Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor

Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên kí sinh trùng sốt rét thực nghiệm của dẫn xuất artemisinin gắn fluor

BỘ Y TÊ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRÊN KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT THựC NGHIỆM CỦA

DẪN XUẤT ARTEMISININ GẮN FLUOR

( KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 2000- 2005 )

Người hướng dẫn : TS NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG

TS TRƯƠNG VĂN NHƯ Nơi thực hiện ; VIỆN SỐT RÉT KST - CT TW

Thời gian thực hiện : 10/2004 - 4/2005

HÀ NỘI 5- 2005

í è s € ẩ m (0 M

Siết ơn sâu sắc, tôi jận chân tíiành cầm ơn:

Ts 9i£uyen Xuân Thtdnß

‘25’ Trươtĩ£ Văn íNíiư

Là nẫững người trực t ữ ị hưóng cCẩn tôi trong quá trình tdực íiiện ^ o ấ íuận này.

‘Toi jận cíiân tíiành cảm ơn các tdầy cô, anh cfd nßimn cứu, ^ tíiuật

[ý, các Sộ môn và cácpãòng San trường đại học (Dược !Hâ !Nọi đã tận tìníi

tốt ngßiäp nảy.

Xin cầm ơn cíia mẹ, người tẫân và Sạn Sè ấãgiúp đd, ấộng viên tồi trong suốt quá trìníi tíiực hiện đề tài này.

Hà Nội ngày 27 tháng 5 năm 2005

SinH vữn: (Đô ĩCữu ‘Tài

Tổ chức y tế thế giới Artemisinin

Dihydroartemisinin Plasmodium

Liều chết 50% động vật thí nghiệm

Nồng độ ức chế 50% ký sinhtrùng phát triển

MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Nồng độ tối thiểu ức chế ký

triíluormethyl-MỤC LỤC

Đặt vấn đ ề 1

Phần l.Tổng quan 2

1.1 Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt N am 2

1.2 Tmh hình nghiên cứu artemisinin và các dẫn x u ất 4

1.2.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tích chất của artemisinin 4

1.2.2 Một số dẫn xuất của artemisinin 4

1.2.3 Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin và dẫn xuất 5

1.2.4 Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất 5

1.2.5 Nhược điểm của artemisinin và các dẫn x u ấ t 6

1.3 Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor 7

1.3.1 Sơ lược qui trình tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn fluor 7

1.3.2 Đặc điểm và quá trình nghiên cứu các dẫn xuất artemisinin gắn flu o r 8

1.4 Các kỹ thuật liên quan đến nghiên cứu 12

1.4.1 Kỹ thuật nghiên cứu in vitro 12

1.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu in vivo 13

Phần 2.Thực nghiệm và kết q u ả 14

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14

2.1.1 Nguyên vật liệu 14

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 18

2.2.1 Xác định độc tính cấp LD50 của BB 134 18

2.2.2 Thử nghiệm in vitro trên Plasmodium falciparum nuôi cấy 21

2.2.3 Thử nghiệm in vivo trên mô hình chuột nhắt nhiễm Plasmodium berghei 23

2.3 Bàn luận 27

Phần 3 Kết luận và đề x u ấ t 31

Tài liệu tham khảo

ĐẬT VẤN ĐỂ

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm khá phổ biến trên thế giới Trong thời gian gần đây sốt rét có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đói

Khó khăn nhất trong công tác phòng chống sốt rét là do ký sinh trùng sốt

rét (KSTSR) Plasmodium falciparum ị p falciparum) đã kháng lại chloroquin

và hầu hết các thuốc sốt rét khác Sự kháng thuốc sốt rét của p falciparum đã

làm tăng số người mắc sốt rét, tăng các vụ dịch và tăng tỷ lệ tử vong

Artemisinin được các nhà khoa học Trung Quốc chiết xuất lần đầu tiên vào năm 1972 từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L), sau đó nhanh chóng trở thành một thuốc điều trị sốt rét hàng đầu, đặc biệt là sốt rét ác tính Sau đó nhiều dẫn xuất mới của artemisinin đã được bán tổng hợp như: dihydroartemisinin, artesunat, tuy nhiên cũng giống như artemisinin tất cả các thuốc này đều có nhược điểm là tỷ lệ tái phát vẫn còn rất cao Do đó, mục tiêu hiện nay của các nhà khoa học là tìm ra một thuốc điều trị sốt rét mới vừa

