Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng

Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu ảnh hưởng của trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát triển phôi thai ở chuột nhắt trắng

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

ở CHUỘT NHẮT TRẮNG

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001 - 2005)

Người hướng dân

Nơi thực hiện

Thời gian thực hiện

: TS Nguyễn Xuân Trường

TS Trương Văn Như : Bộ môn Dược lực - Trường

ĐH Dược Hà Nội Viện SR - KST - CT TW : 04/2005 - 05/2005

HÀ NỘI, THÁNG 5/2

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn:

TS NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG.

TS.TRƯƠNG VÃN NHƯ.

Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều công sức và thời gian truyền thụ những kiến thức quí báu, hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này.

Em xin tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Dược lực

đã chỉ bảo dạy dỗ em trong suốt quá trình làm khoá luận, cũng như trong thcyị gian học tập tại trường.

Em cũng xin tỏ lòng cảm ơn cán bộ, nhân viên khoa nghiên cứu và điều trị bệnh số rét viện SR - KST - CT TW đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khoá luận

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè những người luôn độiiịị viên em và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.

Hà Nội ngày 25 tháng 5 năm 2005

Sinh viên

Trần Thị Kim Oanh

MỤC LỤC ■ ■

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN 1; TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Lịch sử phát triển của các thuốc chống sốt rét 2

1.2 Vài nét về cây Thanh hao hoa vàng 3

1.2.1 Đặc diểm thực vật 3

1.2.2 Thành phần hoá học 4

1.3 Tình hình nghiên cứu về ART và dẫn xuất 4

1.3.1 Tách chiết 4

1.3.2 Xác định cấu trúc 5

1.3.3 Một số tính chất của artemisinin 6

1.3.4 Cơ chế tác dụng của ART và dẫn xuất 6

1.3.5 Ảnh hưởng của ART lên quá trình sinh sản (đột biến) và sự phát ^ triển phôi thai

1.4 Tinh hình nghiên cứu Artemisinin gắn fluor 10

PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 13

2.1 Nguyên liệu, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình sinh sản (đột biến gen) và lên sự phát triển phôi thai của chuột chửa

2.1.4 Các chỉ số nghiên cứu 16

2.2 Kết quả nghiên cứu 18

2.2.1 Ảnh hưcmg của BB 101 lên quá trình thụ thai và phát triển phôi thai 18 2.2.2 Ảnh hưởng lên sự phát triển phôi thai ở chuột đã chửa 28

2.3 Bàn luận 30

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 33

3.1 Kết luận 33

3.2 Đề xuất: 33

TÀI LIÊU THAM KHẢO 34

ĐẬT VẤN ĐỂ •

Những năm gần đây, Artemisinin hoạt chất chính chiết từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) được các nhà nghiên cứu nhiều nước trên thế giói đặc biệt quan tâm bỏi tính ưu việt của nó Thuốc này vừa ít độc, vừa

có hoạt tính và hiệu quả điều trị cao với ký sinh trùng sốt rét p falciparum

Tuy nhiên, do khả năng hoà tan ít cả trong nước lẫn trong dầu của artemisinin cũng như thời gian bán thải ngắn nên tỷ lệ tái phát bệnh sốt rét còn cao ( 10- 47%) Mặt khác tình trạng ký sinh trùng sốt rét kháng lại các thuốc sốt rét ngày càng phức tạp Tuy ART là thuốc ít độc, nhưng khi sử dụng ART và dẫn xuất thì ảnh hưởng của nó lên cơ thể bệnh nhân như thế nào? Đặc biệt với đối tượng là phụ nữ có thai còn nhiều ý kiến khác nhau, thuốc có ảnh hưởng đến thai nhi và các thế hệ con hay không? Đây là vấn đề cần làm sáng tỏ Để giải đáp một phần các vấn đề trên, các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu bán tổng hợp ra các dẫn xuất mới của ART nhằm tìm ra các hơp chất có hiệu lực cao hơn, tác dụng điều trị tốt hơn để tiếp tục nghiên cứu sử dụng cho điều trị Việc bán tổng hợp ra các dẫn xuất mới từ ART luôn cần thiết cho việc sàng lọc ra các thuốc sốt rét mới, đặc biệt là các hợp chất có tác dụng với các chủng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

lOa - Trifluoro methyl dihydro artemisinin (kí hiệu là BBIOI) là một dẫn xuất gắn flúor của ART được các nhà khoa học Pháp tổng hợp, thử nghiệm ban đầu cho thấy tác dụng tốt trên ký sinh trùng sốt rét ở chuột nhắt trắng Để góp phần tìm hiểu độc tính và tiếp tục có những cơ sở đánh giá tiền

lâm sàng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ’’Nghiên cứu ảnh hưởng của Trifluoro methyl dihydro artemisinin lên quá trình sinh sản và phát trỉển phôi thai ở chuột nhắt trắng”.

