Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm

Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - oOo -

Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh, Bộ môn Dược Lực

Trường ĐH Dược Ha Nội Phòng giám định hoá pháp lý Viện Khoa Học Hình Sự

Thời gian thực hiện: Tháng 2 đến 5 năm 2005

HÀ NỘI, THÁNG 5-2005 • ĩn ư Ã - ầ S ) :

h i ũ ì m

M ề l e ă n t tU t

æJiL bàụ tẩ LầỊiẨỊ b iỉí Ổ4^ sâu sẨíi lới:

ÇîS^ QlụuíỊỈMt Qjuốa (Bưih Çîhs QlxỊuụỀn^ ^in lt ^uLOLtt^

Qílhữnụ nẮỊUồl tliầụ đă tận tình kưỔitiỊ dẫn ^ giújfL đẵ ear ihựít hiỀễt ÚỈL hjơăit

ímfL tnồềt^ 'JôéiL n^ưđe, J¿í¿a^ Çît^'èitxj ^ a i kú<i nyưđe, 'Tôi Qlội.

Ốtn æiit ehăễt thủềih eủin ốn eÓM, eáễ^ lứ^ kụ íluíâl aỉỀn tạ i phồng, ^iăiễv đỉnh háiL pháp Líị <UiềM DCÍ^úit kúe, hình ẴẨjt (Bà eồềzạ an đă hxiêitxỊ ílẫết^ hẶ tnỷ kụ Ihuut úỉt t€i(% mại đỉềrt klejt tliuÛJt Iđi eko^ eML lỉun lốt đề tà i itàụ

^ u ế ỉ e ù n g ^ ejit^ æ/#t el^A t^ euMWL Ổ4t^ (B c ư i ^ i c u n líiềxv^ e ă a fth ô ttjg !ư uz^ e ă e

Im Ịtiờĩtí^ồểig ^ ạ i hoe n)ưé<í '7ŨĨL Qlội đũ txm i^nũí ítieju kiej^ thuâiL Lợi ejn trsníj

thồi íjiojiL kạa ÜÁ thu'e hiện kháiL Luận, tại ù^ưằnxẬ

'7ùỉt Qlộiy tkánẨẬ 5/2005.

Sinh aiỀn

^ h ụ i^ QUu¿ Qjuí/jzh

3 Mối quan hệ giữa các thông số Dược động học 9

II Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC - MS) 11

1 Giới thiệu nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 11

2.3 Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký 14

2.5 Quá trình cột và sự mở rộng giải pic

3 Một số trang thiết bị trong kỹ thuật HPLC 16

I Hóa chất, dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 25

4.3 Xây dựng đường cong Dược động học 28

1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện chạy HPLC - MS 321.1 Chọn điều kiện làm việc cho HPLC 331.2 Chọn điều kiện làm việc cho Detector MS 33

2 Khảo sát phương pháp định lượng Glycyl

Puntumin trong huyết tương chó thí nghiệm 35

2.2 Xác định tính chính xác của phương pháp 362.3 Hiệu suất chiết của GF

3 Thiết lập các thông số Dược động học

3.1 Sơ bộ khảo sát sự biến thiên nồng độ GF

3.2 Thiết lập các thông số

Tài liệu tham khảo

Phu luc

Cộng sựlon hóa phun ion (Electrospray Ionization)Sinh khả dụng

Glycyl FuntuminSắc ký lỏng hiệu năng cao(High - Performance Liquid Qiromatography)

Hệ số tốc độ thải trừ Khối phổ

(Mass Spectrum)

Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn Sắc ký đồ toàn ion (Total Ịon Chromatogram)Tương đương sinh học Thời gian bán thảiThời điểm thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương Thể tích phân bố

(Volume of distribution)

ĐẶT VÂN ĐỂ

Dược động học là một phần quan trọng trong hồ sơ về một thuốc dưới cả góc độ khoa học, quản lý và nhất là sử dụng lâm sàng Các thông số Dược động học sẽ phản ánh số phận của thuốc trong cơ thể Thông qua hiểu biết về Dược động học người thầy thuốc sẽ có được sự lựa chọn cách thức đưa thuốc, thời gian đưa thuốc sao cho hợp lý và hiệu quả nhất

Với mục đích nâng cao chất lượng và tính an toàn của thuốc, quá trình cấp phát số đăng ký lưu hành thuốc ở trên thế giới cũng như Việt Nam ngày càng được tiến hành một cách chặt chẽ, kỹ lưỡng Một trong những phần quan trọng trong bộ hồ sơ đăng ký là phải có thông tin về Dược động học của thuốc.Trong các chuyên mục của Dược thư cũng như những tờ rơi hướng dẫn sử dụng thuốc, phần công bố về Dược động học của thuốc luôn nhận được sự quan tâm hàng đầu của cả bác sĩ điều trị, dược sĩ lâm sàng thậm chí cả ngưòi dùng thuốc

Glycyl Puntumin (GF) là một chất điều hoà miễn dịch đã được phát triển

ở Trường Đại Học Dược Hà Nội từ khoảng 30 năm nay Hiện đang được tiến

hành sản xuất thử nghiệm và thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn cuối Song song

với quá trình trên, cơ quan Quản lý Dược đã cấp phép cho Aslem (chế phẩm bào chế từ GF) S Ố đăng ký nghiên cứu Tuy nhiên do hạn chế về phương pháp

và thiết bị nên phần Dược động học của GF chưa từng được khảo sát Để hoàn thiện hồ sơ về Aslem thì những hiểu biết về Dược động học của GF là đòi hỏi thiết thực và cấp thiết