có khả năng cắt sốt nhanh lại vừa giảm thiểu tỷ lệ tái phát

Một trong các dẫn xuất được quan tâm nhiều nhất là các dẫn xuất của artemisinin gắn flúor Các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu và tổng hợp thành công dẫn xuất của artemisinin gắn flúor ký hiệu là BB 134 Những thử nghiệm ban đầu tại Pháp cho thấy thuốc có nhiều triển vọng trong điều trị sốt rét Trong khuôn khổ công trình nghiên cứu hcfp tác giữa Viện SR KST- CT

TW và nhóm nghiến cứu CNRS- BIOCIS, Khoa dược, Đại học Paris XI, Chatenay- Malabry 92296, France về đề tài “ Tổng hợp và phát triển tiền lâm sàng các dẫn xuất gắn flúor”, chúng tôi thực hiện một phần nhánh đề tài:

''Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên ký sình trùng sốt rét của dẫn xuất artemisinin gắn flú o r BB 134” với mục tiêu:

1 Xác định độc tính cấp (LD50) của BB 134

2 Đánh giá tác dụng trên KSTSR p falciparum nuôi cấy và trên chuột nhắt trắng nhiễm KSTSR p bergei của chất BB 134.

xã hội của các nước trên thế giói Bệnh SR phân bố rộng khắp tất cả các vùng

trên thế giới nhưng chủ yếu tập trung ở vùng khí hậu nhiệt đói và cận nhiệt đới

như: các nước phía nam sa mạc Sahara, Đông Nam Á, Ấn Độ, Châu Đại

Dương, Trung và Nam Mỹ [24] Hiện nay SR lưu hành ở hơn 100 quốc gia và

vùng lãnh thổ, mỗi năm có từ 300 - 500 triệu ngưctì mắc SR và khoảng 1 -1 ,5 triệu người tử vong vì SR [29, 30]

WHO đã đề ra chiến lược thanh toán SR toàn cầu vào năm 1955 với việc kết hợp sử dụng DDT diệt muỗi, sử dụng thuốc chống SR và giám sát chặt chẽ dịch bệnh Tuy nhiên chỉ sau đó vài năm dịch bệnh lại bùng phát trở lại [23].Nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát trở lại của dịch SR trên thế giới là

do sự gia tăng kháng thuốc của KSTSR, đặc biệt là KST p falciparum Chủng KST p falciparum không chỉ kháng chloroquin mà còn kháng nhiều loại

thuốc khác như hỗn hợp pyrimethamin- sulfadoxin, giảm nhạy với quinin, mefloquin Những vùng có tỷ lệ kháng cao là Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, vùng Amazon của Nam Mỹ và đang gia tăng ở Đông Phi [21] Chính sự kháng thuốc hiện nay đang là một trở ngại lớn cho công tác phòng chống SR trên thế giới và tại mỗi quốc gia Chính vì vậy, nhu cầu về thuốc SR mới đang là vấn đề cấp thiết hơn bao giờ hết để thực hiện mục tiêu này

1.1.2 Tình hình ở Việt Nam:

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ và độ ẩm rất thích hợp cho bệnh SR lưu hành và phát triển Hiện tại Việt Nam có hơn 3/4 diện tích và trên 1/3 dân số sống trong vùng có SR lưu hành [9]