Đề tài có hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình sinh sản của chuột ở thế hệ bố mẹ (P), thê hệ con F1 và thế hệ con F2.

2 Nghiên cứu ảnh hưỏtig của BBIOI lên sự phát triển phôi thai của chuột chửa.

PH ẦNl

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử phát triển của các thuốc chống sốt rét.

Hai ngàn năm trước đây, sách cổ Trung Quốc đã nói đến cây Thường sơn (Dicho febrífuga Lour Saxifragaceae) và cây Qinghao (Artemisia annua L) Nhưng mãi tói thế kỷ 17, khi người Châu âu khai thác và sử dụng cây Cinchona (cây sốt, fever trees, mọc ở sườn núi Pêru) thì việc nghiên cứu về mặt hoá học mới thực sự bắt đầu Năm 1810, A.Gomez (Bồ Đào Nha) vàI.Gize (Nga) thu được tinh thể quinin Bốn năm sau, P.Pelletier và J Caventou phân lập được alcaloid của vỏ cây Cinchona tạo thuận lợi cho việc chiết xuất

quinin ở nhiều nước trên thế giới [6] Mặc dù vậy, quinin không đủ đáp ứng nhu cầu cho việc điều trị sốt rét, nhất là trong chiến tranh thế giới Điều đó đã thúc đẩy việc nghiên cứu tổng hợp ra các thuốc sốt rét mới Kết quả là hàng nghìn hợp chất mới đã được điều chế Qua sàng lọc nhiều thuốc thuốc sốt rét mới được đưa vào sử dụng

Năm 1926, Schuleman, Shoenhofer và Wingler(Đức) đã tổng hợp được primaquin thuộc nhóm 8- aminoquinolein, sau đó Magnidsson và Stroukov (Nga) tìm ra plasmosid

Năm 1932, Mauss và Mietch tổng hợp được atebrin, mepacrin thuộc nhóm 9- aminoacridin bằng cách thay thế nhân quinolein trong công thức primaquin bởi nhân acridin Cũng như primaquin, mặc dù rất độc, chất nàyđược Fairly (úc) chứng minh có tác dụng khả quan trên 2000 trường hợp người tình nguyện [6]

Năm 1934, nhóm 4- aminoquinolein được tổng hợp nhờ chuyển vị trí mạch nhánh trong công thức primaquin, rồi thay đổi thành phần mạch nhánh này mà chloroquin ra đời (1944) Đó là thuốc chống sốt rét lý tưởng trong

nhiều năm, thuốc vừa có tác dụng điều trị p falciparum và p vivax, vừa có

khả năng dự phòng, lại ít độc hơn các thuốc chống số rét khác trong thời kỳ đó.

Năm 1945 Curd Davey và Rose tổng hợp được proguanil (chất 4880)

Cơ chế tác dụng của proguanil là ức chế sự phân chia nhân của ký sinh trùng sốt rét thể vô tính do ức chế hệ enzym dehydrofolatereductase (DHFR), hai năm sau Bekhli (Nga) cũng tìm được một chất cùng nhóm với proguanil là bigumal [6]

Năm 1951, Falco và Hitching (trong công trình phối hợp giữa Anh và Hoa Kỳ) tìm được pyrimethamin có cơ chế giống proguanil nhưng ít độc hơn

Từ năm 1960 xuất hiện tình trạng p falciparum kháng lại chloroquin ở Colombia, sau đó xuất hiện tình trạng p.falcifarum kháng lại các thuốc sốt rét

nhóm 4- aminoquinolein ở các nước Nam Mỹ và Đông Nam Á( Thái Lan, Việt Nam, Malaixia ) Từ đó các nhà khoa học đã tổng hợp được nhiều loại chất chống sốt rét mới, có tác dụng điều trị lâm sàng Những phác đồ điều trị

chống ký sinh trùng kháng thuốc gồm Sulfonamid phối hợp với pyrimethamin

và quinin đem lại kết quả điều trị ở nhiều vùng có ký sinh trùng kháng thuốc như Thái lan, Việt Nam và nhờ đó giảm được tỷ lệ tử vong do sốt rét ác tính và sốt rét nặng một cách đáng kể [6]

