Một vài plasmid của

vi khuẩn nhóm này cũng được tách chiết để làm vector biểu hiện gen Đặc biệt

hơn nữa là lập ban d6 gen cua mét s6 chung nhu L plantarum, L acidophillus

phục vụ cho các nghiên cứu di truyền vi sinh vật [20]

1.2.Các phương pháp định lượng vitamin B12

1.2.1 Phương pháp đo quang phổ

Những mẫu vitamin B12 thử tương đối tinh khiết thường được định lượng

bằng phương pháp đo quang phổ hoặc phương pháp so màu Các dược điển USP27, BP2001, dược điển Việt Nam III đều sử dụng phương pháp đo quang phổ

dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng của vitamin B12 ở bước sóng ^ = 36lnm

trong vùng tử ngoại và bước sống À =550nm trong vùng nhìn thấy [4].[11],I9],[32] Phương pháp này tương đối đơn giản, nhanh nhưng trong dung

dịch vitamin B12 đo quang có rất nhiều tạp chất, có thể là sản phẩm của những

quá trình oxi hoá, sản phẩm thuỷ phân hay những chất có công thức hoá học

tương tự Những chất này có thể có quang phổ hấp thụ tương tự như vitamin B12

vậy, nồng độ dung dịch vitamin B12 đo được chưa hẳn đã chính xác

1.2.2 Phương pháp hoá học

Phương pháp định lượng hoá học đầu tiên được thực hiện bởi Fantes, trong đó vitamin B12 được thuỷ phân bằng dung dịch HCI đặc, nóng Dung dịch acid màu

đỏ thu được sẽ được este hoá với alcol octylic Những tạp chất sẽ được tách ra

bằng cách lắc nhẹ sản phẩm tạo thành với xăng nhẹ rồi sau đó rửa bằng acid

hydrocloric metanoic Cuối cùng vitamin B12 sẽ được định lượng bằng phương pháp so màu Tuy nhiên phương pháp so màu cũng sẽ không chính xác nếu dung dịch có những chất tương tự như vitamin B12 đồng thời các sản phẩm phân huỷ cũng làm ảnh hưởng tới kết quả dù cho acid sinh ra trong quá trình thuỷ phân có thể bị loại bỏ hết trong một số giai đoạn tinh chế [24] Phương pháp này hiện nay không được dùng để định lượng vitamin B12 mà chỉ có ý nghĩa lịch sử

1.2.3 Định lượng vitamin B12 bằng phương pháp vì sinh vật

Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, một số vi sinh vật không phát triển hoặc phát triển chậm trong môi trường không có vitamin B12, hay nói cách khác, vitamin B12 là nhân tố phát triển của một số loài vi sinh vật Kỹ thuật định lượng bằng phương pháp vi sinh vật hay thực hiện nhất hiện nay là tiến hành trong các

ống nghiệm ở môi trường vô khuẩn như sau: Dung dịch vitamin B12 chuẩn và

dung dịch vitamin B12 thử với những nồng độ khác nhau được cho vào các ống

nghiệm sau khi đã cấy vi khuẩn được lựa chọn để thử nghiệm và ủ ở nhiệt độ

thích hợp trong vòng 24h Mức độ phát triển của vi khuẩn được đo bằng máy đo

độ đục Mật độ quang phản ánh nồng độ trung bình vi khuẩn khi có vitamin B12

Một phương pháp khác cũng được sử dụng phổ biến là tiến hành trên đĩa

Petri, phương pháp này đối ngược với phương pháp định lượng kháng sinh Trong phương pháp này môi trường dinh dưỡng được làm đặc với agar và trộn với vi

khuẩn rồi đổ vào đĩa Petri Dung dịch vitamin B12 thử và dung dịch vitamin B12

chuẩn được nhỏ vào các lỗ đục sẵn trong môi trường thạch Sau một thời gian ủ,

vitamin B12 sẽ khuyếch tán ra môi trường xung quanh và kích thích vi khuẩn

phát triển Đo đường kính vòng vi khuẩn phát triển của cả hai loại dung dịch rồi

tính kết quả nồng độ vitamin B12 cần xác định

Trong cả hai phương pháp, sự phát triển của vi khuẩn tỉ lệ với logarit nồng độ

của dung dịch vitamin B12 và được biểu diễn bằng đường cong logarit trên đồ

thị Mặc dù vậy, phương pháp này không phải lúc nào cũng dễ thực hiện vì một

số vitamin B12 liên kết với protein huyết tương hoặc không chọn được chủng vi

sinh vật kiểm định phù hợp [7],[3],[18] Tuy nhiên phương pháp định lượng vi

sinh vật tương đối nhạy và được sử dụng trong trường hợp không áp dụng được

phương pháp so màu hoặc phương pháp hoá học Đặc biệt việc định lượng bằng phương pháp vi sinh còn cho phép phân biệt vitamin B12 có hoạt tính sinh học và các chất tương tự trong mẫu thử một cách chính xác, đây là ưu điểm mà các