Trước năm 1980, tuy có nhiều biện pháp phòng chống SR nhưng SR chỉ giảm một thời gian và lại bùng phát trở lại với đỉnh cao là năm 1991 với số người mắc trên 1 triệu người và 4.646 người tử vong [2] Những năm sau đó tỷ

lệ mắc và tử vong có giảm nhưng diễn biến còn rất phức tạp

Bảng 1.1 Diễn biến sốt rét năm 1991- 2003 [ 2 ,18]

p falciparum kháng chloroquin tại Nha Trang , cho đến năm 1995 đã xác

định p falciparum kháng chloroquin tại 100% vùng SR ở các tỉnh miền Nam

và lan rộng ra nhiều tỉnh miền Bắc [16] KST p falciparum đã kháng

chloroquin và hầu hết các thuốc điều trị sốt rét khác như: hỗn hcfp sulfadoxin- pyrimethamin, primaquin, quinin Đối với artemisinin và các dãn xuất như artesunat, dihydroaitemisinin, chưa thấy hiện tượng kháng thuốc nhưng trong điều trị thường xảy ra tái phát với tỷ lệ khá cao như artemisinin; tái phát 36,9% [11], artesunat liệu trình 5 ngày: tái phát sớm khoảng 30% [13] Tình hình KSTSR kháng thuốc ở Việt Nam ngày càng phức tạp và lan rộng Chính

vì vậy việc nghiên cứu và tổng hợp ra những thuốc diệt KSTSR kháng thuốc trong thời điểm hiện nay là rất cần thiết

1.2 Tình hình nghiên cứu artemisinin và các dẫn xuất

1.2.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tích chất của artemisinin

Artemisinin là một hoạt chất chống SR được chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng tên khoa học là Artemisia annua L., họ cúc Arteraceae

Artemisinin có công thức phân tử là CjsHjiOj, với công thức cấu tạo đươc xác đinh như sau:

15 C H3

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của artemisinin

Artemisinin là 1 sesquiterpen lacton có cầu peroxid nội phân tử, trong đó hoạt tính chống SR chủ yếu dựa vào cầu peroxid này Trong công thức trên vòng A là dạng cycloxan, vòng D là vòng lacton, còn vòng B và c đều là dị vòng bão hoà trong đó vòng c là một trioxan, dạng có liên quan đến hoạt tính chống SR của artemisinin [12]

Artemisinin ít tan trong cả dung môi phân cực và không phân cực, rất dễ thủy phân vòng lacton trong dung môi phân cực Do vậy sinh khả dụng (SKD)

và độ bền vững của artemisinin không cao Đây cũng chính là những hạn chếcủa artemisinin khi sử dụng làm thuốc điều trị [14]

1.2.2 Một số dẫn xuất của artemisinin

Nhằm tăng cường hiệu lực chống SR và khả năng hoà tan của artemisinin, năm 1976 các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành thay đổi cấu trúc hoá học của artemisinin bằng cách khử hoá artemisinin bằng natri borohydric tạo ra dihydroaitemisinin (DHA) Từ DHA các nhà khoa học tiếp tục tổng hợp các dẫn xuất acetal bằng các phản ứng ether hoá và este hoá [12]

15 QH3

R= -H : dihydroartemisinin (DHA) R= - CH3: artemether

R= -C2H5: arteether R=-CO-CH2-CH2-COONa: artesunat R= -0 -CH2-C6ỈỈ4-C0 0 N a ; aitelinat

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các dẫn xuất của artemisinin

1.2.3 Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin và dẫn xuất

Artemisinin và các dẫn xuất có nhiều ưu điểm mà các thuốc chống SR trước không có như: chúng diệt nhanh các thể phân liệt trong máu và không có

sự đề kháng chéo với các thuốc SR khác Các nghiên cứu cho thấy với nồng độ

10'^ mol/1 KST p falciparum hoàn toàn bị ức chế không phát triển in vitro

được và thuốc có tác dụng trên cả KSTSR nhạy và kháng thuốc [5] Nhóm thuốc này nhanh chóng làm sạch KSTSR trong máu bệnh nhân kể cả KSTSR