Từ năm 1967 các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra một loại cây thảo

đã được sử dụng từ lâu đời có tên là Qinghao (Artemisia annua L.) Năm 1972

đã tách chiết được artemisinin (Qinghaosu) từ cây Qinghao (Thanh hao) Artemisinin là một Secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân tử, khác hẳn với cấu trúc của các thuốc chống sốt rét khác, trong hệ thống dị vòng không có nitơ

1.2 Vài nét vê cây Thanh hoa hoa vàng.

1.2.1 Đặc điểm thực v ậ t.

Tên khoa học : Artemisia annua L Arteraceae

Tên thường g ọ i: ngải si, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng

Cây thảo mọc hàng năm, thân cao tới Im, có rãnh, gần như không lông

Lá xẻ lông chim 2 lần thành dải hẹp, phủ lông mềm, có mùi thơm Chuỳ cao ở ngọn mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8- 2,0 mm, lá bắc ngoài hẹp có lông xanh, lá bắc giữa và lá bắc trong xoan rộng Hoa hoàn toàn hình ống, khoảng

15 cái, hoa trong lưỡng tính Quả bế nhẵn, cao 0,5 mm không có mào lông, ra hoa vào tháng 6-11, có quả tháng 10-3 và thường lụi vào tháng 5[3]

Theo thông báo của WHO, của Trung Quốc, của Mỹ, trong khoảng 40 loài thực vật thuộc chi Artemisia, qua chọn lọc chỉ có loài Artemisia annua L

là có chứa hoạt chất chữa sốt rét

1.2.2 Thành phần hoá học.

Tất cả các bộ phận của cây Thanh hao hoa vàng đều chứa tinh dầu và hàm lượng tinh dầu trong cây rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi trồng, dao động từ 0,5- 0,6% Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi thơm long não với thành phần chủ yếu là camphor, artemisinin ceton, ß-myrcen [3,10,13]

1.3 Tình hình nghiên cứu ART và dẫn xuất.

1.3.1 Tách chiết.

ART được các tác giả Trung quốc tách chiết lần đầu vào năm 1972 bằng ethyl ether, nhưng mãi đến năm 1977 mới được công bố với tên Qinghaosu

Năm 1984, Daniel L Klayman và cộng sự đã mô tả phương pháp chiết xuất ART từ dược liệu sấy khô

Năm 1994, Guo-Qiang Zeng và cộng sự đã đưa phương pháp chiết xuất artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng bằng Hexan sôi trong 48h và phân lập bằng sắc ký với gradien dung môi rửa giải [7,8] ở Việt Nam từ năm 1989 nhóm nghiên cứu của Đinh Huỳnh Kiệt đã công bố kết quả chiết xuất ART từ cây Thanh hao bằng ete dầu hoả [9] Việc chiết xuất artemisinin phát triển rất

nhanh chóng Trong những năm gần đây (1991-1997) chiết xuất artemisinin ở Việt Nam đã tăng một vài kilogam lên vài tấn.

1.3.2 Xác định cấu trúc [21].

Cấu trúc của của artemisinin đã được xác định bằng kết hợp các phương pháp nhiễu xạ tia X, phân tích nguyên tố, khối phổ có độ phân giải cao cho công thức phân tử là C15H22O5 và công thức cấu tạo của ART như sau:

H ìnhl.l Công thức cấu tạo của Artemisinin.

Trong công thức trên, vòng A có dạng cyclohexan, vòng D là vòng lacton, vòng D và c đều là dị vòng oxy bão hoà, trong đó vòng c là một vòng trioxan có liên quan đến hoạt tính chống sốt rét của artemisinin

Năm 1976, các nhà khoa học Trung Quốc đã khử artemisinin bằng Sodium borohydric thành dihydroartemisinin chất này có hoạt tính chống sốl rét mạnh hơn artemisinin hai lần Khi thay thế gốc R bằng các gốc khác nhau

ta có các dẫn xuất khác nhau của artemisinin

9^3

R=CH2CH3 : ArteetherR=CO(CH2)2COONa : Sodium artesunate R=CíÌ2QH4COONa : Sodium artelinate