phương pháp khác không có được Dưới đây là một số chủng vi khuẩn thường

dùng để định lượng vitamni B12 bằng phương pháp vi sinh vật:

Lactobacilii: Ching dau tién duoc Shorp su dung 1a Lactobacillus lactic

Donner Chủng này sau đó được thay thế bằng chủng Lactobacillus leichmanii

đưa ra kết quả chính xác hơn Phương pháp này đã được Campell thẩm định lại

cẩn thận và ông nhận thấy rằng độ dày của môi trường có ảnh hưởng đến mức độ

Eescherichia coli: Dracis va Mingioli da thu duoc mot s6 chung E.coli dot

biến cần có vitamin B12 trong môi trường phát triển Công trình của họ được

phong thi nghiém Glaxo Laboratories thu nghiém định lượng vitamin B12 với

chung E.coli đột biến M.1133 trong hộp Petri Burkholder cũng thử nghiệm với phương pháp định lượng trong ống nghiệm và cho kết quả khả quan E coli có phần kém nhạy cảm hơn Lzcfobaciiii nhưng môi trường định lượng đơn giản hơn

nhiều và cho kết quả đáng tin cậy trong những định lượng thông thường [7],[10] Euglena gracis: Hunter và cộng sự đã đưa ra một loại vi khuẩn hoàn toàn mới

để định lượng vitamin B12 khi phát hiện thấy Euglena gracis cần có vitamin B12

trong quá trình quang hợp Vi khuẩn này phát triển trong môi trường khá đơn

giản và rất nhạy trong các phản ứng định lượng vitamin B12 Tuy vậy, tốc độ

phát triển của vi khuẩn rất chậm nên phải cần tới 4-5 ngày để định lượng Mặt

khác Robbins còn nhận thấy rằng Euglena gracis không đặc hiệu, nó còn nhạy cảm với cả những chất tương tự vitamin B12 [10]

1.3 Ứng dụng sinh học phân tử trong định tên vi sinh vat

Phương pháp phân loại vi sinh vật trước đây chủ yếu dựa vào hệ thống phân loại cổ điển căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hoá còn thiếu tính ổn

định Ngày nay, công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã giúp cho việc định tên các loài nhanh, chính xác với độ tin cậy cao hơn Hàng loạt các ứng

dụng trong phân tích trình tự ADN đã được triển khai trên thế giới để định tên

virus, vi khuẩn, nấm men Ở Việt Nam, một số phòng nghiên cứu sinh học phân

tử đầu ngành hay các trung tâm sưu tập giống vi sinh vật đã sử dụng phương pháp

với phương pháp phân loại kinh điển

1.3.1 Trình tự ARN ribosom [5;2]

Hiện nay đa số các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương

đồng về trình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hoá giữa các cá thể vi sinh vật

Tất cả các loài vi sinh vật trong sinh giới đều sử dụng cách thức tổng hợp protein

nhờ ribosom Vì vậy, tiến hành so sánh trình tự nucleotid của gen mã hoá ARMNr

ở các vi sinh vật khác nhau để xác định mối quan hệ họ hàng và sự tiến hoá giữa

chúng ARNr là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của vi sinh vật

và mối quan hệ giữa chúng bởi vì chúng là thành phần cơ bản có trong mọi tế bào

vi sinh vat Vai tro và chức năng của chúng là giống nhau ở các ribosom Các

nghiên cứu cũng cho thấy rằng, cấu trúc không gian của phân tử ARNr rất giống nhau giữa các loài vi sinh vật khác nhau Tức là cấu trúc của chúng thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói khác đi là các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất bền vững và chặt chẽ trong quá trình tiến hoá Tốc độ thay đổi các gen này trong quá trình tiến hoá là rất chậm, nguyên nhân có lẽ là bởi vì sự ốn định là tính chất quan trọng nhất của chúng

