d Các loại môi trường: - Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 gibco hoặc sigma - Môi trường RP - Môi trường đầy đủ có 10% huyết thanh RPHS - Môi trường đầy đủ RPHS - Hematocrit - Hepès Tùy the
Trang 1Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013
26
pituitary function after brain injury – induced
hypopiyuitarism: A prospective 12 month study” JCEM
90: 6085 – 6092
4 Bondanelli M, de Marinis L, Ambrosio MR, Monesi
M, Valle D, Zatelli MC, Fusco A, Bianchi A, Farneti M &
degli Uberti EC, (2004) “Occurrence of pituitary
dysfunction following traumatic brain injury”, Journal of
Neurotrauma 21: 685–696
5 Brooke AM, Kalingag LA, Miraki-Moud F, et al
(2006) “Dehydroepiandrosterone (DHEA) replacement
reduces growth hormone (GH) dose requirement in
female hypopituitary patients on GH replacement” Clin
Endocrinol (Oxf) 65(5):673–80
6 Bushnik T, Englander J & Katznelson L (2007).”
Fatigue after TBI: association with neuroendocrine
abnormalities” Brain Injury 21 559–566
7 F Bernard1, J Outtrim, D K Menon and B F
Matta (2006) “Incidence of adrenal insufficiency after severe traumatic brain injury varies according to
definition used: clinical implications” British Journal of Anaesthesia 96 (1): 72–6
8 Ghigo E, Masel E, Aimaretti G, et al (2005),
“Consensus guidlines on screening for hypopituitarism
following traumatic brain injury”, Brain Injury 19:711–
724
9 Herrmann BL, Rehder J (2006) “ Hypopituitarism
following severe traumatic brain injury” Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes 114 316–321
10 Kelly DF, Gaw Gonzalo IT, Cohan P, Berman N, Swedloff R, Wang C (2000), “Hypopituitarism following traumatic brain injury and aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a preliminary report”, Journal of Neurosurgery 93:743–752
Kü THUËT NU¤I CÊY Vµ B¶O QU¶N P.FALCIPARUM DµI NGµY
TRONG PHßNG THÝ NGHIÖM
Lª Thµnh §ång, TrÞnh Ngäc H¶i
Vin St rét - KST - CT TP H Chí Minh
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu khoa học và
thực hiện các thử nghiệm đánh giá hiệu lực của các
thuốc điều trị sốt rét, đồng thời phục vụ cho công tác
giảng dạy Sau một thời gian dài thực hiện việc nuôi
cấy, bảo quản ký sinh trùng sốt rét Plasmodium
falciparum trong phòng thí nghiệm, Viện Sốt rét - Ký
sinh trùng - Côn trùng TP Hồ Chí Minh đã nghiên
cứu, bổ sung hoàn thiện các nội dung kỹ thuật, các
thành phần, tiêu chuẩn, điều kiện nuôi cấy, bảo quản
và tổ chức biên soạn thành tài liệu hướng dẫn kỹ
thuật nuôi và bảo quản Plasmodium falciparum ở
phòng thí nghiệm Tài liệu này đã được Hội đồng
Khoa học kỹ thuật và các chuyên gia, các nhà khoa
học góp ý và thống nhất thông qua
KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN
1 Điều kiện phòng nuôi cấy và trang thiết bị,
dụng cụ, vật tư
1.1 Điu kin phòng
Phòng nuôi cấy phải đảm bảo đủ diện tích để lắp
đặt các buồng nuôi, có lối đi, nơi đứng thao tác, có
điều hoà không khí, máy hút ẩm và đèn cực tím
a) Trang thiết bị, dụng cụ cố định:
- Box vô trùng,
- Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu
- Nồi cách thuỷ, nồi hấp, bình đựng nitơ lỏng
- Phích đá, cân phân tích, máy đo pH, kính hiển vi
- Máy cất nước 1 và 2 lần, bình nuôi (dessicator),
chai 20ml,100ml
- Tủ CO2, máy ly tâm lớn, nhỏ; máy sấy tóc, lọ thủy
tinh 5ml
- Điều hòa không khí, máy hút ẩm, đèn cực tím
- Pipett eppendoft 5,10,100,200,500,1000µl
- Quả bóp cao su, pipett aid