OR

Hình 1.2 Dẫn xuất của Artemisinin

1.3.3 Một sô tính chất của Artemisinin.

* Tính chất lý học

Artemisinin có dạng tinh thể hình kim, không màu, không mùi, vị hơi đắng, có điểm nóng chảy 151- 153°c, chịu được nhiệt độ 150°C- 200°c trong 2- 5 phút, nó chỉ bị phân huỷ do chặt đứt cầu peroxid khi nung nóng ở 190"C sau 10 phút, artemisinin tan rất ít trong nước và trong dầu, có thể bị phân huỷ trong dung môi phân cực và bị mở vòng lacton, có khả năng hoà tan và khá bền trong các dung môi không phân cực Artemisinin không bền trong môi trường acid hoặc base nhưng rất ổn định trong môi trường trung tính

* Tính chất hoá học

Trong phân tử artemisinin có cầu nối peroxid (- 0- 0 ) là mối liên kết nhạy cảm nhất, có vai trò quan trọng trong hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét Với các điều kiện khử hoá thay đổi, phân tử ART bị khử hoá ở các nhóm khác nhau Khử hydro hoá ART với tác nhân hydrogen có xúc tác Pd/ CaCOj khi cầu peroxyd bị mất thì ART không còn có hoạt tính chống sốt rét Khi khử ART với borohydid trong methanol nhóm lacton chuyển thành nhóm lactol cho dihydroartemisinin (không mất cầu peroxid) có hoạt tính chống KSTSR mạnh hơn cả ART

1.3.4 Cơ chế tác dụng của ART và dẫn xuất.

Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của ART

và dx của nó, nhưng cho đến nay cơ chế tác dụng của nó vẫn là vấn đề còn tranh luận Tuy nhiên, tác dụng của nó không đối kháng với acid para aminobenzoic, chứng tỏ cơ chế tác dụng của nó khác với chloroquin và các thuốc kháng folic khác Cơ chế tác dụng của ART và dx có thể là sự phối hợp của các cơ chế khác nhau như tác động lên màng tế bào, tạo ra các gốc tự do hay oxy hoạt động

Nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng hệ thống màng của KST là nơi tác dụng chính của ART Trước hết là những biến đổi về cấu

trúc màng, sau đó là sự phồng lên của các ty thể, màng nhân và cuối cùng làm tan rã cấu trúc bên trong của KST Trong giai đoạn hồng cầu invitro những biến đổi đó xuất hiện trong vòng 1- 4h sau khi tiếp xúc với thuốc Ellis và cộng sự (1985) đã thấy những thay đổi hình thái đầu tiên trong cấu trúc của ribosom và các lưới nội nguyên sinh Đầu tiên là sự tích luỹ của thuốc ở các màng này, tiếp đến là những thay đổi của nhân và ty thể rồi đến những thay

đổi ở không bào tiêu hoá

Một số nghiên cứu khác lại cho rằng cơ chế tác dụng của ART và dx là

do các gốc tự do Sự phá huỷ cấu trúc tế bào KST là do sự tấn công của các gốc tự do lên các thành phần chủ yếu của tế bào Điều đó thể hiện vai trò của cầu peroxid vì nó rễ dàng tạo ra các gốc tự do của oxy, cơ chế này cho phép lý giải tại sao dx nào của ART không còn chứa cầu peroxid thì không còn tác dụng điều trị sốt rét

Sắt đóng vai trò quan trọng trong việc sản sinh ra các gốc tự do từ ART Các chất tạo phức với sắt và các chất làm sạch gốc tự do chống lại sự oxy hoá của ART đối với các protein màng Các gốc tự do gây ra các tổn hại cho tế bào như peroxy hoá lipid, oxy hoá protein, alkyl hoá dẫn đến sự chết của tế bào

Một số công trình nghiên cứu khác lại chứng minh độc tính của thuốc đối với KST thông qua các dạng oxy hoạt động Tác dụng của ART invitro trên KST p falciparum tăng lên khi tăng áp xuất riêng của oxy hoặc khi thêm

các chất gây stress oxy như niconazol, doxorubicin Ngược lại hiệu lực của ART giảm do sự có mặt của catalase, vitamin E hoặc các chất chống oxy hoá như vitamin c, glutation khử

1.3.5 Ảnh hưỏtig của Artemisinin lên quá trình sinh sản (đột biến) và sụ phát triển phôi thai.