Trong đề tài luận văn này, với mục đích chủ yếu là học tập phương pháp luận nghiên cứu, chúng tôi mạnh dạn đặt vấn đề sử dụng HPLC-MS, một

phương pháp phân tích hiện đại, tin cậy với độ nhạy cao để khảo sát về Dược động học của GF trên động vật thực nghiệm, cụ thể:

1 Khảo sát khả năng sử dụng HPLC-MS để định lượng GF

2 Thiết lập các điều kiện thực nghiệm khi sử dụng HPLC-MS để định lượng GF

3 Thiết lập các thông số Dược động học GF trên động vật thí nghiệm

hệ số thanh thải (Cl) và thời gian bán thải hay nửa đòi sinh học (Ti/2 ) [14, 30].Thông qua các thông số Dược động học người thầy thuốc lâm sàng có thể quyết định liều lượng cần đưa vào cơ thể của mỗi thuốc, khoảng cách giữa các lần đưa thuốc hoặc hiệu chỉnh lại liều lượng trong các trường hợp bệnh nhân

có những bất thường về sinh lý, bệnh lý Đối với ngành dược, các thông số này

là những gợi ý tốt cho việc lựa chọn dạng bào chế và cải tiến dạng bào chế để tạo được những dạng thuốc có các thông số Dược động học mong muốn[14]

2 Các thông số Dược động học cơ bản

2.1 Diện tích dưới đường cong (AUC - Area Under the Curve)

Diện tích dưới đường cong (AUC - của đồ thị biểu diễn sự biến thiên của nồng độ thuốc trong máu theo thời gian) biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc vào được vòng tuần hoàn ở dạng còn hoạt tính sau một thời gian t và được tính

bằng mg.h.l ^ hoặc ịxg.h.mỉ'J [14, 18, 24].

Giả sử toàn bộ lượng thuốc đưa vào cơ thể đều vào được vòng tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính và sẽ phát huy tác dụng dược lý thì trị số AUCỔ cho phép đánh giá được chất lương của dạng bào chế

Hình 1: Diện tích dưới đường cong (AUC)

Có nhiều cách để tính AUC, có thể tính theo phương pháp tích phân trên

máy tích phân (AUC = fc.dt ) hay tính toán đơn giản theo quy tắc hình thang

Công thức ở trên cũng cho thấy mối liên hệ giữa trị số AUC vói sinh khả dụng của thuốc (F), tức là mức độ và tốc độ hấp thu của dược chất từ dạng bào chế vào vòng tuần hoàn chung của cơ thể ở dạng còn hoạt tính Trị số F là đại lượng biểu thị trực tiếp tính hiệu quả của một dạng bào chế

Nếu thuốc được đưa qua đường tĩnh mạch (I.V) thì F = 1 Ngược lại khi thuốc được đưa vào cơ thể bằng các con đường khác thì luôn có một lượng nhất định bị tổn hao khi hấp thu vào máu hoặc bị mất hoạt tính khi qua gan,

do đó F luôn < 1

Đối với sinh khả dụng một thuốc người ta phân chia thành SKD tuyệt đối

và SKD tương đối [14, 18, 24]

• SKD tuyệt đ ố i: được tính bằng tỷ số tổng lượng dược chất được hấp thu vào đại tuần hoàn từ dạng bào chế của nó và từ dạng tiêm động mạch hay tữih mạch

S K D j„yetđô'i = — tuyẹtđOi A ĩ Ị r _ * r ) * 1 0 0 %

^thủNếu liều của 2 chế phẩm như nhau và trọng lượng người thử thuốc bằng nhau th ì:

A T T P

* 100%

• SKD tương đ ố i: Với những thuốc không dùng đường tiêm tĩnh mạch ta dùng khái niệm SKD tương đối SKD tương đối của 1 chế phẩm (thử) so với 1 chế phẩm khác lấy làm chuẩn (dạng bào chế được coi là có khả năng hấp thu tốt hoặc chế phẩm đã được công nhận về hiệu lực tác dụng) là tỷ lệ dạng hoạt tính của chế phẩm thử vào đại tuần hoàn so với chế phẩm chuẩn vào đại tuần hoàn

£ 8 0 120 > > 80

1 2 0 > T-»<y > 8 0

T„„(B)

2.2 T hể tích phân bố(V d - Volume o f distrìbution)

Thể tích phân bố là hệ số tỷ lệ giữa tổng lượng thuốc đưa vào cơ thể và nồng độ thuốc trong huyết tương.[14, 24]

_ Tổng lượng thuốc đưa vào cơ thể (P) |-y , J « 1

Nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp)

Thể tích phân bố biểu thị sự phân bố của thuốc trong cơ thể, nhưng nó không biểu thị một thể tích sinh lý thực, hơn nữa thể tích này không có liên quan gì đến thể tích máu, huyết tương, huyết thanh hoặc phần nước của cơ thể.Thực chất thể tích phân bố là một giá trị tưởng tượng nên còn gọi là thể tích biểu kiến, biểu thị một thể tích cần phải có để toàn bộ lưcmg thuốc được đưa vào cơ thể phân bố ở nồng độ bằng nồng độ trong huyết tương

Thể tích phân bố được sử dụng để tính toán liều lượng thuốc cần đưa vào trong cơ thể để đạt được một nồng độ Cp mong muốn nào đó

p - Vd*Cp

F

Trong đó D: liều thuốc cần đưa (g,mg)

F: là sinh khả dụng của thuốc (%).

Cp: nồng độ thuốc trong huyết tương (g/l, mg/ml).

2.3 Hệ số thanh thải (Clearance = Cl).

Hệ số thanh thải (Cl) hay còn gọi là độ thanh lọc hoặc độ bài xuất, biểu thị khả năng của một cơ quan nào đó của cơ thể (thưcmg là gan và thận) lọc sạch thuốc ra khỏi huyết tương khi máu tuần hoàn qua cơ quan đó ơearance

được tính bằng ml/phút, biểu thị số mililit huyết tương được gan hoặc thận lọc sạch thuốc trong thời gian 1 phút [14, 24].