Nhìn chung, các gen mã hoá cho ARNr rất bền vững (bảo thủ), tuy vậy ngay

trong bản thân các gen bền vững cũng chứa những vùng có mức độ bền vững cao

hơn và các vùng có mức độ bền vững thấp hơn (vùng biến đổi) Điều này xảy ra

là do các vùng gen đó mã hoá cho những vùng không gian khác nhau của phân tử

ARNr Trong quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể bị những đột biến nhất

định nhưng quá trình chọn lọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít

làm thay đổi và ảnh hưởng tới cấu trúc không gian cla ARNr, ft anh hưởng đến

quá trình sinh tổng hợp protein của sinh vật Còn những đột biến trong những

vùng không gian quan trọng làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein

của cơ thể thì ngay lập tức sẽ bị chọn lọc tự nhiên đào thải

Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho phân tử ARNr các nhà

khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuyếch đại các vùng biến đổi So sánh sự khác biệt giữa các vùng này để chỉ ra được những sự khác biệt

giữa các loài gần gũi Theo Robert W Bauman nếu hai loài vi khuẩn có sự khác biệt về trình tự gen ARNr 16S lớn hơn 3% thì có thể xem là hai loài khác nhau Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S 1a

lớn hơn so với phân tử ARN 16% Tuy vậy trình tự đã xác định hoàn chỉnh của

gen ARNr 23S 1a rat it trong khi đó trình tự gen của ARN 16S là khá phong phú

và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen thế giới Chính vì vậy phương pháp

giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng

loại của vi sinh vật vẫn là lý tưởng nhất

Lần xuất bản thit tu cua ca “Bergey manual of Systemmatic Bacteriology” và

“The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuén ARN 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài

tương ứng của vi sinh vật Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự

gen ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại vi khuẩn

Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng cách đã tính toán Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các cấp độ cao hơn chi Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các

đặc điểm kiểu hình và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng

rãi Nhìn chung các đặc điểm khoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương quan tốt với cây phát sinh chủng loại

1.3.2 Phan ting PCR (Polymerase Chain Reaction)

1.3.2.1 Nguyén ly

Phản ứng PCR được phát hiện vào những năm 1980, đã tạo một bước đột phá trong cuộc cách mạng di truyền học phân tử Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen, hệ gen

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá

trình sao chép ADN có sự tham gia của enzym ADN-polymerase chịu nhiệt với hai đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm

khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ xung với nó Do vậy để khởi đầu quá trình

tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (6-30 nucleotid) Đoạn này

sẽ gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu quá trình sao chép và được ADN- polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù Chuỗi xoắn kép

ADN được nâng nhiệt độ lên trên 90°C (92-98° C) sẽ bung ra thành các sợi đơn

để làm khuôn [16],[6],[9]

Cả hai sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp ADN nếu

các đoạn mồi (primer hoặc oligonucleotid) được cung cấp đủ và bám vào vị trí tương ứng ở cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai

đầu của đoạn ADN nhân lên để cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm nằm giữa hai đoạn mồi

Độ đài của sản phẩm PCR có thể vài trăm đến vài chục ngàn cặp nucleotid

Sau mỗi chu kỳ, các điểm bám mới cho đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN vừa được tổng hợp mới, hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt tới nhiệt độ thích hợp để các sợi ban đầu tách ra và bắt đầu một chu kỳ tiếp theo [6],[9]

Sau n chu kỳ của phản ứng, sẽ có 2° bản sao các phân tử ADN mạch kép Với

những ưu điểm như vậy, PCR đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong việc

chẩn đoán các bệnh về vius, vi khuẩn, các bệnh kí sinh trùng Mặt khác, việc

phân tích thành phần, trình tự nucleotid trên phân tử ADN trong hệ gen có giá trị quan trọng trong phân loại các loài sinh vật

e©_ Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN

e Enzym chịu nhiệt ADN-polymerase, hay dùng là taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaficus

e Hé6n hop của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotid (ở dạng dNTP)

e Môi trường đệm cung cấp ion Mg”” và nước tinh khiết (không có

ADNase, ARNase ) Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR thông

thường là 5Oul hoặc 20UI

Các giai đoạn của phản ứng PCR

e Bung lién kết của ADN (denaturafion): Được thực hiện ở nhiệt độ 90-98°C trong vài giây đến vài phút Ở nhiệt độ này, các phân tử ADN

mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym ARN-polymerase xúc tác tổng hợp

e Modi bam: Hay còn gọi là ủ mồi (annealing), sau bước đầu tiên, ngay lập tức, nhiệt độ hạ xuống còn 37- 68°C để các đoạn mồi bám vào các trình

tự bổ xung tương ứng trên các phân tử ADN làm khuôn

e Téng hop: Hay còn gọi là kéo đài (extension), nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68-72°C trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi

ADN vừa tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm

PCR

Phan ứng xảy ra với 25-40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ cuối cùng Sau

chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trong 5-10 phút để tất cả sợi ADN trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Cuối cùng nhiệt độ hạ xuống 4°C

để bảo quản Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với số lượng lớn, nên có thể

sử dụng trực tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn mà không cần phải nuôi cấy

1.3.2.3 Kiểm tra và phát hiện sản phẩm PCR [6].[2].[5]

Sử dụng phương pháp điện di trên gel (thạch) agarose 0,8-2% để phát hiện và đánh giá các sản phẩm PCR Phương pháp này cho phép các acid nucleic hiển thị trực tiếp và dua trên một đặc điểm là các acid nucleic ở pH trung tính tích điện

âm nhờ các nhóm photphat nằm trên gốc photphodiester của các sợi acid nucleic

Khi nằm trong một điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển về cực đương Khả năng chuyển dịch của các acid nucleic phụ thuộc vào kích thước, các acid có phân tử lượng lớn sẽ chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ di chuyển nhanh hơn

Loại gel sử dụng trong điện di đóng vai trò quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử acid nucleic, phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ các lỗ có trong gel Có hai loại cơ bản là thạch agarose và thạch polyacrylamid, gel agarose thường được dùng chạy trong máy điện di còn gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các acid nucleic có kích thước nhỏ hơn

Quá trình điện di được thực hiện bằng cách đưa mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (thường là xanh

bromophenol) chạy tới đầu cuối của gel Các acid nucleic ở trên gel thường được

hiển thị khi nhuộm bằng ethidium bromid và được quan sát dưới ánh sáng tử

ngoại Các acid nucleic sẽ hiện lên ở dải băng màu trắng, kích thước các băng ADN so sánh với chỉ thị di truyền (ADN marker) được cho vào cùng lúc với sản

phẩm PCR ở một lỗ riêng biệt cạnh các lỗ dùng phát hiện sản phẩm PCR

ADN marker hay dùng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda có chiều dài

43kb, được cắt bằng enzym giới hạn HindIII ADN cia thực khuẩn thé nay được

enzym giới hạn cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb Tuy nhiên trên thực tế chỉ nhìn thấy 7 băng, còn

băng có chiều dài 0,125kb thì rất khó phát hiện Nhờ các chỉ thị di truyền này mà người ta xác định được độ dài của đoạn PCR sản phẩm

1.3.2.4 Độ tin cậy của phương pháp PCR [6].[2]

Giống như quá trình sinh học trong tự nhiên, tái bản ADN là một quá trình

không hoàn hảo, đôi khi enzym ADN polymerase cũng nhân nhầm một nucleotid không bổ xung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự nhiên khoảng

10 Trong tế bào, các bazơ không bổ xung này được một hệ thống sửa sai ngay

nhưng trong invitro Taq-polymerase không có khả năng sửa chữa những bazo

nhân nhầm Do vậy cứ tổng hợp 2*10' nucleotid bằng PCR thì có thể có một

nucleotid không chính xác Tuy nhiên sai sốt này không thực sự đáng ngại vì trong ống nghiệm cùng một lúc có nhiều tập hợp phản ứng cùng nhân một đoạn

ADN giống nhau nên số ADN có một nucleotid sai sót là không lớn và sẽ được điều chỉnh chính xác sau khi so sánh các chuỗi khác nhau của cùng đoạn gen

Nhưng nếu dùng đoạn ADN này để làm vật liệu di truyền ban đầu để nhân tiếp

qua vecfor trong vi khuẩn E colï cũng có thể gây nguy hiểm sai khác với vật liệu

ban đầu

1.3.3 Xác định trình tự nucleofid của ADN

Xác định trình tự của các bazơ nucleotid trong ADN là phần trung tâm của sinh học phân tử hiện đại, nó cung cấp những thông tin cấu trúc quan trọng Các phương pháp phân tích nhanh trình tự đã được hoàn thiện vào cuối những năm 70

và kỹ thuật này ngày nay được sử dụng rong rai [9],[2],[25]