* Ảnh hưởng lên quá trình sinh sản (đột biến):

ART và dẫn xuất qua được hàng rào rau thai và hàng rào máu não, nên ảnh hưởng của ART và dẫn xuất khi dùng cho người mang thai còn nhiều ý kiến khác nhau Nghiên cứu khả năng gây đột biến cho thấy natri artesunate không gây đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và tế bào tinh hoàn của chuột nhắt trắng, không ảnh hưcfng đến hiện tượng giao phối và thụ thai của chuột, không ảnh hưởng đến số lượng con cho mỗi lứa đẻ, không tác động đến

sự sinh trưởng và phát triển của chuột thử nghiệm và không làm xuất hiện các

dị tật bẩm sinh [4]

Thực nghiệm trên chuột nhắt trắng được uống dihydroartemisinin liều

100 mg/ kg thể trọng, không gây đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và

tế bào tinh hoàn ở chuột nhắt trắng, không ảnh hưcmg đến quá trình sinh sản,

phát triển phôi thai, phát triển của chuột con ở thế hệ Fl, F2 và không gây các

dị tật bẩm sinh [15]

Trương Văn Như và cộng sự cũng cho thấy: artesunate uống liều 50 mg/

kg ngày đầu , 25 mg/ kg X 4 ngày sau và liều 25 mg/ kg ngày đầu; 12,5 mg/

kg X 4 ngày sau, nhắc lại 2, 3 đợt, không gây ảnh hưởng đến nhiễm sắc thể ở

tế bào tuỷ xưoíng và tế bào tinh hoàn của chuột nhắt trắng [1 r

Nghiên cứu về đột biến trên động vật của các tác giả nước ngoài đã cho thấy ART không phải là chất gây đột biến, không gây quái thai ở bào thai chuột cống [16] Tuy nhiên một số tác giả Trung Quốc cho rằng ART độc với bào thai chuột nhắt và chuột cống chủng XVistar, đặc biệt trong thời kỳ giữa và

muộn của bào thai, ở liều 1/400 của LD50 có một nửa các bào thai bị hấp thụ,

uống liều 1/25 của liều LD50 gây ra một số dị hình như thoát vị rốn, 100% bào thai bị hấp thụ

*Ảnh hưởng lên sự phát triển của phôi thai:

ở những chuột nhắt trắng: sau khi thụ thai ngày thứ 6- 15, tiêm artemether 5,4 mg/ kg, không thấy ảnh hưởng rõ ràng tới trọng lượng, độ dài, ngoại hình của thai và chuột con đẻ ra Khi đưa liều 10,7 mg và 21,4 mg/ kg

thì có 30% và 100% bào thai bị teo, nhưng ở liều 21,4 mg/ kg tiêm vào ngày

thứ 12-17 của thời kỳ mang thai thì không ảnh hưởng đến sự phát triển của thai [18]

Trên chuột cống và thỏ cho thấy: Với liều 5,4 mg/ kg không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của thai Với liều 21,4 mg/ kg, thì bào thai bị teo artemether cho độc tính cao hơn arteether đối với phôi thai của chuột nhắt và chuột cống [18]

Nghiên cứu tiền lâm sàng của ARTECEF BV, Maarssen, The Nethelands về artemether đã cho thấy ở liều 1,2 - 2,2 mg / kg không gây ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của động vật thí nghiệm [17\

Nghiên cứu về kết luận của công ty Ltd Dự án 3929629 (RCC, 1995d): Nghiên cứu trên chuột cống về khả năng sinh sản, với liều 2, 4, 6 mg/kg, chuột đực 28 ngày, chuột cái 14 ngày Kết quả cho thấy ở chuột đực: giảm nồng độ tinh trùng, làm suy yếu hưng phấn Chuột cái không ảnh hưởng sự

làm tổ của trứng [ 20_.