C1 = - ^ (ml/phút)

Cp

Trong đó: V là tốc độ bài xuất của thuốc qua cơ quan (gan, th ậ n ) (mg/phút)

Cp là nồng độ thuốc trong huyết tương (mg/ỉ)

Cũng có khi Clearance được tính cho 1 kg thể trọng: ml/phút/kg

Trị số C1 thực chất cũng chỉ là một trị số ảo, có tính lý thuyết vì sự tuần hoàn của máu qua các cơ quan là hồi lưu, lặp đi lặp lại liên tục và thực tế thuốc chỉ được lọc sạch hoàn toàn ra khỏi huyết tương sau một khoảng thời gian 7*Tiỵ2 (xem “thời gian bán thải”)

Hệ số thanh thải có mối liên hệ mật thiết với sinh khả dụng, liều dùng và

cả với AUC của thuốc

Trong phạm vi điều trị, khi mức liều chưa đủ gây bão hòa hệ bài xuất thuốc thì C1 là một trị số hằng định, nghĩa là cứ sau một khoảng thời gian nhất định lại có một tỹ lệ hằng định của thuốc được lọc sạch khỏi huyết tương, v ề góc độ toán học, tốc độ bài xuất thay đổi tỷ lệ thuận với sự thay đổi của nồng

độ thuốc trong huyết tương tuân theo quá trình động học bậc 1 Trái lại, nếu liều dùng quá lớn và cơ chế thanh lọc thuốc bị bão hòa thì quá trình bài xuất thuốc sẽ tuân theo quá trình động học bậc 0, nghĩa là sau một khoảng thời gian nhất định có một lượng thuốc cố định bị loại khỏi huyết tưoỉng Trong trường hợp này, C1 không hằng định nữa mà sẽ dao động

Giá trị C1 được công bố với mỗi thuốc thường là Cltoàn bộ’ biểu thị khả năng loại bỏ thuốc ra khỏi huyết thanh, huyết tương của tất cả các cơ quan bài xuất trong cơ thể như gan, thận, phổi, da, nước bọt, các tuyến tiết Tuy nhiên, chỉ có 2 cơ quan gan và thận là có khả năng lọc thuốc mạnh nhất, còn

lượng thuốc được bài xuất qua các cơ quan còn lại rất nhỏ và ít có ý nghĩa Vì thế người ta coi Cltoàn bộ xấp xỉ bằng tổng của Clg^ và Cl,hận.

^^toàn bộ ~ ^^thận ^^gan quan khác

^^toàn bộ ** ^^thận ^^gan

Như vậy ở mức liều điều trị, trị số C1 tỷ lệ nghịch với thời gian bán thải,

có nghĩa là thuốc có C1 lớn là thuốc được thải trừ nhanh ra khỏi Cơ th4(Ti/2 sẽngắn)

- í : —'

Từ trị số C1 và nồng độ thuốc đo được trong huyết tương, ta có thể tính được tốc độ bài xuất thuốc ra khỏi cơ thể (v):

V = C1 * Cp (mg/min)

Cp là nồng độ thuốc trong huyết tương

C1 được xác định theo mức cp ở trạng thái ổn định, nghĩa là khi quá trình hấp thu thuốc đã hoàn thành Lúc này Cp = Qs (Qteady-state)'

Nếu dùng thuốc theo đưòfng truyền tĩnh mạch liên tục thì ta có thể lấy máu ở thời điểm bất kỳ sau khi truyền xong, còn nếu dùng thuốc theo đường uống, tiêm bắp hay truyền gián đoạn thì Qs chỉ có thể đạt được sau k h o ả n ^ s ^

Tv

2-2.4 Thời gian bán thải (T 1 1 2 ) [14, 24].

Tj/2 được biểu thị theo 2 nghĩa:

- Ti/2a hay Ti/2 hấp thu là thời gian cần thiết để một nửa lượng thuốc đã

uống được vào vòng tuần hoàn Nếu thuốc được đưa qua đường tĩnh mạch hoặc đường tiêm bắp thì pha này không có hoặc không đáng kể, như vậy không có Ti/2a-

■ Ti/2 ß hay Ti/2 bài xuất là thời gian cần thiết để một nửa lượng thuốc bài

xuất ra khỏi cơ thể Ty 2 ß còn gọi là thời gian bán thải, trong thực hành điều trị, người ta sử dụng Ti/2 này

Giá trị Tj/2 được tính toán thông qua C1 và Vd theo công thức sau:

rj. _ 0,693 *Vd

C1

ở những đối tượng bất thường về sinh lý và bệnh lý, sự thay đổi C1 là nguyên nhân kéo theo sự thaỵ đổi do đó vấn đề hiệu chỉnh khoảng cách đưa thuốc là bắt buộc

Thời điểm sau (5* Tj/2) thì nồng độ thuốc ở trạng thái cân bằng (Qs), bởi

vì từ giai đoạn này trở đi, quá trình bài xuất cân bằng với quá trình phân bố,

do đó, sự thay đổi nồng độ diễn ra chậm và đạt ở trạng thái cân bằng Thuốc được coi là bài xuất hoàn toàn ra khỏi cơ thể sau (7*Tj/2) Lúc này nồng độ thuốc trong máu chỉ còn chưa đầy 1% so với nồng độ ban đầu

3 Mối quan hệ giữa các thông số Dược động học [14].

C1 và thể tích phân bố (Vd) là những thông số Dược động học độc lập Điều đó có nghĩa là sự thay đổi C1 có thể không ảnh hưởng đến Vd hoặc ngược lại Trong khi đó thời gian bán thải (T1/2) lại phu thuôc C1 và Vd Nếu

Tị/2 thay đổi cổ nghĩa là C1 hoặc Vd hoặc cả C1 và Vd đã có sư biến đổi

C1 cho ta biết tổng các quá trình bài xuất thuốc xảy ra trong cơ thể còn

thể tích phân bố cho biết sự phân bố của thuốc.