Có thể xác định trình tự nucleotid thông qua trình tự acid amin Tuy nhiên, bộ

ba mã hoá của 20 acid amin thường có một số nucleotid trùng lặp cho nên trình

tự ADN thu được chỉ đúng tương đối

Kỹ thuật điện di phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định chính xác trình tự chuỗi ADN sợi đơn Có hai phương pháp chính để giải trình tự ADN là phương pháp hoá học và phương pháp enzym

1.3.3.1 Phương pháp xác định trình tự Maxam Gilbert (phuong phap hod hoc)

Phương pháp này đòi hỏi phải có một đoạn ADN xác định để làm vật liệu khởi đầu Đoạn này không cần thiết phải tách dòng trong một vector Plasmid, kỹ

thuật có thể cho bất kỳ đoạn ADN nào ADN sẽ được đánh dấu phóng xạ bởi

3P tại đầu 5 của mỗi sợi và các sợi được biến tính tách nhau ra, tính sạch dé

cho một tập hợp các sợi được đánh dấu dùng trong các phản ứng xác định trình tự

[9]

Bước tiếp theo là sửa đổi hoá học với các bazơ trên sợi ADN Việc này được

thực hiên nhờ 1 trong 4 phản ứng đặc hiệu khác nhau Sau đó các bazơ bị sửa đổi

được loại khỏi nhóm đường của chúng và các sợi bị cắt tại vị trí này bằng pipericlin Nguyên lý ở đây là một số lượng lớn các phân tử trong các phản ứng

khác nhau sẽ tạo ra các đoạn có một đầu kết thúc tại các bazơ khác nhau và có chiều đài chỉ khác nhau một nucleotid Người ta gọi đó là “đoạn xếp” [2]

1.3.3.2.Phương pháp xdc dinh trinh tu Sanger Coulson (Phương pháp enzym hay dicleoxy)

Mặc dù kết quả cuối cùng cũng hoàn toàn như phương pháp hoá học nhưng kỹ

thuật lai hoàn toàn khác nhau Trong trường hợp này, bản sao của ADN cần xác

định trình tự được tạo ra từ klenom của ADN polymeraza Khuôn dùng cho phản ứng là ADN sợi đơn và đoạn mồi cần được dùng để cung cấp đầu 3` cho ADN

polymeraza nhằm bắt đầu tổng hợp đoạn sao

Việc sản xuất các đoạn xếp được thực hiện bằng cách xen deoxynucleotid tri photphat (dNTP) trong mỗi phản ứng Các dNTP nay thiếu nhóm hydroxyl tại vị trí 3 của deoxyribose, yếu tố này cần thiết cho quá trình kéo dài chuỗi khi tổng hợp ADN Các dNTP được sửa đổi như vậy gọi là các dideoxynucleotid tri

photphat (ddNTP) Bốn dđNTP là A,T, G, C được đưa cả vào 4 phản ứng và mỗi phản ứng đều diễn ra với 4 dNTP bình thường Nồng độ của các dạng dideoxy

phải ở mức để chúng có thể đính vào chuỗi ADN đang tổng hợp một cách liên

tục Như vậy, mỗi phản ứng tạo ra hàng loạt các đoạn kết thúc tại một nucleotid đặc thù và 4 phản ứng gộp lại sẽ cung cấp một bộ các đoạn xếp [2],[29]

Chiều ADN được đánh dấu bằng cách gắn một dNTP phóng xạ trong hỗn hợp phan ứng Đó thường là [œ - ”S]dATP, nó cho phép đọc một đoạn trình tự dài hơn

từ mỗi gen riêng biệt so với đánh dấu bằng ”*P như vẫn dùng trước đây

1.3.3.3 Điện di và đọc trình tự

Các đoạn xếp ADN sinh ra trong các phản ứng trên được tách nhau ra bằng

cách điện di trên gel polyacrylamid Các gel này thường chứa 6-20%

polyacrylamid va 7 M ure, chat nay tác động như một nhân tố biến tính làm giảm

hiệu quả hình thành cấu trúc bậc hai của ADN Điều này là quan trọng vì các đoạn có chiều dài chỉ khác nhau một nucleotid được tách nhau ra trên gel Các

gel hết sức mỏng (<0,5mm) và được đặt trong hiệu điện thế cao có thể nung nóng

chúng lên tới 60-70°C Điều này góp phần duy trì các điều kiện biến tính [27], [29]