Số liệu về việc sử dụng ART và dẫn xuất trên phụ nữ có thai còn rất hạn chế Sáu bệnh nhân sốt rét là phụ nữ có thai từ tuần thứ 17 đến 27 được điều trị bằng natri artesunate tiêm bắp hoặc artemether với tổng liều 500 - 900 mg chia 3 ngày liên tục, không thấy các biểu hiện có hại với thai nhi Theo dõi những đứa trẻ sinh ra trong suốt 6 - 1 0 năm sau, chúng vẫn phát triển bình thường, không có các dị tật bẩm sinh nào được phát hiện Theo dõi từ 3 tháng đến 10 năm của 17 trẻ được sinh ra từ các bà mẹ được nhận ART vào tuần thứ

16 đến 18 của thời kỳ mang thai không có sự bất thường, ngoại trừ một trường

hợp đẻ non ở tuần thứ 34 [19].

Nghiên cứu của các tác giả trong nước, cho thất dihydroartemisinin với liều 100 mg/kg thể trọng đường uống đã gây ảnh hưởng rõ đến sự phát triển phôi thai chuột chửa, làm tăng tỷ lệ thai chết sớm, tỷ lệ thai chết muộn, giảm

tỷ lệ thai sống so với lô chứng, song không gây ra dị tật bẩm sinh cho các chuột con được sinh ra [15].

Artesunate liều 50 mg/kg ngày đầu và 25 mg/kg X 4 ngày sau, không ảnh hưởng đến tỷ lệ giao phối, tỷ lệ thụ thai, tỷ lệ thai chết sớm và thai chết muộn giữa các thế hệ p, Fl, F2 Các chuột con sinh ra ở các thế hệ Fl, F2 không có dị tật bẩm sinh, không có sự khác biệt về số lượng, trọng lượng chuột con được sinh ra so với lô chứng [11]

1.4 Tình hình nghiên cứu artemisinin gắn fluor.

Mặc dù tác dụng chống sốt rét của artemisinin có nhiều ưu việt so với các thuốc chống sốt rét kinh điển nhưng việc sử dụng còn nhiều hạn chế do khả năng hoà tan kém của nó trong nước cũng như dầu, thời gian bán thải ngắn, điều đó gây tỷ lệ tái phát đáng kể (20- 50%) [1, 5,14] Để thay đổi dược động học và thu được dạng thuốc có tác dụng dược lý tốt hơn, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu bán tổng hợp từ nó ra các dẫn xuất mới bằng cách gắn fluor vào dẫn xuất dihydroartemisinin dựa trên những đặc tính nội lại

do các nguyên tử flour có trong phân tử đem lại Khi thay thế các nguyên tử flour vào những nguyên tử hydro đã làm tăng khả năng hoà tan của phân tử, đồng thời cũng làm tăng tính ổn định của dẫn xuất trong quá trình chuyển hoá (do liên kết C- F rất bền vững ), như vậy có thể hy vọng sẽ làm tăng thời gian bán thải

Trương Đình Thạc và cộng sự (Viện hoá công nghiệp) và Jean Pierre Bugue (Pháp) đã tìm cách gắn fluor vào phân tử artemisinin, để ổn định được dạng hemiacetal của dihydroartemisinin Các dẫn xuất ether gắn fluor của dihydroartemisinin sẽ chuyển hoá chậm hơn, làm chậm quá trình oxy hoá bởi

emzym cytocrom

^450-Các dẫn xuất ether của ART có chứa fluor được điều chế theo 3 phương pháp sau :

- Cho dihydroartemisinin tác dụng với alcol có chứa fluor, chất xúc tác đặc hiệu BF3Eí20

- Cho dihydroartemisinin tác dụng với alcol có chứa fluor, chất xúc tác

là CLSÌ(CH3)3

- Áp dụng phản ứng Mitsunobu ^

Trên nguyên tắc của các phưoỉng pháp trên, nhóm BIOCIS - Chatenay

đã tổng hợp được 2 dẫn xuất gắn fluor của dihydroartemisinin, một trong số

đó là ; lOa - triflouromethyldihydroartemisinin (ký hiệu là BBIOI)

Hình 1.3.10a-trifluoromethydihydroarteiĩiisinin.