Mối quan hệ giữa C1 và Vd được phản ánh trong phương trình

C1 = K*Vd

Trong đó: K là hằng s ố tốc độ thải trừ hay còn gọi là hệ s ố bài xuất.

Tuy nhiên không phải cứ có sự thay đổi về Vd sẽ kéo theo sự thay đổi về C1 bởi vì đây là hai thông số Dược động học độc lập và có quan hệ mật thiết đến một trị số thứ 3 rất quan trọng đó là nồng độ thuốc trong máu.

Trong số ba trị số: Cl, Vd và Qs thì giá trị Q, thực ra chỉ phụ thuộc C1 chứ không phụ thuộc Vd Quan hệ này được biểu thị qua hai phương trình sau đây tùy theo cách dùng thuốc:

- Khi đưa thuốc bằng cách truyền tĩnh mạch liên tục, nồng độ thuốc ởtrạng thái hằng định (Qs) được tính theo phương trình:

ta thường suy luận rằng như vậy thì nồng độ sẽ tăng Thực ra không hẳn như vậy Trường hợp này nếu muốn tăng nồng độ thì C1 phải giảm, còn nếu Vd giảm mà C1 lại tăng thì c sẽ không thay đổi

4 Các mô hình nghiên cứu Dược động học.[20, 30]

Pharmacokinetic là khái niệm để chỉ động học về hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ của một chất Khác với dược lực, Dược động học

nghiên cứu về cách thức mà cơ thể sống sử dụng để điểu khiển các chất ngoại lai (xenobiotic) chứ không phải nghiên cứu tác động của thuốc lên cơ thể sống.

Dược động học dựa trên đường cong nồng độ của thuốc hoặc sản phẩm chuyển hóa của chúng trong cơ thể và những dữ liệu động học có liên quan khác Những thông số về Dược động học và mối tương quan giữa chúng được thể hiện dưới dạng biểu thức toán học Mối liên hệ toán học được thiết lập dựa trên dữ liệu động học liên quan thu được trên mô hình nghiên cứu phù hợp gọi

là mô hình Dược động học (pharmacokinetic model) Hiện có ba mô hình thông dụng được áp dụng phổ biến cho nghiên cứu về Dược động học của một hợp chất trong hệ thống sống [24, 30]

- Mô hình sinh lý Dược động học, sử dụng các cơ quan và các vùng khác nhau trong hệ thống sống

- Mô hình ngăn cổ điển, dựa trẽn sự phân chia cơ thể thành những phần hợp lý mà không cần có ý nghĩa về mặt giải phẫu, bao gồm cả những phần của

cơ thể được tập hợp lại

- Mô hình không vách ngăn dựa trên lý thuyết thống kê thòi điểm của biến ngẫu nhiên (the moment of random variable) trong đó coi sự tồn tại của từng phân tử thuốc trong cơ thể là độc lập với nhau và thời gian tồn tại của một phân tử thuốc trong cơ thể được xem như một biến ngẫu nhiên

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mô hình nghiên cứu không vách ngăn để khảo sát Dược động học của GF.^ ^ -

II SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO GHÉP KHÔI PHỔ (HPLC-MS).

1 Giới thiệu nguyên tác cấu tạo của hệ thống HPLC:

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lỏng hiện đại là phương pháp tách trong đó pha động là 1 chất lỏng;

pha tĩnh chứa trong cột là 1 chất rắn đã phân chia dưới dạng phân tử hay là 1 chất lỏng phủ trên 1 chất mang dạng rắn hay 1 chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hưu cơ [1, 3, 25].

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được đưa ra đầu tiên năm 1969 nhưng mới phát triển khoảng 20 năm trở lại đây Cho đến nay HPLC đã chứng tỏ là một trong những công nghệ phát triển và quan trọng bậc nhất trong các phòng thí nghiệm hiện đại

HPLC có nguyên tắc hoạt động tương tự sắc ký lỏng cột nhồi cổ điển, tuy nhiên ở HPLC quá trình tách chất xảy ra nhanh hơn và tốt hơn [1, 25]

Các bộ phận cơ bản của một thiết bị HPLC được mô tả trong hình 2

Bơm mẫu

Hình 2 : Sơ đồ hệ thống HPLC đơn giản.

Với các thiết bị HPLC hiện đại những bộ phận cơ bản của máy như bơm cao áp, bộ bơm mẫu, bộ trộn dung môi đều được kết nối và xử lý trên máy vi tính [25]

Hợp chất cần phân tích được hoà tan trong dung môi thích hợp bơm vào đầu cột (thủ công hay tự động) và dịch chuyển trong cột nhờ dòng liên tục của

dung môi, lúc này các cấu tử tách ra trên cột Bộ phận đưa mẫu vào cột là bộ bơm mẫu Các hợp phần của mẫu trong cột tương tác thuận nghịch vói pha động theo kiểu liên tục Bằng việc lựa chọn pha động (còn gọi là dung môi rửa giải) và vật liệu nhồi cột thích hợp các hợp phần trong mẫu chuyển động trong cột với tốc độ khác nhau Khi các chất trong mẫu đi ra khỏi cột bộ phận nhận biết (Detector) sẽ tiếp thu và truyền tín hiệu đến thiết bị ghi hay máy tứih sắc

ký đồ là bản ghi phản ứng của Detector theo hàm thời gian và chỉ ra sự xuất hiện các cấu tử dạng pic [25'