Khi gel đã chạy xong, tách ra khỏi máy và được sấy khô trên giấy để dễ vận chuyển Sau đó chúng được áp vào phim nhạy phóng xạ Sự phát xạ của mỗi mẫu đánh dấu sẽ hoạt hoá các hạt bọc trên phim làm cho chúng biến thành màu đen

khi tráng rửa trên phim Kết quả tạo ra biểu đồ phóng xạ Biểu đồ được đọc từ

dưới lên trên, từ đoạn nhỏ nhất về phía trên Trong phương pháp này trình tự hàng trăm bazơ có thể được xác định trên một gel riêng biệt Sau đó các thông số về trình tự được xem xét trên máy vi tính, máy này có thể thực hiện các phép phân tích như dịch sang trình tự các acid amin, xác định các điểm cắt của enzym giới hạn, các đoạn tương đồng và cấu trúc khác nhau như khởi điểm và các đoạn có

chức năng điều khiển

1.4 Áp dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về chỉ

Lactobacillus

Các kĩ thuật gen thông thường được sử dụng nhiều trong nghiên cứu vi sinh vật là PCR, multiplex PCR, sequencing Có nhiều bài báo của các tạp chí uy tín trên thế giới đã công bố những kết quả nghiên cứu về chỉ Lacfobacilius rất đáng quan tâm Các nghiên cứu này đều tập trung đi sâu vào nghiên cứu sự khác nhau

ở mức độ phân tử của cấu trúc gen, đặc biệt là các chủng có quan hệ họ hàng

thân thích để lập nên cây phát sinh chủng giống trong tiến hoá

Qua phân tích trình tự của một số gen quan trọng, người ta đã tiến hành xác

định các gen quí hiếm và các gen có ích để thực hiện bảo tồn và phát triển công nghiệp hoá sinh Một số chủng đã xác định xong bản đồ gen, vị trí các gen quan

trọng, điểm khởi đầu quá trình sao chép ADN và trình tự các đoạn bảo thủ để

thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho kỹ thuật PCR [33],[17] Cấu trúc protein của một số enzym như purine 2° deoxyribosyltransferase cũng đã xác định ở mức

phân tử Dưới đây là cây phát sinh chủng giống của chi Lacfobacilius đã được công bố:

Hình 1.2 Cây phát sinh chủng giống dựa trên trình tự ADNr 16S

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất

- Bromo cresol purple (BCP) - dung dịch SDS

- Acid lactic chuẩn - dung dịch đệm TAE

- Pepton, cao nấm men - ethidium bromid

- Mồi cho phan ting PCR: primer MST,/MST,

- Vi khuẩn Lactobacilius được phân lập từ nước muối đưa, cà, các loại trái cây như: chuối, dứa, khế, đào, mận, xoài

2.1.2 Máy móc, thiết bị

- May siéu li tam Sigma (Sartorius)

- May chay PCR Perkin AM 9700 (Mỹ)

- May sequencing ABI prism 3100 Avant My

- Dia Petri, pipetman cac loại, ống eppendorf, ống nghiệm, đầu côn các loại

2.1.3 Một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu Môi trường phân lập vi khuẩn sinh acid (môi trường BCP) Cao nấm men

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic (môi trường MRS)

0,05¢

58

18g 1000ml pH = 6,8-7

Môi trường thử độ nhạy cảm của vi khuẩn Lactobacillus v6i vitamin B12 [10]

Các môi trường đều được thanh trùng ở 121°C; 0,6 atm trong 20 phút

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phản lập vỉ khuẩn sinh acid

Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường BCP, đây là môi trường chủ

yếu được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn sinh acid do khả năng đổi màu của

chỉ thị từ màu tím ở pH trung tính sang màu vàng ở pH acid (<4,5)

Phương pháp phân lập được sử dụng là phương pháp hai lớp thạch Cân

khoảng 5g mẫu trái cây rồi cắt nhỏ cho vào ống falcon chứa 20ml nước cất vô trùng, ngâm và lắc trong vòng 15 phút Lần lượt pha loãng ở nồng độ 102—— 107

và cấy trên đĩa Petri có chứa môi trường phân lập với độ dày từ 2-3mm Sau đó

đồ tiếp lớp thạch có nồng độ 1,5% đã đưa về nhiệt độ khoảng 45°C với độ dày khoảng 1-2mm Để các đĩa thạch trên vào tủ ấm 42°C trong 2-3 ngày rồi quan

sát

Đĩa thạch sau khi quan sát các khuẩn lạc có sự biến đổi môi trường xung quanh màu từ tím sang vàng sẽ được làm thuần khiết trên môi trường BCP Dùng kim mũi mác lật nhẹ lớp thạch trắng phía trên sao cho gọn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc vi khuẩn sinh acid rồi cấy ziczac nhiều lần trên đĩa Petri cho đến khi

thu được chủng thuần khiết Các đĩa Petri được nuôi cấy trong tủ ấm CO; ở nồng

độ 5% và nhiệt độ 379C

Các chủng vi khuẩn sinh acid được giữ giống và bảo quản trong ống nghiệm ở

nhiệt độ 5°C để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Lựa chon céc ching vi khudn Lactobacillus