đa kháng với thòi gian làm sạch trung bình là 2 ngày, thời gian cắt sốt cũng

tương tự [1] Các thử nghiệm trên các chủng p bergei, p.cylnomolgy và

p.knowlesi đều cho thấy các dẫn xuất khác đều có tác dụng tốt hofn

artemisinin, trong đó DHA là có tác dụng tốt nhất trong nhóm [25] Cũng theo các nghiên cứu này cho thấy, nhóm thuốc này có tác dụng không đáng kể tới

giao bào p falciparum khi non (ở nồng độ gấp 1 00- 1000 nồng độ diệt thể vô tính) và không có tác dụng với thể tiền hồng cầu cũng như với thoa trùng Do

đó trong điều trị artemisinin và các dẫn xuất thường được kết hợp vói các loại thuốc khác như: primaquin nhằm diệt hết các thể của KSTSR

1.2.4 Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất

Theo Meshnick, artemisinin và các dẫn xuất đều có một cơ chế tác dụng chung, đó là thông qua cầu peroxit nội phân tử (hình 1.3) Khi vào máu thuốc

gắn với hemozoin- dạng polymer của hem được tích luỹ trong các không bào tiêu hoá sau khi KST sốt rét tiêu hoá hemoglobin, hemozoin (có chứa Fe^"^) khử nhóm peroxit tạo ra các gốc tự do Chính các gốc tự do này gây ra các tổn hại tế bào KST sốt rét như: peroxy hoá lipid, oxy hoá protein, alkyl hoá protein, và tiêu diệt chúng [28] Do hemozoin là sản phẩm của KSTSR sau khi tiêu hoá Hb nên thuốc chủ yếu tập trung trong các hồng cầu nhiễm Điều này giải thích tại sao nhóm thuốc này lại diệt KST sốt rét nhanh hơn hẳn các nhóm thuốc trước đó Cơ chế tác dụng này được củng cố thêm nhờ rất nhiều thí nghiệm như sự ức chế tác dụng của thuốc bằng các chất khử (phá huỷ cầu

peroxit) như: a - tocoferol, vitamin c, trái lại các chất ức chế tổng hợp

glutathion lại tăng cường tác dụng của thuốc Ngoài ra, nghiên cứu cấu trúc p

falciparum còn cho thấy các tổn thương của KST ở không bào tiêu hoá, ti lạp

thể và màng tế bào [28]

Fe

(fre® or h#rri©-boynci) (fr®# radical m

@iectrophiỉỉc intermediate)

A lk v tn tto n

lyialaria target proteins

Hình 1.3 C ơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất [28].

1.2.5 Nhược điểm của artemisinin và các dẫn xuất

Khi sử dụng đưcmg uống artemisinin và các dẫn xuất này đều bị thuỷ phân mạnh bởi acid dịch vị; artemisinin bị thuỷ phân vòng lacton, trong khi đó các dẫn xuất acetal bị thuỷ phân nhóm acetal tại Cio (tạo ra DHA) Do đó, SKD của thuốc giảm và thuốc hấp thu chậm hơn Các nghiên cứu về SKD của arteether cho thấy ở điều kiện dịch axit pH = 2,0; nhiệt độ 37°c, arteete không

bền, rất dễ bị thuỷ phân và một lượng arteete khá lớn bị thuỷ phân mất đi trong dạ dày trước khi thuốc đến được ruột non để được hấp thụ Nếu pH ở dạ dầy bằng 2, thời gian bán phân huỷ của arteete khoảng 50 phút và như vậy chúng ta có thể chờ đợi từ 25 - 75% arteete bị phân huỷ suốt trong thời gian

đó, trước khi có thể đến các bộ phận khác [19]

Do kém bền với chuyển hoá (thuỷ phân và oxy hoá bed enzym cytocrom P450 trong gan) nên artemisinin, DHA và các dẫn xuất acetal đều có thời gian bán thải (ti/2) ngắn Thử nghiệm trên người tình nguyện cho thấy: tj/2 đường uống của artemisinin và aitemether là từ 1- 3h, của artesunat theo đường tiêm tĩnh mạch chỉ là 45 phút [28] Do đó khi sử dụng artemisinin và dẫn xuất trong điều trị thường xảy ra tái phát với tỷ lệ cao Điều này càng rõ khi tăng thời gian điều trị (từ 5- 7 ngày) thì tỷ lệ tái phát giảm [1] Ngoài ra, theo các nghiên cứu tại Pháp cho thấy các sản phẩm thuỷ phân và oxy hoá của các dẫn chất acetal còn gây độc đối với thần kinh trên chuột thí nghiệm [24]