2 Một sô đại lượng đặc trưng của HPLC

2.1 Thời gian lưu g iữ : [1,3]

Các chất tan trong hỗn họfp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký, chúng sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Đó là thời gian lưu của mẫu trong hệ cột đã chọn Thòi gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột tách ở điểm có nồng độ cực đại Nếu gọi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i ta luôn có :

Írì "*"^i

Trong đó : tg là thời gian không ỉm giữ

t'/Ịị là thời gian lưu giữ thực của chất i trong cột sắc ký

Với A và B kế tiếp nhau trong sắc ký thì chúng ta có :

2.2 T hể tích lưu: [1,3]

Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột cho đến lúc chất tan

được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại (nghĩa là tương ứng với thời

gian lưu ÍRi)

2.3 S ố đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc k ý : [1,3]

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký người ta dùng khái niệm số đĩa N Đây là một đại lượng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H Bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như :

- Đường kính của hạt pha tũih, hình dạng và kiểu hạt (tròn hay mảnh)

- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất phân tích

- Tốc độ, thành phần pha động trong quá trình sắc ký

- Độ nhớt của pha động

Bề dày (chiều cao) H được xác định bằng công thức :

16Đây chính là chiều cao lý thuyết của 1 đĩa Như vậy với một cột sắc ký chiều dài L thì số đĩa lý thuyết N của cột đó là :

2.4 Khả năng phân giải : [1,3]

Hai đại lượng H và N là những hằng số đặc trưng cho một loại cột tách, nhưng chúng chưa chỉ rõ cho ta biết, hai chất tan A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào, khi nó được rửa giải ra khỏi cột sắc ký Vì thế người ta đưa

ra đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo công thức :

D _ ^*(^RA ~^Rb)

WÂ + W3

Như vậy, để tách hoàn toàn hai cấu tử ra khỏi nhau thì phải đủ lớn Tuy nhiên nếu R^B quá lớn là không cần thiết vì lúc này cần rửa giải mất nhiều pha động cho chất thứ hai

2.5 Quá trình cột và sự mở rộng dải pỉc Phương trình Van - Deemter

Nói chung chiều cao H của một đĩa phụ thuộc rất rõ rệt vào tốc độ của pha động chảy qua cột sắc ký trong quá trình rửa giải các chất tan Quan hệ này trong một mức độ nhất định, nó được mô tả bởi phương trình Van Deemter sau đây:

H'= — - + - + Cphađộng u

^ + Cphadô„g« u

Chiều cao H của đĩa biểu thị cho sự mở rộng dải và các yếu tố ảnh hưởng đến

sự mở Nó là hàm số của các quá trình nhiệt động học và động học ttong cột E)ó là :

- Những tính chất không điều hoà của dòng, dẫn đến xáo trộn đối lưu

- Sự khuếch tán dọc và ngang trong pha động

- Mức độ giới hạn cân bằng của chất tan giữa pha động và pha tĩnh (sự truyền khối),

A, B, c là các hệ số phụ thuộc ba yếu tố trẽn,

u là tốc độ pha động

H (chiều cao

Hình 3 : Sơ đồ H - u đối với cột sắc kí lỏng

Hiệu quả của cột tách tốt khi số đĩa lý thuyết của cột tách lón, chiều cao của đĩa lý thuyết nhỏ sẽ cho số đĩa lý thuyết lớn Một cách lý tưởng ta sử dụng tốc độ dòng ứng yới chiều cao đĩa tối thiểu (tốc độ tối ưu) Trong thực tế người

ta sử dụng tốc độ pha động nằm ở phía phải u tối ưu một chút, tuy hiệu quả cột có giảm đi chút ít nhưng lại rút ngắn được thời gian phân tích [11]

3 Một số trang bị trong kĩ thuật HPLC ;

3.1 Cột tách sắc ký: [1,3]

Cột tách là bộ phận chính của quá trình sắc ký, vì mọi diễn biến sự tách

một hỗn hợp chất mẫu đều xảy ra ở đây và kết quả của sự tách tốt hay không

tốt thì cột tách luôn luôn là một yếu tố quyết định Người ta nói cột tách là trái tim của hệ thống sắc ký cũng là hoàn toàn đúng

Cột tách được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar, có khi đến 1000 bar Thông thường có đường kính trong từ 2- 5mm, chiều dài 15 - 25 cm, tùy mục đích phân tích ta có thể chọn loại cột khác nhau Pha tĩnh (chất nhồi cột) là những chất rắn xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đưcmg kính cỡ hạt từ 3 - lOịLim, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 - 500mVg, chứa trong cột tách, làm nhiệm vụ tách sắc ký hỗn hợp chất phân tích Hiện nay, pha tĩnh thường được sản xuất từ các Silica trung tính, qua việc Ankyl hoá các nhóm -OH trên bề mặt Silica trung tính bằng các nhóm Ankyl của mạch cacbon thẳng ( - C2 , - Cg loại này có

bề mặt không phân cực về chất nhồi c -18 trên nền Silica có Hypersil OD5 - C-18 (hãng Shandow), Lichrosorb RP - 18 (hãng Merck), C-18 Corasil (hãng Whatman), Symmettry C-18 (hãng Waters),

Tùy thuộc vào bản chất của các pha mà ta có những phương pháp sắc ký khác nhau:

- Sắc ký phân bố : Trong loại này có hai hưófng ngược nhau là pha thuận

và pha đảo

- Sắc ký trao đổi ion và cặp ion

- Sắc ký hấp phụ,

- Sắc ký rây phân tử hay sắc ký trên gel [1]

Hiện nay, sắc ký phân bố pha đảo được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích vì nó cho kết quả tách tốt với nhiều đối tượng tách