Các vi khuẩn sinh acid ở trên được cấy truyền và nuôi cấy lỏng trong ống

nghiệm có chứa 15ml môi trường BCP ở nhiệt độ 37°C trong hai ngày Sau đó li tâm 4000 vòng/ phút lấy dịch Các ống nghiệm chứa dịch acid trên đựơc đem

phân tích khả năng sinh acid lactic

Dùng sắc kí lớp mỏng, pha động là hệ dung môi butanol: nước:methanol có tỉ

lệ 20:20:1, acid lactic chuẩn pha nồng độ 1% làm đối chiếu để phát hiện các dung dịch có chứa acid lactic Lần lượt chấm các dung dịch acid và dung dịch

acid lactic chuẩn lên bản mỏng có đánh dấu và kí hiệu riêng cho từng mẫu Bản mỏng được đặt trong bình đã chứa sẵn hệ dung môi cho tới khi pha động chạy lên tới 2/3 bản sắc kí thì lấy ra làm bay hơi hết dung môi

Các vết acid trên bản mỏng được phát hiện bằng xanh bromophenol Đối chiếu với vết của acid sinh ra trong dịch nuôi cấy và vết của acid lactic chuẩn để

kết luận chủng vi khuẩn sinh acid lactic

Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic được nuôi cấy trên môi trường MRS trong hai ngày Dùng que cấy lấy khuẩn lạc vi khuẩn sinh acid lactic rồi cho lên

lam kính, sau đó nhỏ dung dịch NaOH 5% lên khuẩn lạc Nếu khuẩn lạc tan

trong dung dịch NaOH làm dung dịch hơi nhầy và trong hơn thì sơ bộ kết luận là

vi khuẩn G(-), nếu không tan trong dung dịch NaOH, dung dịch đục hơn thì vi

khuẩn đó cơ bản là G(+) Vi khuẩn G(+) và sinh acid lactic thì có thể sơ bộ kết

luận thuộc chi Lacfobacillus

2.2.3 Sơ bộ tìm ching Lactobacillus cé kha năng sinh tổng hợp acid lacfic

cao

Cac chung Lacfobacius phân lập được lần lượt cấy trong bình nón chứa

150ml] môi trường MRS lỏng đã điều chỉnh pH về 6,8 rồi nuôi ở 37°C trong bốn

ngày Lần lượt lấy 15ml dung dịch nuôi cấy đem kiểm tra độ pH để xác định khả

năng lên men lactic tại các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72, 96 giờ Dung dịch nuôi

cấy thu được đem li tâm 4000 vòng/phút để lấy dich acid lactic Dich acid lactic lân lượt được đo độ pH bằng máy đo pH Dung dịch nào cho độ pH thấp nhất thì

khả năng sinh acid lactic của chủng tương ứng là cao nhất so với các chủng còn

lại

2.2.4 Thử độ nhạy cẩm của ching Lactobacillus với vifamin B12

Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường số 3, đây là môi trường

có đặc điểm nghèo dinh dưỡng, chỉ những chủng Lactobacillus nao nhay cam và

sử dụng vitamin B12 làm chất sinh trưởng mới tồn tại và phát triển được

Cách tiến hành:

Chuẩn bị nhũ dịch vi khuẩn Lacfobacilius: Vì sinh vật kiểm định được giữ

giống và nuôi cấy trên môi trường MRS đặc, sau đó được nuôi cấy trong môi

trường MRS lỏng ở 37°C/24h Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút để lấy tủa Rửa tủa hai lần bằng nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng rồi hoà vi khuẩn trong