BBIOI có tác dụng diệt KST sốt rét nhanh và mạnh hơn ART Thử nghiệm với liều 50mg/kg chuột nhắt trắng thấy 100% chuột sạch KST sau 24h

điều trị, tỉ lệ khỏi là 100% không thấy tái phát trong vòng 60 ngày với cả

chủng kháng và chủng nhạy chloroquin Nồng độ ức chế 50% KST (IC50) là 4,4 nmol/1 với chủng nhạy chloroquin và 4,6 nmolA với chủng kháng chloroquin trong khi đó IC50 của ART là 12,7 nmol/1, nồng độ ức chế lối thiểu (MIC) là 10 nmolA, tất cả đều thấp hơn các chỉ số tương ứng của ART 3 lần [2] Nghiên cứu này cũng cho thấy tỉ lệ tái phát của BBIOI thấp hơn nhiều

so với ART (0% với cả chủng nhạy và chủng kháng chloroquin so với 20% ở

chủng nhạy chloroquin và 97% ở chủng kháng chloroquin của ART)

Nghiên cứu của Trương Văn Như và cộng sự [12] cho thấy liều độc cấp (LD50) của BBIOI trên chuột nhắt trắng với đường uống là 820 mg/ kg.

Với liều uống 20 mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục, BBIOI không làm thay đổi số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, hàm lượng hemoglobin cũng như chỉ số về điện tim và cấu trúc hình thái gan, thận thỏ thực nghiệm [12]

BBIOI liều uống 50 mg/kg/ ngày, uống một đợt 5 ngày, không gây ảnh hưởng đến tốc độ hình thành phản xạ, thời gian phản xạ và tốc độ dập tắt phản

xạ ở chuột nhắt trắng và chuột cống trắng, nghĩa là không ảnh hưởng đến chức

năng cao cấp của hệ thần kinh trung ương [12

BBIOI với liều 50 mg/kg không gây các rối loạn về tần số và số lượng nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và tế bào tinh hoàn chuột nhắt trắng Không ảnh hưởng đến số lượng và trọng lượng con trong mỗi lứa đẻ, các chuột con phát triển bình thường, không có các dị tật bẩm sinh [12’

P H Ầ N 2

THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1 Nguyên liệu, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Nước cất để pha thuốc

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu.

* Chuột nhắt trắng ( Mus musculus L) chủng Swiss do viện VSDT cung cấp, số lượng 160 con cả hai giống đực và cái cùng độ tuổi, trọng lượng trung bình 25 ± 2g, được nuôi dưỡng trong những điều kiện thích hợp về thức ăn, nước uống như nhau trong suốt quá trình thực hiện Số chuột trên được chia

thành các lô:

- Các lô chuột cái :

+ Lô uống BBIOI: 60 con

+ Lô uống gôm arabic 1%: 30 con

+ Lô không uống BBIOI: 30 con

- Các lô chuột đực tương ứng:

+ Lô uống BBIOI: 20 con

+ Lô uống gôm arabic 1%: 10 con

+ Lô không uống BBIOI : 10 con

* Chuột nhắt trắng đã có chửa từ ngày 6 - 10, do viện VSDT cung cấp

Số lượng 20 con, cũng được chia thành 2 lô;

- Lô chuột chửa uống BBIOI: 12 con

- Lô chuột chửa uống gôm arabic 1%: 10 con

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên quá trình sinh sản (đột biên gen) yà lên sự phát triển phôi thai của chuột chửa.

* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên đột biến gen.

Kỹ thuật phát hiện đột biến gen rất phức tạp Cho đến nay người ta chỉ phát hiện đột biến gen bằng phương pháp gián tiếp trên những tình trạng của thế hệ con, kết quả tổ hợp đực cái Trong đề tài này, chúng tôi chọn te^ Dominant lethal Các chuột nghiên cứu được chia ngẫu nhiên thành các lô sau:

- Lô chuột cái uống BBIOI 11611(^0 / kg / ngày X 5 ngày l i ẽ n l^ (30con) ghép với lô chuột đực uống BBIOI liều 50 mg / kg / ngày X 5 ngày liên tục liên tục (10 con )

- Lô chuột cái không uống BBIOI (30 con) ghép với lô chuột đực uống BBIOI liều 50 mg / kg / ngày X 5 ngày liên tục (10 con )

- Lô chuột cái uống BBIOI liều 50 mg / kg / ngày X 5 ngày liên tục (30 con) ghép với lô chuột đực không uống BBIOI (10 con )

- Lô chuột cái uống gôm 1% (30 con) ghép với lô chuột đực uống gôm arabic 1% liều 50 mg / kg / ngày X 5 ngày liên tục ( 10 con ).