3.2 Các loại Detector trong HPLC *Detetor khối phổ

Về nguyên tắc thì đây chính là một máy quang phổ khối lượng Việc sử dụng máy MS làm Detector cho HPLC là một thành công trong việc ghép hai

kĩ thuật này MS là một Detector ưu việt bậc nhất trong sắc ký hiện nay, có độ nhạy rất cao và độ chọn lọc cao.[ 21]

Máy khối phổ đầu tiên được chế tạo bởi J.Thompson (Anh) vào năm

1912 và F.W Aston vào năm 1919 nhưng thiết bị hoàn thiện hơn từ năm

1932 Sơ đồ chung của một máy khối phổ được thể hiện ở hình 4:

Hình 4: Sơ đồ chung của máy khối phổ

Mẫu được nạp vào máy có thể ở 3 dạng : khí, lỏng, rắn Khi ghép nối

với HPLC, mẫu lỏng từ cột vào buồng hoá khí mẫu, dưới áp suất thấp (nhờ bơm hút chân không) biến mẫu lỏng thành dạng khí (áp suất lO'"^ - 10’^mm Hg) Mẫu sau khi biến thành dạng khí đựng ở bình chứa đi sang buồng ion hoá qua một lỗ nhỏ có đường kính 0,013 - 0,050 mm Quá trình ion hoá được

thực hiện ở đây Có khá nhiều phương pháp ion hoá như : phương pháp va

chạm Electron, ion hoá phun ion, ion hoá hoá học, ion hoá trường, ion hoá Proton, bắn phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh Hiện nay phương pháp ion hoá phun ion và ion hoá hoá học được sử dụng phổ biến cho Detector khối phổ khi ghép nối HPLC.[21, 22]

Trong phương pháp ion hoá phun ion (EI - Electrospray Ionization) các phân tử hoá chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế (3- 5kV) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra chung quanh ống mao quản Dưới tác dụng của điện thế cao và khí

phun nitơ tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản.

Trong khí nóng các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, sẽ vỡ dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó các ion dưoỉng hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phần tách ion qua một cửa rất nhỏ Dung môi và khí Nitơ bị bơm hút ra ngoài Trong ống mao quản và đầu thoát ống mao quản, quá trình sau đây sẽ xuất hiện :

Trong đố: m là phân tử khối của ion

z là điện tích của ion

M là phân tử lượng

Các ion được hình thành được tách biệt ra khỏi nhau theo số khối nhờ bộ phận thiết bị riêng là một nam châm có từ trường hoặc kèm theo một điện trường nữa [21]

Có 3 loại thiết bị chính :

- Khối phổ kế hội tụ đơn

- Khối phổ kế hội tụ hai lần

- Khối phổ kế tứ cực

Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song với nhau thành một bó Hai đầu được đặt lên 2 giá đỡ Từng cặp đối diện âm hay dương của nguồn điện một chiều Ngoài ra thế tần số vô tuyến đã được sử dụng cho

cả hai cặp Cả hai trường đều không làm tăng tốc phần tử điện tích dưoỉng từ nguồn đi ra Tuy nhiên chúng làm cho các phần tử dao động xung quanh trụctrung tâm khi chuyển động do đó chỉ có các ion có số khối nhất định mói đến

bộ phận thu góp được Do sự thay đổi tần số và thế cung cấp đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượt đến bộ phận thu góp [21] Tại đây ion được nhận diện, đo cường độ và ghi kết quả dưới dạng khối phổ

Khối phổ (Mass spectrum) đó là giản đồ biểu diễn cường độ tưoỉng đối của các ion sinh ra từ phân tử hóa chất theo trị số m/z, trên đó ion có cường độ lófn nhất (ion căn bản 100%), các ion còn lại có cường độ tương đối (< 100%)

so với ion căn bản

Khối phổ kế (Mass spectrometer) ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra

từ phân tử hóa chất ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram)

và khối phổ được lấy theo FULLSCAN MS trong khoảng khối lượng ghi tất

cả các ion sinh ra' từ phân tử hóa chất Trong sắc đồ toàn ion, pic A ứng với thời gian lưu biểu diễn tổng cường độ các ion Aj, A2, A 3 được sinh ra từ chất A

Nếu ngay từ đầu ta chỉ cho khối phổ kế nhận diện ion Aj (z = 1) mà thôi

và ghi sắc đồ theo thời gian, đó là áp dụng kỹ thuật SIM (selected ion monitoring) để phát hiện chất A sắc đồ lúc mấy giờ chỉ ghi pic có chứa ion

Aj, ta nói lấy khối phổ SIM (m/z = Aj) Kỹ thuật SIM có tác dụng giảm hớt

nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N)

* Detector phổ hấp phụ quang phân tử u v - VIS '[1,3]

Detector loại này thực chất là các máy phổ hấp thụ phân tử vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) Loại Detector này được sử dụng tương đối phổ biến hiện nay do giá thành rẻ và có độ nhạy cao với nhiều nhóm chất Việc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó dựa trên cơ sở tính chất hấp

thụ quang phân tử của chất trong dung dịch, ở đây là pha động của quá trình

sắc ký chảy liên tục qua buồng đo, Các chất phân tích tan trong pha động có thể đo phổ hấp thụ trực tiếp của chính nó hay có thể đo qua hợp chất phức của

nó Nguyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định luật hấp thụ quang

A = S.L.C

m TỔNG QUAN VỂ GLYCYL FUNTUMIN

Glycyl Puntumin (GF) là một aminoacyl steroid được bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn phần có thể dưới dạng muối hydrochlorid hoặc hydrobromid

Hình 5 : Cấu trúc của Glycyl Funtumin.HCl

ở dạng muối GF là bột kết tinh màu trắng, vị hơi đắng và chát nhẹ Dễ tan trong methanol và trong nước nóng Tan trong chloroform Khó tan trong

nước nguội Phân huỷ ở nhiệt độ 220°c - 230°c.