b) Vật tư, dung môi, hóa chất tiêu hao:
- Màng lọc millipore kích thước 0,22µl
- Kim bướm, bơm tiêm 1, 2, 5 và 10 ml
- Nitơ lỏng, mẫu máu, lam kính
- Dung dịch sulfocromic đậm đặc
- Ethanol và methanol
- Chất chống đông: heparin 5000 IU
- NaHCO3 5%, sorbitol 5%, RPHS, pH, bột RPMI
1640, glucoza
- Giemsa với dung dịch đệm pH 7,2
- Gentamicine
- NaOH, axit citric, natricitrat, NaCl 0,9%, glyxerol
Lưu ý: Các hoá chất phải có hạn sử dụng và bảo quản đúng theo yêu cầu
d) Các loại môi trường:
- Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (gibco hoặc sigma)
- Môi trường RP
- Môi trường đầy đủ có 10% huyết thanh (RPHS)
- Môi trường đầy đủ (RPHS)
- Hematocrit
- Hepès Tùy theo nhu cầu mà mua sắm các dụng cụ, vật
tư, hóa chất và môi trường đủ đáp ứng
2 Nguyên tắc vô trùng trong thu thập mẫu và nuôi cấy
2.1 Nguyên t c vô trùng trong thu th p m u
- Nơi tiến hành lấy máu phải thoáng và sạch
- Tất cả các dụng cụ dùng cho thực nghiệm phải
vô trùng Sát trùng bằng cồn ethanol 70o trước khi
mở các lọ môi trường và hoá chất
- Kiểm tra tất cả các dụng cụ trước khi tiến hành thử nghiệm, tránh dùng những dụng cụ hỏng hoặc không tốt
Trang 2Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013 27
- Thao tác kỹ thuật phải đảm bảo vô trùng, tránh
tạp nhiễm
- Rửa sạch tay bệnh nhân trước khi lấy máu bằng
xà phòng và sát trùng bằng cồn ethanol 70o
- Không dùng chung kim chích máu
- Để đề phòng các bệnh lây nhiễm qua đường máu
(HIV, HBV…) phải dùng găng tay khi tiếp xúc với máu
của bệnh nhân Tránh máu dính vào da hoặc qua các
niêm mạc mắt, mũi Rửa tay trước và sau khi làm việc
với xà phòng sau đó dùng ethanol 70o để sát trùng
- Khi ly tâm các mẫu máu không dùng quá tốc độ
cho phép tránh gây vỡ
- Khi vận chuyển các mẫu máu phải vặn chặt nắp
cẩn thận và đựng trong túi nilon kín
- Tất cả các dụng cụ làm xong phải được rửa lại
bằng xà phòng và sát trùng với ethanol 70o
- Những rác thải (kim, bơm tiêm, bông, các phiến
nhựa đã dùng…) phải được để vào nơi qui định về
chất thải y tế
2.2 Nguyên t c vô trùng trong nuôi cy ti
phòng thí nghim
- Các dung dịch dùng trong nuôi cấy phải được
lọc vô trùng qua màng lọc millipore 0,22µm và bảo
quản ở 4oC hoặc -20oC tuỳ theo từng loại
- Tất cả dụng cụ thuỷ tinh phải được ngâm trong
dung dịch sulfocromic đậm đặc ít nhất 3 giờ Rửa
sạch dưới vòi nước và ngâm trong nước cất (3 lần)
Để khô và sấy vô trùng ở nhiệt độ 180oC trong 30
phút Đối với những nắp nhựa hoặc cao su hấp ướt ở
120-150oC Những dụng cụ bằng nhựa khác chỉ dùng
1 lần Những dụng cụ đã được sấy, hấp phải để vào
một tủ sạch riêng biệt
- Khi rửa các dụng cụ bằng thuỷ tinh phải đeo
găng tay dày Đeo kính và găng tay khi tiếp xúc với
dung dịch sulfocromic đậm đặc
- Khi làm việc trong phòng vô trùng phải có áo
choàng Rửa tay, đeo găng và sát trùng bàn bằng
cồn ethanol 70 o trước và sau khi làm việc
- Các pipett dùng trong nuôi cấy KST phải dùng
quả bóp cao su hoặc pipett trợ giúp (pipett aid),
không dùng miệng để hút
- Tất cả các dụng cụ bẩn đều được bỏ vào thùng
đựng rác và chuyển ra khỏi phòng vô trùng sau khi
đã làm xong
- Cuối ngày phải vệ sinh lại phòng và bật đèn cực
tím qua đêm
3 Các bước thực hiện
- Lấy 10ml máu tĩnh mạch nhóm O (hoặc A) cho
vào tube, ly tâm có chứa chất chống đông: 0,25-0,3ml
ACD cho 1 ml máu hoặc heparin (20 đơn vị / ml)
- Trộn đều máu và ACD
- Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút Hút bỏ phần nổi.