Chuột ở các lô trên được uống thuốc qua kim đầu tù, uống hàng ngày vào lúc 9h sáng, uống liên tục trong 5 ngày Sau đó toàn bộ số chuột ở các lô trên được ghép theo qui trình(Tđực + 3 caỉ^trong một chuồng, ghép trong 5 ngày Sau khi ghép xong, nuôi các chuột đã thụ thai ( thế hệ p ) đến ngày thứ

1 3 -1 4 , chia số chuột này thành 2 nhóm :

+ 50% số chuột cái có chửa được mổ để quan sát số hoàng thể ở mỗi bên buồng trứng, số thai phát triển bình thường, số thai chết sớm ( dạng cục máu màu xẫm ) và số thai chết muộn

+ 50% số chuột cái có chửa còn lại nuôi cho đến khi đẻ để quan sál số

con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng con trong mỗi lứa, số con bị các dị tật bẩm

sinh

Số chuột con đẻ ra (Fl) được nuôi lớn đến khi trưởng thành đạt trọng

lượng trung bình 20g/con, tách riêng chuột đực, chuột cái, nuôi tiếp đến khi có

trọng lượng trung bình 25g/con Ghép tiếp các chuột đực F1 với các chuột cái

F1 theo sơ đồ 1 đực + 3 cái một cách ngẫu nhiên ở từng chuồng riêng Các

bước tiến hành, các quan sát như ở thế hệ F1 lại được thực hiện

Theo dõi sự phát triển của số chuột con được sinh ra ở thế hệ F2 cho tới

khi đạt trọng lượng trung bình 20g/ con, rồi lại tiến hành các bước như ở thế

h ệ F l

* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BBIOI lên sự phát triển phôi thai chuột chửa.

Nghiên cứu trên các chuột đã có chửa vào ngày thứ 6 - 1 0 gồm 2 lô :

- Lô chuột cái đã có chửa vào ngày thứ 6 -10 được uống BBIOI với liều

50 mg/kg/ngày X 5 ngày liên tục ( 12 con ).

- Lô chuột cái đã có chửa ngày thứ 6-10 được uống gôm Arabic 1% liều

50 mg/ kg/ngày X 5 ngày liên tục ( 10 con )

Sau khi uống thuốc nuôi tiếp đến ngày 13 -14, chia số chuột chửa thành

2 nhóm :

+ 50% số chuột cái có chửa được mổ để quan sát số hoàng thể ở mỗi

bên buồng trứng, số thai chết sớm (dạng cục máu màu xẫm), số thai chết

muộn

+ 50% số chuột cái có chửa còn lại nuôi cho đến khi đẻ để quan sát số

con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng con trong mỗi lứa, số con bị dị tật bẩm sinh

Toàn bộ số chuột ở các lô nghiên cứu đột biến gen và nghiên cứu ảnh hưởng

lên sự phát triển phôi thai chuột chửa được uống ( BBIOI và gôm arabic ) qua

kim tiêm đầu tù với liều 50mg/kg/ ngày uống mỗi ngày một lần vào lúc 9h

sáng, uống liên tục 5 ngày Sau khi kết thúc đợt uống thuốc, tiến hành ghép

các lô chuột như trên

2.1.4 Các chỉ sô nghiên cứu.

• Các chỉ số đánh giá lên quá trình sinh sản ( đột biến gen ) gồm :

- Tình trạng chuột con được sinh ra :

+ Số con mỗi lứa

+ Trọng lượng trung bình ( gam )/con trong mỗi lứa + Số con bị dị tật bẩm sinh

• Các chỉ sô đánh giá lên sự phát triển phôi thai chuột chửa uống thuốc.

- Tinh trạng phát triển phôi th a i:

+ Số thai sống

+ Số thai chết sớm

+ Số thai chết muộn

- Tình trạng chuột con ;

+ Số con mỗi lứa

+ Trọng lượng trung bình ( gam )/con trong mỗi lứa

+ Số con bị dị tật

*xử lý sô liệu:

Các số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thông kê y - sinh học bằng chương trình EPIINPO 6.0 với các mẫu nhỏ (n < 30), để xác định giá trị trung bình X và độ lệch chuẩn SD

Các chỉ số nghiên cứu được so sánh dọc giữa các lô uống thuốc với lô chứng theo phương pháp so sánh giữa các nhóm độc lập Trong so sánh nếu:

• p > 0,05 là khác biệt không có ý nghĩa thống kê

• p < 0,05 là khác biệt có ý nghĩa thống kê

• p < 0,01 và p < 0,001 là khác biệt rất có ý nghĩa thống kê