A B Hình 2: A Cây phả hệ phân loài của vi rút Rhino trong bài nghiên cứu.. Đặc điểm dịch tễ học của các ca bệnh nhiễm vi rút Rhino: So sánh sự phân bố theo tỉnh, năm, giới tính cho t
Trang 1Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 51
ứng dụng tạo plasmid tái tổ hợp để nghiên cứu các chủng vi rút Rhino
lưu hành tại Khánh Hòa và Bình Định năm 2008-2010
Huỳnh Kim Mai, Trịnh Thị Xuân Mai
Viện Pasteur Nha Trang
TểM TẮT
30 chủng vi rỳt Rhino thu thập từ những bệnh
nhõn nhiễm trựng đường hụ hấp cấp ở hai tỉnh Khỏnh
Hũa và Bỡnh Định từ năm 2008 đến năm 2010 được
ứng dụng tạo plasmid tỏi tổ hợp để giải tự vựng gen
5’UTR-VP4/2 của vi rỳt Rhino Kết quả phõn tớch trỡnh
tự cho thấy, cú sự lưu hành của cả 3 loài
HRV-A, HRV-B, và HRV-C, trong đú, HRV-A chiếm ưu
thế (50,0%), tiếp đến là HRV-C (33,3%) và cuối cựng
là HRV-B (16,7%) Tỷ lệ mắc của cỏc loài cú sự khỏc
biệt rừ theo nhúm tuổi (p<0.05) Trẻ em nhỏ chủ
yếu mắc HRV-C, trong khi đú người lớn lại mắc
HRV-A Ngoài ra, kết quả phõn tớch cõy phả hệ cũn
cho thấy, cỏc chủng vi rỳt Rhino trong bài nghiờn cứu
cũng cú sự biến đổi đa dạng trong trỡnh tự nucleotit
và phõn thành nhiều kiểu huyết thanh khỏc nhau
Cỏc chủng HRV-A trong bài nghiờn cứu cú liờn quan
đến cỏc kiểu huyết thanh HRV56, HRV47,
HRV81, HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12,
cũn HRV-B lại cú kiểu huyết thanh HRV92, HRV35,
HRV87, HRV-C thỡ cú tương quan gần với cỏc chủng
NAT001_CA (Mỹ), C025-Hongkong, NAT 045_CA
(Mỹ); N4, N10 (Thượng Hải), và HRVC-35 Sự biến
đổi đa dạng cú thể là nguyờn nhõn khiến cho Rhino là
tỏc nhõn hàng đầu trong cỏc ca nhiễm vi rỳt hụ hấp ở
miền Trung Việt Nam
Từ khoỏ: Vi rỳt Rhino, HRV-A, HRV-B, HRV-C
SUMMARY
Rhinovirus from ARI patients in Khanh Hoa and Binh
Dinh province collected during 2008 to 2010
were cloned for sequencing Sequencing analysis
results indicated that all HRV-A, HRV-B, and HRV-C
were detected with the highest proportion of HRV-A
(50%), followed by HRV-C (33.3%) and HRV-B
(16.7%) Distribution of each species was
significantly different by age groups HRV-C
was predominant in children while HRV-A in adult In
addition, phylogenetic tree analysis showed that the
Rhino strains in this study were diverse in nucleotide
sequence and distributed into several different
serotypes such as HRV56, HRV47, HRV81,
HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12 (for
HRV-A), HRV92, HRV35, HRV87 (for HRV-B)
HRV-C related to NAT001_CA (USD),
C025-Hongkong, NAT 045_CA (USD); N4, N10
(Shanghai), and HRVC-35 The genetic diversity may
induced the turnover of rhinovirus which was a
leading cause of respiratory virus infections in Central
Vietnam
Keyword: Rhinovirus, HRV-A, HRV-B, HRV-C
ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng viờm đường hụ hấp cấp là bệnh rất phổ biến và dễ bị mắc phải ở mọi lứa tuổi, đặc biệt là trẻ em Bệnh do tỏc nhõn vi rỳt hụ hấp gõy ra như vi rỳt Rhino (HRV), vi rỳt hụ hấp hợp bào (RSV), vi rỳt cỳm, vi rỳt ỏ cỳm (parainfluenza), v.v , trong số
đú, Rhino là vi rỳt chiếm ưu thế nhất [1,4] Cú hơn 100 kiểu huyết thanh (serotype) của vi rỳt Rhino đó được xỏc định và phõn thành ba loài chớnh HRV-A, B, C [10] Tỷ lệ mắc vi rỳt Rhino cũng rất phổ biến ở miền Trung Việt Nam [8], tuy nhiờn, việc xỏc định sự phõn loài cũng như trỡnh tự gen của vi rỳt Rhino vẫn chưa cú nghiờn cứu nào cụng bố Do vậy,
đề tài này đó ứng dụng kỹ thuật tạo dũng để giải trỡnh
tự vựng gen 5’UTR-VP4/2 của vi rỳt Rhino và so sỏnh với cỏc chủng đó cụng bố trờn thế giới nhằm xỏc định loài, sự liờn quan đến cỏc kiểu huyết thanh và đặc điểm dịch tễ học của một số chủng vi rỳt Rhino lưu hành tại hai tỉnh Khỏnh Hoà và Bỡnh Định từ năm 2008-2009
MẪU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
1 Mẫu nghiờn cứu: Bao gồm 30 mẫu dịch ngoỏy
họng của bệnh nhõn cú triệu chứng viờm đường hụ hấp cấp thu thập tại hai tỉnh Khỏnh Hũa, và Bỡnh Định
từ năm 2008- 2010, cú kết quả xột nghiệm dương tớnh với vi rỳt Rhino và khụng đồng nhiễm với cỏc vi rỳt hụ hấp khỏc
2 Phương phỏp nghiờn cứu: Đoạn gen
5’UTR-VP4/2 của vi rỳt Rhino được khuyếch đại bằng phản ứng RT-PCR, sau đú được tinh sạch và gắn chốn vào plasmid pGEMđ -T (Promega) để tạo plasmid tỏi tổ hợp Plasmid tỏi tổ hợp tiếp tục được
sử dụng làm khuụn cho phản ứng giải trỡnh tự đoạn chốn của vi rỳt Rhino với 4 cặp mồi M13-F, M13-R, 5UTR-F và VP4/2-R Kết quả giải trỡnh tự được xử lý bằng cỏc phần mềm CLC viewer 6.5.3, FinchTV và Mega 5.0
KẾT QUẢ
1 Kết quả tạo plasmid tỏi tổ hợp: Đó tạo được
thành cụng 30 mẫu plasmid tỏi tổ hợp chứa đoạn 5’UTR-VP4/2 (dài khoảng 923 bp) của vi rỳt Rhino nằm chốn giữa hai vị trớ enzyme cắt giới hạn
EcoRI cú trỡnh tự (5’-GAATTC-3’) của vector
pGEM-T (Hỡnh 1)
2 Kết quả xỏc định sự phõn loài của vi rỳt Rhino: Với 30 mẫu phõn tớch, đó xỏc định vi rỳt
Rhino cú 3 loài HRV-A, HRV-B, và HRV-C ứng với 3 nhỏnh của cõy phả hệ (hỡnh 2A), trong đú cú 15 mẫu thuộc loài HRV-A (chiếm tỷ lệ 50,0 %), 5 mẫu thuộc loài HRV-B (chiếm tỷ lệ 16,7%), và 10 mẫu thuộc loài HRV-C (chiếm tỷ lệ 33,3%) (hỡnh 2B)
Trang 2Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 52
Đoạn chèn
Vi rút Rhino (~923bp)
Hình 1: Cấu trúc của plasmid tái tổ hợp thu được
A
B
Hình 2: (A) Cây phả hệ phân loài của vi rút Rhino trong bài nghiên cứu (B) Tỷ lệ phân bố của các loài
3 Đặc điểm dịch tễ học của các ca bệnh nhiễm
vi rút Rhino: So sánh sự phân bố theo tỉnh, năm, giới
tính cho thấy tỷ lệ phân bố của 3 loài HRV-A, B, và C có