dung dich NaCl 0,9% thành nhũ dịch tế bào có nồng độ 1,5.10” tế bào/ mI

Môi trường thử độ nhạy cảm vitamin B12 sau khi hấp thanh trùng được để

nguội đến 45°C Cho nhii dich vi khudn Lactobacillus di chuan bị ở trên vào lắc

đều và đổ vào các đĩa Petri (3 đĩa/ mẫu) khoảng 20ml Để đông đặc và đem đục 4

lỗ bằng bộ đục lỗ chân không

Dùng pipetman nhỏ 0,1ml dung dịch vitamin B12 nồng độ 5uùg/ml vào các lỗ

đã đục rồi để hộp Petri trong tủ ấm 37°C/ 24h và đọc kết quả

Chủng Lacfobacilius nào nhạy cảm với vitamin B12 sẽ mọc thành vòng tròn

hữu khuẩn Đường kính vòng phát triển càng rõ thì độ nhạy cảm càng cao

Sau khi chọn được chủng vi khuẩn Lactobacillus c6 hiéu suat tong hop acid

lactic cao và chủng nhạy cảm với vitamin B12 tốt nhất từ những thí nghiệm trên, tiến hành định tên bằng phương pháp sinh học phân tử, đọc trình tự của gen mã hoa ribosom 16S

2.2.5 Dinh tén Lactobacillus bang sinh hoc phan tu

2.2.5.1 Tach chiết ADN

Neguyén tac: Thanh tế bào vi sinh vật được phá vỡ nhờ lysozym và các chất

tẩy mạnh như SDS — tris- HCI giúp giải phóng toàn bộ ADN của vi khuẩn

Protein va ARN được tách ra khỏi ADN nhờ các enzym ARNase, protease và các

dung môi cloroform:phenol (1:1) Cuối cùng ADN được tủa bằng ethanol tuyệt

đối

Tiến hành:

- Dung eppendorf v6 trùng loai 1,5 ml, hit 500ul dung dich SDS

- Cho hai vong que cấy chủng Lacfobacillus cần tách ADN vào mỗi ống

- - Lắc đều và đun ở 100°C trong 10 phút, bước này được thực hiện trên máy

thermomexIxer Eppendorf

- - Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 2 phút

- _ Hút bỏ phần dịch phía trên và rửa tủa bằng nước cất vô trùng

- - Thêm 100ul hạt thuỷ tinh và 100ul1 hỗn hợp phenol:cloroform (1:1)

- Lac manh trong 10 phút

- _ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- - Lấy 10Hl dịch phía trên và thêm 50Oul nước cất vô trùng Giữ lạnh để chạy

PCR

2.2.5.2 Tiến hành phản ting PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nguyên tắc: Phương pháp nay su dụng ADN polymerase va cdc oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn được nhân lên

nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi khuẩn Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được khuyếch đại khi biết trình

tự nucleotid ở hai đầu, ta đã tổng hợp được cặp mồi bổ sung với trình tự của hai điểm từ đầu 5' tới đầu 3” của sợi bổ sung và nhờ có enzym ADN polymerase mà ADN khuôn được tổng hợp khi đã có sắn dNTP

vừa mới được tổng hợp ở các chu kỳ trước thành khuôn cho chu kỳ sau Số chu

kỳ được lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường không quá 30 chu kỳ và mỗi

phản ứng PCR thường kéo dài khoảng 2-3 giờ Khi thực hiện PCR, một số yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới kết quả của phản ứng như: nồng độ mồi, nhiệt độ và thời

gian ủ mồi, nồng độ ADN khuôn, nồng độ một số ion (Mg”” )

Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR

Trình tự mồi:

mồi xuôi †16S-8F (5°-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

mồi ngược 16S1510R (5-GGCTACCTTGTTACGA-3)

- Công thức cho một phan tng PCR

Chuong trinh chay PCR

- Bién tinh ADN 6 94°C trong hai phút

- Chay nhac lai 25 chu ky tai 94°C trong 1 phút; 52°C trong một phút; 72°C trong 2 phút

Tổng hợp : 72°C trong 10 phút

Kết thúc chương trình, đưa nhiệt độ về 4°C để bảo quản

e_ Kiểm tra sản phẩm PCR bang dién di trén gel agarose

- Pha dém: dung dich TAE x0,5

- D6 gel: can 0,8-1,2g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm 0,5 x TAE, đun sôi cho tới khi tan hết agarose Lắc đều và để nguội xuống khoảng 40-50°C

Đổ gel vào khay đã cài sẵn lược, để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược rồi

đặt khay gel vào máy điện di

- Tra mau: dịch PCR được trộn cùng với chất tạo màu là xanh bromophenol trên giấy parafin Tiếp đó dùng pipetman tra mẫu vào từng giếng