Tác dụng kích thích miễn dịch của Glycyl Funtumin đã được chứng minh qua một số thử nghiệm sinh học tiến hành ở trong và ngoài nước [6, 8, 17, 19,

27, 28, 31] Aslem đã được nghiên cứu về tác dụng kích thích miễn dịch trên thử nghiệm Jeme Cunningham [6, 20], đánh giá khả năng kích thích miễn dịch tế bào trên test phục hồi tạo Rosette E bị ức chế bỏi Theophyline [6, 17], tác dụng hoạt hoá đại thực bào và ảnh hưởng lên chức năng thức bào của đại thực bào [9, 19],, tác dụng lên sự chuyển dạng bạch cầu lympho [8], tác dụng lên màng hồng cầu và lyzosome, tác dụng tăng sức đề kháng chống nhiễm khuẩn invitro và tác dụng đối với mẫu viêm phúc mạc thực nghiệm do trực khuẩn mủ xanh kháng kháng sinh [4, 20]

Các nghiên cứu về độc tính cấp, bán cấp và độc tính bán trường diễn của

GF cũng đã được tiến hành trên động vật thực nghiêm và GF có độ an toàn

khá cao, liều độc tính cấp LD50 (72mg/kg) gấp khoảng 12.000 lần so vốíliều

điều trị [15]

GF không gây biến đổi số lượng, cấu trúc nhiễm sắc thể ở tế bào tủy xương cũng như tế bào tinh hoàn của chuột thí nghiệm Những nghiên cứu thử nghiệm lên chức năng hệ tạo máu, gan, thận, huyết áp, lên sự thay đổi thể trạng và chức năng sinh sản đã được tiến hành, cũng cho thấy GF không ảnh hưcmg gì tới những chức phận này [12, 13]

Từ những kết quả nghiên cứu về dược lý và độc tính như vậy một số trung tâm lâm sàng đã tiến hành thử nghiêm GF trong điều trị bổ trợ ung thư

và nhiễm trùng ngoại khoa cũng đã cho kết quả rất khả quan

Trên lâm sàng ung thư, Tôn Thất Tùng và cs (1973) đã sử dụng LHl (GF.Br) điều trị bổ trợ ung thư gan nguyên phát sau phẫu thuật cắt gan hoặc thắt động mạch gan, kết quả cho thấy điều trị bổ trợ LHl đã tăng rõ rệt thời gian sống thêm sau mổ của các bệnh nhân giai đoạn Duke in [32] Hoàng Đình Cầu, Nguyễn Đình Kim, Nguyễn Việt Cồ và cs nghiên cứu sử dụng phác

đồ điều trị miễn dịch LHl phối hợp với Vitamin c liều cao và tam thất sau mổ ung thư phế quản nguyên phát thấy rằng tỷ lệ sống thêm sau mổ 6 tháng, 1 năm, 2 năm ở 31 bệnh nhân được điều trị miễn dịch cao hơn rõ ràng so với nhóm 47 bệnh nhân không được điều trị miễn dịch, chỉ cắt khối u Trong số

10 bệnh nhân được điều trị và 20 bệnh nhân không được điều trị miễn dịch

được theo dõi lâu dài thì tỷ lệ sống thêm sau 3 năm ở nhóm được điều trị là

7/10 (70%) trong khi tỷ lệ này là 6/20 (33%) ở nhóm không được điều trị, p =

0,056 Sau 4 năm, tỷ lệ sống là 6/10 (60%) ở nhóm được điều trị so với 4/20

(20%) ở nhóm không được điều trị, p = 0,045 [5, 16] Phác đồ điều trị miễn dịch bổ trợ sau phẫu thuật (Post operative adjuvant immunotherapy) với

Aslem (GP.HCl) cũng cho kết quả rất khả quan trong ung thư tâm vị: thấy rõ

xu hưófng kéo dài thời gian sống thêm sau mổ của nhóm bệnh nhân được điều trị với Aslem so với nhóm bệnh nhân không được điều trị (tỷ lệ sống sót sau

12 tháng của nhóm điều trị Aslem là 60.61% so với 33.3% của nhóm không

được điều trị Hiện nay Aslem đang tiếp tục được thử nghiệm tại bệnh viện Việt Đức và bệnh viện K [5, 7]

Những nghiên cứu trên lâm sàng như vậy cũng khẳng định GF an toàn khi sử dụng cho người Với những kết quả trên hiện nay không ít các bệnh viện sử dụng Aslem để điều trị bổ trợ ung thư đường tiêu hóa, ung thư phổi và phế quản, ung thư vú và kết hợp kháng sinh điều trị ngoại khoa

Aslem hiện đang được quản lý theo số đăng ký nghiên cứu và đã được Bộ Y

Tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu.Tuy nhiên trong bộ hồ sơ của thuốc Aslem vẫn còn thiếu thông tin về Dược động học Do đó việc bổ xung những

dữ liệu về Dược động học của GF là một đòi hỏi cấp thiết

Khi nghiên cứu về Dược động học đòi hỏi phải có phương pháp đủ nhạy

để định lượng nồng độ thuốc trong máu Trước đây, GF vẫn được định lượng bằng phưoỉng pháp đo quang phổ hấp thụ hoặc cực phổ sóng vuông [10] cả

hai phương pháp này khi định lượng chế phẩm bào chế đều đạt yêu cầu vì nồng độ GF lớn, đủ giới hạn để phát hiện Tuy nhiên khi chuyển sang định lượng hàm lượng trong máu thì không đáp ứng được yêu cầu vì giói hạn của phương pháp không cho phép phát hiện nồng độ thuốc trong máu Chính vì vậy trong một thời gian dài phần Dược động học của GF chưa được khảo sát.Gần đây chúng tôi tham khảo thấy rằng nhiều tác giả sử dụng HPLC-MS