1.3 Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor

1.3.1 Sơ lược qui trình tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn fluor

Các nhà khoa học Pháp đã nghiên cứu và tổng hợp ra các hợp chất artemisinin gắn fluor trong đó có BB 134 Công thức được xác định như sau:

Để tổng hợp ra các dẫn xuất artemisinin gắn fluor, từ BB 101 người ta loại nước tạo ra 10-trifluoromethyl anhydrodihydroartemisinin, từ đó tổng hợp

ra các dẫn xuất khác theo sơ đồ sau:

lÒỊ 16 CF,

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn Flour [24]

1.3.2 Đặc điểm và quá trình nghiên cứu các dẫn xuất artemisinin gắn flúor

Để khắc phục nhược điểm kém bền tại vị trí Cjo của artemisinin và các dẫn xuất trước các nhà khoa học đã tìm cách thay thế nhóm -C=0, nhóm acetal và hemiacetal ở Cio bẵng các nhóm chức bền vững hơn nhằm tăng độ bền với các enzm oxy hoá và ngăn cản sự thuỷ phân của acid dạ dày đối với thuốc

Trong các nghiên cứu ban đầu, các nhà khoa học tiến hành thay thế các liên kết kém bền với chuyển hoá là c=0 (artemisinin), C-O (acetal và bán acetal) tại Cio bằng liên kết C-C bền vững hcfn Kết quả cho thấy rằng một loạt các dẫn xuất của artemisinin chứa liên kết C-C ở vị trí c 10 (dẫn xuất không acetal) có độ bền gấp 15 đến 20 lần so với những dẫn xuất cùng loại có chứa nhóm acetal -C-O ở vị trí Cio trong điều kiện thí nghiệm axit gần giống trong dạ dày Dưới đây là kết quả cho thấy điều đó [20].

Bảng 1.2 Độ ổn định của các dẫn xuất artemisinin dạng acetal C-O và không acetal C-C trong dung dịch acid lmg/ml(HCl 0,01N; pH=2,0;37‘*C)

Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chông sôt rét ỉn

Dựa vào các nghiên cứu này, các nhà khoa học Pháp chủ tnicfng gắn một nhóm chức bền vững với chuyển hoá là -CF3 Việc gắn nhóm -CF3 có hai ưu điểm: một mặt thay thế liên kết kém bền C-O (acetal) bằng liên kết bền hơn là C-CF3, mặt khác liên kết C-F do đặc điểm bền vững của nó với các phản ứng oxy hoá và thuỷ phân nên tính bền vững các dẫn xuất có gắn nhóm -CF3 càng được tăng cường Tính bền vững đối với acid dịch vị do nhóm -CF3 đã được chứng minh bằng các thí nghiệm tiến hành tại Pháp, có thể minh hoạ theo sơ

Theo sơ đồ trên, do nhóm -CF3 là nhóm hút điện tử nên nó ngăn cản quá trình proton hoá của acid dịch vị tại vị trí Cjo, do đó tăng cường độ bền vững của nhóm dẫn xuất này trước tác động của acid dịch v ị

Như vậy với việc gắn nhóm -CF3 bền vững vói chuyển hoá sẽ làm tăng độ bền của thuốc trước các tác nhân thuỷ phân và oxy hóa góp phần làm tăng SKD, giảm thời gian hấp thu thuốc và giảm các tác dụng gây độc đối với thần kinh [24] Nhiều thử nghiệm ban đầu trên BB 101 đã được tiến hành tại Pháp cũng như Việt Nam cho thấy những ưu điểm đặc biệt của chất này trên

KSTSR cả in vitro và in vivo.