sự khác nhau, tuy nhiên sự khác nhau chưa có ý nghĩa
thống kê (p>0.05) Riêng đối với phân bố theo nhóm tuổi, sự khác biệt lại rõ rệt và có ý nghĩa (p<0.05) Theo
đó, nhóm tuổi trẻ em chủ yếu mắc HRV-C trong khi ở người lớn lại chủ yếu mắc HRV-A (hình 3)
4 Kết quả phân tích các kiểu huyết thanh của
vi rút Rhino: Phân tích cây phả hệ cho thấy, các
chủng HRV-A trong bài nghiên cứu có liên quan đến các kiểu huyết thanh HRV56, HRV47, HRV81, HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12, còn các chủng HRV-B lại có kiểu huyết thanh HRV92, HRV35, HRV87 trong khi đó HRV-C có tương quan gần với các chủng NAT001_CA (Mỹ), C025-Hongkong, NAT 045_CA (Mỹ); N4, N10 (Thượng Hải), và HRVC-35
HÌNH 1 TRANG
Trang 3Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 53
BÀN LUẬN
Cả 3 loài HRV-A, B, C đều được xác định có lưu
hành tại Khánh Hoà và Bình Định, hai tỉnh thuộc khu
vực miền Trung Việt Nam Trong đó, HRV-A và C
chiếm ưu thế Kết quả này tương đồng với nhiều
công bố của các tác giả khác trên thế giới như tác
giả Wisdom A và cs, 2009, nghiên cứu tỷ lệ
nhiễm HRV trên bệnh nhân viêm đường hô hấp ở
Anh cho kết quả tỷ lệ HRV-A chiếm cao nhất với
63%, HRV-C chiếm 30%, HRV-B chiếm tỷ lệ thấp với
7% [7] Tác giả Huang T và cs, 2009, tác giả Heidi E
Smut và cs, 2011, công bố tỷ lệ HRV-C chiếm ưu thế
ở trẻ em bị viêm đường hô hấp cấp ở Thượng Hải
(Trung Quốc) và Châu Phi [5,3] Cả hai loài A, và C
đều có liên quan đến tính chất gây bệnh nặng của vi
rút Rhino [2,6] Như vậy, kết quả lưu hành chiếm ưu
thế của chủng HRV-A, và HRV-C giúp cảnh báo việc
nhiễm vi rút Rhino ở miền Trung Việt Nam rất cần
được sự quan tâm của ngành Y tế Về mặt dịch tễ
học, tuy nghiên cứu trên cỡ mẫu nhỏ nhưng cũng
cho thấy rõ sự khác nhau giữa tỷ lệ nhiễm vi rút
Rhino ở nhóm lứa tuổi trẻ em và người lớn Kết quả
này tương tự với kết quả của tác giả Wisdom và cs
HRV-C chiếm tỷ lệ cao ở lứa tuổi 1-2, không thấy
HRV-C ở lứa tuổi 37-65 và trên 65 [7] Nghiên cứu
của tác giả Huang T và cs cũng kết luận tỷ lệ HRV-C
ở trẻ em là chiếm ưu thế [5] Bài nghiên cứu còn cho
thấy sự đa dạng về di truyền trong các chủng HRV ở
miền Trung Việt Nam thể hiện ở mối liên quan đến 17
kiểu huyết thanh khác nhau (trung bình cứ khoảng
1,7 chủng được phát hiện là thuộc một kiểu huyết
thanh) Nhận định này phù hợp với công trình nghiên
cứu của tác giả Mardis và cs, 2007 , vi rút Rhino có
trình tự di truyền rất đa dạng điều này lý giải tỷ lệ
nhiễm vi rút Rhino thường cao ở các bệnh nhân viêm
đường hô hấp [9]
KẾT LUẬN
Bài nghiên cứu đã giúp xác định được loài, và sự
liên quan đến các kiểu huyết thanh của một số chủng
vi rút Rhino lưu hành tại Khánh Hoà và Bình Định
năm 2008-2010 Kết quả cho thấy cả 3 loài HRV-A,