để định lượng các chất có bản chất steroid trong máu [29], đây chính là hướng gợi ý để chúng tôi sử dụng HPLC-MS nhằm khảo sát Dược động học của GF

PHẦN I I : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

I HÓA CHẤT, DỤNG cụ, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

1 Hóa chất

- Methanol (Merck, KGaA, 64271 Darmstadt)

- Acetonitril (Merck, KGaA, 64271 Darmstadt)

- Cloroform (Merck)

- Acid Focmic (Merck)

- Nước cất hái lần đã qua cột khử ion

- Chất chuẩn GF tinh khiết

- Thuốc Aslem: Lot 01072004, sản xuất tháng 07 năm 2004

2 Dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao khép khối phổ (HPLC - MS):

+ Bơm cao áp (Surveyor - Thermo Finnigan)

+ Bơm mẫu tự động - Autosampler (Surveyor - Thermo Finnigan).+ Detector MS (Surveyor MSQ - Thermo Finnigan)

+ Cột sắc ký Hypersil BDS Cyano (5 |j,m, 150*4,6 mm),C8, Cjg

- Máy lọc nước siêu sạch ELGA

- Cân phân tích XB 220 A Precisa (Switzerland)

- Tủ lạnh sâu

- Máy lắc

- Máy ly tâm Rotoíix 32, Hettich, Germany.

- Máy đo pH: pH Meter 3305 Jenway (U K )

- Máy siêu âm Soniclean PTY (Australia)

- Máy cất nước hai lần Aquatron, UK

- Micropipet 100|al - lOOOịal, Iml - 5ml

a/ Độ chính xác của phương pháp (Precision):

• Độ lặp lại (Repeatability): Lấy một mẫu huyết tương tại thời điểm bất kì, đánh giá độ lặp lại bằng cách xác định hàm lượng GF trong

mẫu và tính độ phân tán của số liệu

• Độ tái hiện (Reproducibility): Mẫu phân tích được định lượng ở hai thời điểm khác nhau Đánh giá độ tái hiện thông qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

b/ Tính chọn lọc - đặc hiệu (selectivity - specíicity):

Trong thực nghiệm này tính chọn lọc của phương pháp được xác định bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với mẫu huyết tương trắng.c/ Giới hạn định lượng (Limit of quantification - LOQ).

Hiện nay khái niệm về giới hạn định lượng đã thống nhất rõ ràng Phần lớn tác giả xác định LOQ từ giới hạn phát hiện (Limit of detetion - LOD) Đó

là lượng hoặc nồng độ nhỏ nhất trong mẫu có thể phát hiện được bằng phương pháp đã dùng Biểu thức tổng quát của giới hạn phát hiện được biểu thị bằng tín hiệu đo nhỏ nhất của mẫu phân tích có thể phân biệt được với mẫu trắng đo trong cùng điều kiện với độ tin cậy 99,8%

X = X t b + 3iơ

Trong đó:

X là trị s ố tín hiệu đo nhỏ nhất được xác định bằng phương pháp đ ã dùng

ơ là sai lệch chuẩn có trị sốXỵg.

Thông thường giói hạn định lượng được chấp nhận là 3x Một số tác giả chắc chắn hơn đã chọn trị số 5x thậm chí đến lOx Ngoài ra còn có phương pháp xác định trực tiếp giới hạn định lượng bằng cách giảm nồng độ hoạt chất định lượng trong mẫu cho đến khi sai số tương đối không vượt quá 15% Có

X = f (C)

Trong trường hợp của chúng tôi, tín hiệu mẫu trắng (diện tích AUC) bằng không, vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp ngoại suy xác định tín hiệu XxB thông qua các dung dịch GF có nồng độ xác định

I

d/ Hàm đáp ứng:

Sự phụ thuộc giữa diện tích pic - nồng độ là một phương trình bậc nhất

có hệ số tương quan » 1 Phương trình đường hồi quy tuyến tính được xây dựng trong ngày phân tích

e/ Độ ổn định của GF trong mẫu thử

Mẫu huyết tương tại thời điểm bất kỳ được bảo quản ở t° = - 40° Sau những khoảng thời gian khác nhau tiến hành chạy sắc ký và tính nồng độ GF

để đánh giá độ ổn định của mẫu trong thời gian bảo quản

4.2 B ố trí thí nghiêm và lấy mẫu

Tiếm bắp cho chó với liều 0,6mg

Lấy mẫu điểm 0 (trắng) trước khi tiêm thuốc để so sánh, kiểm tra tính

chọn lọc và kiểm định phương pháp

Vì GF chưa có tài liệu nào nghiên cứu và công bố về Dược động học nên chúng tôi phải tiến hành bước đầu khảo sát sự biến thiên nồng độ GF trong huyết tương bằng cách lấy mẫu máu tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18, 20, 24 giờ

Sau khi đã sơ bộ đánh giá được khoảng thời gian thuốc đạt nồng độ tối đa trong máu chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu từ tĩnh mạch đùi chó bằng phương pháp bộc lộ tĩnh mạch trực tiếp tại các thời điểm 0 giờ, ít nhất 4 điểm ở pha

hấp thu, 3 điểm xung quanh thời điểm 4 đến 6 điểm ở pha thải trừ.Mẫu máu được xử lý

Định lưọíng nồng độ GF trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC-

MS với điều kiện phù hợp mà chúng tôi đã khảo sát

4.3 Xây dựng đường cong Dược động học.

di! Phương pháp chiết GF trong huyết tương chó:

Hình 6 : Sơ đồ quy trình chiết GF trong huyết tương chó