Thử nghiệm tại Pháp cho thấy BB 101 không có dấu hiệu độc thần kinh

đối với chuột thí nghiệm Còn thử tác dụng in vivo và in vitro BB 101 cho tác

dụng hơn hẳn DHA và các dẫn xuất của chúng trên cả đường uống và đường phúc mạc [24]

Tại Việt Nam, BB 101 đã được thử nghiệm tại Viện sốt rét - KST- CT

T ư năm 1999 Kết quả nghiên cứu cho thấy BB 101 có tác dụng diệt KST mạnh và nhanh hơn artemisinin (ART) Nồng độ ức chế 50% KST phát triển (IC50) là 4,4 nmol/1 với chủng nhạy chloroquin và 4,6 nmol/1 với chủng kháng chloroquin, nồng độ này thấp hơn ART 3 lần Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của BB 101 là 10 nmol/1, thấp hơn MIC của ART 3 lần Trên chuột nhắt trắng

nhiễm p berghei BB 101 có tác dụng với liều 50 mg/kg, 100% chuột sạch

KST sau 24 giờ điều trị và tỷ lệ khỏi bệnh 100%, chưa thấy KST tái phát trong vòng 60 ngày đối với cả chủng nhạy và kháng chloroquin [2 0]

Tuy nhiên điểm hạn chế của BB 101 là vẫn còn nhóm methyl tại Cj6, do

đó độ tan của BB 101 kém, điều này sẽ ảnh hưởng tới SKD của thuốc, đặc biệt khi dùng đưòỉng uống Để khắc phục nhược điểm này các nhà khoa học Pháp

đã tiến hành gắn các nhóm thế khác nhau vào vị trí Cj6 nhằm cải thiện độ tan của các dẫn chất gắn fluor trước đó Trong các dẫn chất chứa nhóm thế tại C16 được tổng hợp, hợp chất BB 134 ngoài các ưu điểm về độ bền vững như các

dẫn xuất artemisinin gắn flúor cùng loại, nó còn có nhóm chức

dụng của chúng trên in vivo Theo những nghiên cứu ban đầu tại Pháp, BB 134

là một trong những hợp chất artemisinin gắn flour chứa nhóm thế tại Ci6 có

hiệu lực mạnh nhất đối với KSTSR cả in vitro và in vivo Dưói đây là một số

kết quả nghiên cứu ban đầu được tiến hành tại Pháp [24]

Bảng 1.3 Thử in vitro trên chủng kháng chloroquin p falciparum

FcBl(a) và W2(b)

Bảng 1.4 Thử in vivo đối vói chủng kháng chỉoroquin p bergei NK173

trên chuột nhắt trắng vói liều 35,5 p,mol.kg'^ X 5 ngày đưòtig phúc mạc

ngày thứ 4

Mật Độ KST ngày thứ 1 1

Tỷ lệ chuột sống sau 2 0 ngày

Bảng 1.5 Thử in vivo đối với chủng kháng chỉoroquỉn p bergei N trên

chuột nhắt trắng theo đường uống

Bảng 1.6 Các thông số dược động học thử nghiệm trên chuột cống với

liều tiêm tĩnh mạch 1 0 mg/kg hoặc đường uống 50 mg/kg

Các thông số dược động học Artemether BB 134

(1): Artemether: hoà tan trong Captisol/nước nồng độ 0,1M

BB 134: hoà tan trong dung dịch Captisol/ethanol nồng độ 0,1 M, pH= 3.(2): artemether và BB 134 được hoà tan vói cùng một loại dung môi gồm: carboxymethyl cellulose 0,5% (g/ml), benzyl alcohol 0,5% (g/ml), Tween 800,4% (ml/ml) trong N ad 0,9% (g/ml)