- Thêm môi trường RP (môi trường không có
huyết thanh) vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 5:1
- Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút Hút bỏ phần nổi Rửa
2 lần với môi trường RP Lần thứ 3 rửa với môi
trường đầy đủ có 10% huyết thanh (RPHS)
- Trộn cặn hồng cầu với môi trường đầy đủ
(RPHS) để có dịch treo 40% (4 ml cặn + 6 ml RPHS)
- Chia vào các lọ nhỏ (2-3ml)
- Ghi ngày lấy máu
- Bảo quản ở 4oC trong vòng 30 ngày
- Kiểm tra vô trùng: Lấy 1 ít hồng cầu vừa rửa cho vào lọ có chứa 1ml môi trường RPMI, đặt vào tủ ấm
37oC trong 24h Nếu tủa trắng đục là nhiễm trùng, phải bỏ đi
- Lấy 250ml máu nhóm O (hoặc AB với các chủng mới phân lập), không chống đông cho vào chai hoặc
lọ thủy tinh vô trùng
- Để lọ nằm nghiêng (thể tích càng rộng, sự tách huyết thanh càng lớn)
- Để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ, sau đó để tủ lạnh
4oC qua đêm
- Dùng pipett nhẹ nhàng hút phần huyết thanh nổi ở trên chia vào các lọ nhỏ để tiện sử dụng (1,1ml/10 ml môi trường) Phần huyết thanh có lẫn hồng cầu chuyển vào tube ly tâm Ly tâm 2.000 vòng trong 5 phút Hút phần huyết thanh nổi ở trên chia vào các lọ nhỏ
- Ghi tên nhóm máu, số lượng và ngày tách trên lọ
- Kiểm tra vô trùng giống như với hồng cầu
- Tiệt trùng huyết thanh ở 56oC trong 30 phút (đặt trong nồi cách thủy, chú ý không để nước ngập tới nắp của lọ)
- Để nguội và bảo quản ở -20oC trong vòng 30 ngày
ngày
- Môi trường RP để rửa hồng cầu
- Môi trường đầy đủ RPHS
Huyết thanh O (AB) 10% 1,2 ml Bảo quản ở 4oC trong vòng 1 tuần
falciparum
a) Thu thập trực tiếp từ bệnh nhân:
- Sau khi khẳng định bệnh nhân nhiễm P.falciparum đơn thuần Đếm mật độ ký sinh trùng,
nếu trên 0,1% nuôi cấy sẽ thành công hơn Lấy 1-2
ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân chuyển vào lọ vô trùng đã có sẵn dung dịch chống đông Lắc đều, ly tâm 2000 vòng trong 5 phút
- Hút bỏ phần nổi Rửa 3 lần với môi trường đầy
đủ RPHS
- Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ với hematocrit là 4%
- Chuyển hỗn dịch này vào đĩa nuôi hoặc lọ nuôi tùy theo kích thước của đĩa hoặc lọ nuôi:
+ Đĩa nuôi có đường kính 35mm cho vào 1,5ml hỗn dịch máu và môi trường
+ Đĩa 60mm cho vào 4 ml hỗn dịch máu và môi trường
+ Lọ có diện tích 25 cm2 cho 4 ml
+ Phiến nhựa 24 giếng cho 0,5 ml
Trang 3Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013
28
- Xoay nhẹ đĩa nuôi cho máu phủ đều đáy
- Cho đĩa vào bình nuôi (Desicator), đốt nến đợi
khi nến gần tắt khóa vòi của bình nuôi (5% O2, 5%
CO2 và 90% N2)
- Đặt bình nuôi vào tủ ấm 37oC ± 0,5oC
Chú ý:
- Trường hợp thu thập máu ở xa phòng thí
nghiệm, vận chuyển máu bằng cách: Lấy 5ml máu
bệnh nhân cho vào lọ vô trùng có sẵn 5ml RPMI 1640
và 10µl heparin (lọ 5000 đơn vị / ml) Hỗn dịch này để
ở nhiệt độ phòng trong vòng 8 giờ Hoặc giữ trong
nước đá 36 giờ nhưng chú ý không đặt tiếp xúc trực
tiếp với đá Sau đó tiến hành theo các bước như thu
thập trực tiếp từ bệnh nhân
- Giữ máu trong đông lạnh (nitơ lỏng) bằng cách ly
tâm mẫu máu 2000 vòng trong 5 phút Hút bỏ phần
nổi Thêm đồng thể tích dung dịch đông lạnh vào cặn
hồng cầu và chuyển vào tube đông lạnh Ghi tên bệnh
nhân hoặc số hiệu, ngày lấy máu rồi cho ngay vào
bình nitơ lỏng Khi có điều kiện sẽ lấy ra để nuôi cấy
b) Nuôi cấy các mẫu từ trong nitơ lỏng (phá đông)
- Lấy các mẫu từ trong nitơ lỏng ra và làm tan
đông bằng cách đặt tube máu vào nồi cách thuỷ 370C
trong 1-2 phút