B, C đều phát hiện lưu hành ở miền Trung Việt Nam,
trong đó HRV- A chiếm tỷ lệ cao nhất (50,0%), tiếp
đến là HRV-C (33,3%), và HRV-B chỉ chiếm một tỷ lệ
thấp (16,7%) Tỷ lệ mắc giữa các loài cũng có sự
khác biệt rõ theo nhóm tuổi, HRV-C chủ yếu mắc ở
trẻ nhỏ, HRV-A lại chủ yếu ở nhóm tuổi lớn hơn Các
chủng có sự biến đổi đa dạng trong trình tự nucleotit
và tương ứng với nhiều kiểu huyết thanh khác nhau
Sự biến đổi đa dạng có thể là nguyên nhân khiến cho
Rhino là tác nhân hàng đầu của các ca nhiễm vi rút
hô hấp ở miền Trung Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 De Almeida MB, Zerbinati RM, Tateno AF, Oliveira CM, Romão RM, Rodrigues JC, Pannuti
CS, da Silva Filho LV, (2010), “Rhinovirus C and respiratory exacerbations in children with cystic
fibrosis”, Emerg Infect Dis, 16(6): 996-9
2 Fuji N, Suzuki A, Lupisan S, Sombrero L, Galang H, Kamigaki T, Tamaki R, Saito M, Aniceto R, Olveda R, Oshitani H, (2011),
“Detection of human Rhinovirus C viral genome in blood among children with severe respiratory infections in the Philippines” PLoS One,
6(11):E27247
3 Heidi E Smuts, Lesley J Workman, Heather J Zar, (2011), “Human Rhinovirus infection in young
African children with acute wheezing”, BMC
Infectious Diseases, 11:65
4 Heikkinen T, Jarvinen A, (2003), “The
common cold” Lancet, 361:51–59
5 Huang T, Wang W, Bessaud M, Ren P, Sheng
J, Yan HJ, Zhang J, Lin X, Wang YJ, Delpeyroux F, and Deubel V, (2009), “Evidence of recombination and genetic diversity in human Rhinoviruses in
children with acute respiratory infection”, PLoS
ONE, 4 (7), E6355
6 Longtin J, Marchand-Austin A, Winter AL, Patel S, Eshaghi A, Jamieson F, Low DE, Gubbay
JB, (2010), “Rhinovirus outbreaks in long-term care facilities, Ontario, Canada”, Emerg Infect Dis,
16(9):1463-5
7 Wisdom A, Leitch EC, Gaunt E, Harvala
H, Simmonds P, (2009), “Screening respiratory samples for detection of human Rhinoviruses (HRVs) and enteroviruses: comprehensive VP4-VP2 typing reveals high incidence and genetic diversity of
HRV species C” J Clin Microbiol., 47(12):3958-67
8 Yoshida LM, Suzuki M, Yamamoto T, Nguyen HA, Nguyen CD, Nguyen AT, Oishi K, Vu
TD, Le TH, Le MQ, Yanai H, Kilgore PE, Dang DA, Ariyoshi K, (2010), “Viral pathogens associated with acute respiratory infections in central Vietnamese children”, Thepediatric Infectious Disease Journal, Vol 29, 75-77
9 Mardis ER, Li H, DeRisi JL, (2007),
“Genome-wide diversity and selective pressure in
the human Rhinovirus” Virol J, 3;4:40
10 Palmenberg AC, Spiro D, Kuzmickas R, Wang
S, Djikeng A, Rathe JA, Fraser- Liggett CM, and Liggett SB, (2009), “Sequencing and analyses of all known human Rhinovirus genomes reveal
structure and evolution”, Science, 324 (5923), 55-59