1.4 Các kỹ thuật liên quan đến nghiên cứu

1.4.1 Kỹ thuật nghiên cứu in vitro

Kỹ thuật nuôi cấy p falciparum dài ngày: kỹ thuật được sử dụng đầu tiên

là kỹ thuật nuôi cấy KST p falciparum 24 giờ do Rieckemann cải tiến từ kĩ

thuật cổ điển của Bass- còn gọi là kỹ thuật macrotest [19] Tuy nhiên kỹ thuật này có điểm hạn chế là lưọng máu chứa KSTSR dùng cho mỗi lần thử khá lớn (10-15ml), điều này rất bất lợi cho quá trình nghiên cứu trên lâm sàng cũng như trong các nghiên cứu đánh giá [26] Đến năm 1976, phương pháp bình nến của Träger và Jensen mới được sử dụng rộng rãi như là phương pháp

thường qui trong quá trình nghiên cứu in vitro Phưofng pháp này dựa trên việc nuôi cấy p falciparum dài ngày trong môi trường giàu acid amin( môi trường RPMI) Nhờ phương pháp này mà nhiều chủng p falciparum nhạy và kháng

trên thí nghiệm được duy trì liên tục nhằm phục vụ nhu cầu nghiên cứu in

vitro [27].

Kỹ thuật đánh giá hoạt tính của thuốc in vitro, hai kỹ thuật hay được

dùng phổ biến hiện nay là kỹ thuật microtest của WHO do Rieckemann cải tiến từ kỹ thuật macrotest và kỹ thuật thử đáp ứng của Thaithong- Beale ư u điểm của kỹ thuật microtest là lượng máu thử ít và rất tiện lợi khi lấy máu để

nuôi cấy( mỗi thử nghiệm chỉ cần khoảng 50ụ 1 máu chứa p falciparum) [26]

Kỹ thuật nghiên cứu của Thaithong- Beale (ra đời năm 1981, hoàn thiện vào năm 1983) cũng được sử dụng khá phổ biến trong việc thử đáp ứng của thuốc

trên KSTSR, Các chỉ số đánh giá trong thử nghiệm in vitro là IC50 (Inhibitory Concentration 50%- nồng độ ức chế 50% KST phát triển) và MIC (Minimum Inhibitory Concentration- nồng độ tối thiểu ức chế KST phát triển)

1.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu ỉn vivo

Đây là phương pháp thử tác dụng của thuốc đối vói KSTSR trên động vật

gây SR thực nghiệm Trong lịch sử nghiên cứu in vivo có rất nhiều chủng

KSTSR gây bệnh trên động vật đã được ứng dụng để nghiên cứu về thuốc SR

Phổ biến nhất là KSTSR gây bệnh ở loài lông vũ (do Danilevski tìm ra năm

1890), KSTSR gây bệnh trên chuột (do Vinke và Lips tìm ra năm 1948) và trên khỉ (Maier phát hiện ra năm 1907) Mở đầu cho nghiên cứu trên mô hình

SR thực nghiêm là thử thuốc trên p.relictum à ngan do Poehl đề xuất năm

1926 [19] Cho đến nay chủ yếu chỉ có 3 loại vật chủ trên (lông vũ, chuột, khỉ) được sử dụng trong nghiên cứu Tuy nhiên mô hình nghiên cứu trên

Plasmodium bergei ờ chuột vẫn được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu

hiện nay do sự đơn giản, thuận tiện và kinh tế của nó Mô hình này còn tỏ ra

hiệu quả hơn khi các nhà khoa học đã phân lập thành công các chủng p

bergei kháng chloroquin trong phòng thí nghiệm Điều này góp phần rất quan

trọng trong quá trình nghiên cứu các thuốc SR mới khi mà hiện nay ngày càng

xuất hiện nhiều chủng p falciparum kháng chloroquin trong quá trình điều trị

SR

- Bột artesunat chuẩn do viện kiểm nghiệm cung cấp.