- Chuyển máu đã được làm tan sang tube ly tâm
- Cho đồng thể tích dung dịch sorbitol 27% (nhỏ
từng giọt và trộn nhẹ nhàng)
- Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút
- Hút bỏ phần nổi
- Thêm sorbitol 5% vào cặn hồng cầu theo tỉ lệ
(2:1) Trộn nhẹ nhàng sau khi nhỏ từng giọt Rửa 2
lần với sorbitol 5%
- Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút
- Hút bỏ phần nổi
- Thêm RPHS vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 2:1 và
rửa 3 lần
- Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút Hút bỏ phần nổi
- Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ (RPHS)
với 20% huyết thanh để có dịch treo 4%
- Chia vào các đĩa hoặc lọ nuôi theo kích thước
Pha môi trường đầy đủ (RPHS) và đặt vào tủ ấm ít
nhất 30 phút trước khi thay môi trường hàng ngày
Chú ý nếu pH của môi trường quá kiềm (chuyển thành
màu hồng cánh sen phải bỏ đi và pha môi trường
mới) Lấy bình nuôi ra khỏi tủ ấm, mở khóa bình, lấy
các đĩa nuôi đặt lên mặt bàn của box vô trùng
hàng ngày
- Nhẹ nhàng nghiêng đĩa nuôi tránh xáo trộn Dùng
pipett pasteur vô trùng, nhẹ nhàng hút bỏ phần môi
trường ở phía trên (tránh hút hồng cầu ở phía dưới)
- Dùng pipett vô trùng lấy khoảng 2-5 µl làm tiêu bản
lam giọt đàn Sau đó cho môi trường mới vào đĩa nuôi,
lắc nhẹ để trộn đều máu và môi trường Cho đĩa vào
bình nuôi, đốt nến, khóa vòi và đặt vào tủ ấm 37oC
- Khi lam khô, cố định bằng methanol tuyệt đối và
nhuộm giemsa với dung dịch đệm pH 7,2
- Để lam khô tự nhiên hoặc dùng máy sấy tóc
- Soi lam dưới vật kính dầu 100, thị kính 10
- Đếm hồng cầu nhiễm KST thể vô tính theo 2.000
- 3.000 hồng cầu (khoảng 10 vi trường)
- Tính phần trăm hồng cầu nhiễm theo công thức sau:
Số hồng cầu nhiễm KST đếm được / Tống số hồng cầu đếm được (cả nhiễm và không nhiễm) x 100
- Ghi kết quả vào sổ theo dõi hàng ngày
4 Phụ lục 1 Pha hóa chất và môi trường cho nuôi cấy KST dài ngày
- Chỉnh pH đến 6,8 bằng dung dịch NaOH 1N sao cho khi thêm 0,42ml NaHCO3 /10 ml môi trường sẽ
có pH 7,2 - 7,5
- Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ Ghi ngày pha, thử
vô trùng và bảo quản ở -20 oC trong vòng 1 tháng
- Kiểm tra vô trùng: Lấy 1ml môi trường RPMI, đặt vào tủ ấm 37oC trong 24h Nếu tủa trắng đục là nhiễm trùng, phải bỏ đi
4.2 Pha NaHCO 3 5%
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ Ghi cẩn thận ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở 4oC trong vòng 1 tháng
4.3 Dung dch chng đông ACD
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và cho vào lọ vô trùng Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở 4oC trong vòng 1 tháng Dùng 0,2-0,3ml/ml máu
4.4 Dung dch đông lnh
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -200C
4.5 Dung dch phá đông
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -200C
Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -200C
... su pipett trợ gi? ?p (pipett aid), < /p>không dùng miệng để hút < /p>
- Tất dụng cụ bẩn bỏ vào thùng < /p>
đựng rác chuyển khỏi phịng vơ trùng sau < /p>
đã làm xong < /p>
- Cuối ngày phải... trường đầy đủ < /p>
(RPHS) để có dịch treo 40% (4 ml cặn + ml RPHS) < /p>
- Chia vào lọ nhỏ (2-3ml) < /p>
- Ghi ngày lấy máu < /p>
- Bảo quản 4oC vòng 30 ngày < /p>
- Kiểm tra vơ... 5% < /p>
- Ly tâm 2000 vòng phút < /p>
- Hút bỏ phần < /p>
- Thêm RPHS vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 2:1 < /p>
rửa lần < /p>
- Ly tâm 2000 vòng phút Hút bỏ phần < /p>
- Treo hồng cầu vào môi