- Bột gôm Arabic 1% làm dung môi hoà tan artesunat và BB 134

- Hoá chất, môi trường đầy đủ RPHS, hồng cầu, huyết thanh cho nuôi cấy, đánh giá tác dụng của thuốc là những chất đạt tiêu chuẩn đang được sử dụng tại Khoa nghiên cứu điều trị sốt rét Viện SR KST- CT TW

* Chủng ký sinh trùng sốt rét

- Chủng KSTSR p bergei của Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét Viện SR

KST- CT gồm có:

+ Chủng p bergei nhạy với chloroquin - kí hiệu (T)

+ Chủng p bergei kháng chloroquin - kí hiệu (K70)

- Các phân lập p falciparum thử nghiệm (được lưu giữ tại băng của Viện

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

* Xác định độc tính cấp LD50 của BB 134

Xác định liều chết 50% động vật thực nghiệm LD50 (Lethal dose 50%) theo phương pháp Behrens- Karber: tiến hành thử trên 90 chuột chia thành 9

lô, mỗi lô 10 chuột

BB 134 được hoà tan trong dung dịch gôm arabic 1% Mỗi lô chuột được uống BB 134 với liều từ 100 mg/kg đến 500 mg/kg cân nặng Khoảng cách giữa các liều là 50 mg/kg

Theo dõi các triệu chứng và dấu hiệu của chuột, tính số chuột chết trong thời gian 72 giờ

Từ số liệu tính số chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp, tỷ lệ % chết Từ đó

tính LD50 và sai số chuẩn theo công thức;

E a-dLD.n = LD,

ntb

Jk sd

nrijj,: Số chuột thử trung bình mỗi nhóm

a: số chuột chết trung bình của 2 nhóm liên tiếp,

d: khoảng cách giữa các liều

k: hằng số Behrens- Karber bằng 0,564

s: phân phối chuẩn, s =

Trong đó LDg4 và LDịộ được xác định thông qua đồ thị tỷ lệ chết- liều

+ Chuẩn bị môi trường đầy đủ: cho thêm vào môi trưòrng nuôi cấy (RPMI + glucose + nước cất) dung dịch natri bicarbonat 5% (40|al/ml môi trường), gentamycin (40|al/ml môi trường) và huyết thanh với nồng độ 10- 15% tuỳ theo nhu cầu.

+ Chuẩn bị HC: HC được rửa 2 lần bằng môi trường không có huyết thanh và lần thứ 3 bằng môi trường đầy đủ Tiếp đó pha thành dịch treo 50%, bảo quản ở 4°c.

+ Chuẩn bị HC nhiễm: Máu nhiễm KST p falciparum được rửa như

trên (mật độ KST nhiễm < 3%) Chia máu nhiễm vào các đĩa nuôi theo thể tích tương ứng, cho thêm 1-2 giọt HC nuôi

+ Cho đĩa nuôi vào bình hút ẩm, đốt nến và khi nến sắp tắt thì đóng bình để tạo khoảng 5% CO2 + 95% không khí, để bình vào tủ ấm 37°c ± 5®c.

+ Hàng ngày thay môi trường, lấy lam giọt mỏng để theo dõi sự phát triển của KST 3 ngày thêm HC nuôi một lần Nếu KST mọc tốt nhiều hơn 3% thì nhân ra nhiều đĩa để bảo quản đông lạnh và sử dụng để thử thuốc

SỐ HC đếm được của n vi trường

- Thử thuốc theo phương pháp của Thaithong- Beale (1983)

+ Chuẩn bị thuốc và mẫu thử:

• Bột BB 134 được hoà tan trong hỗn hợp DMSO và Tween 80

và artesunat được hoà tan trong gôm arabicl% để có cùng nồng độ là 10'^ molAit Sau đó pha loãng bằng nước cất 2 lần để được dãy nồng độ sau:1.25 X 1 0 ^ 2 5 X 10-^5 x i o ^ 1.10®; 2 X lO l

• Nuôi cấy p falciparum liên tục trong môi trường đầy đủ

(RPMI 1640 10,40 gr + HEPES 5,94 gr + Glucose 2,0gr + NaHCOg 5% + gentamycin + 10% huyết thanh người) theo phương pháp Trager- Jensen đã trình bày ở trên Tất cả phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, các dụng cụ đều phải xử lý vô trùng trước khi đem dùng