Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid

Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa flavonoid

BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợc HÀ NỘI

^í|í5|í>f:^:ifí^5fí5fí::ịí>^^::ịí::Ịíiỉí5f:::í;:ịí

Đ ỗ THỊ BlCH HUỆ

NGHIÊN CỨU THÀNH LẬP TIÊU CHUẤN KIÉM NGHIỆM

MỘT SÔ' DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID ■ ■ ■

(3 C h é a í u ậ t t t ế t n ạ h iỀ Ịi ^ ư đ 4 í »ặ- k h é u 2 0 0 1 -2 0 0 Ó )

Người hướng dẫn: Ts Nguyễn Viết Thân

Pgs Nguyễn Vàn Nội

Trường Đại học Dược Hà Nội

Hà Nội, tháng 05 năm 2006.

l ở i C Ẩ \M Ơ N

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn

TS Nguyễn Viết Thân và PGS Nguyễn Văn Nội đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đd tôi trong suốt quá trình học tập và làm khoả luận

Nhân dịp này tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong trường đặc biệt các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu Trường Bại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân

và bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đd và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Hà nội, tháng 5 năm 2006 Sinh viên:Đỗ Thi Bích Huê.

MỤC LỤC

Trang

Đ ẶT VẤN Đ Ể 1

PH ẦN 1: TỔNG Q U A N 3

1.1 Tổng quan về flavon oid 3

1.2 Tổng về các dược l i ệ u 3

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 6

PHẦN 3: THỰC NG H IỆM VÀ KẾT Q U Ả 10

3.1 Chỉ thực- Chỉ x á c 10

3.2.Trần b ì 19

3.3 Kim n g ân 24

3.3.1 L.japonica Thunb., L am iaceae 26

3.3.2 L confusa DC., L am iaceae 29

3.4 Cây Râu m èo 41

3.5 Núc n á c 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ X U Ấ T 54

TÀI LIÊU THAM K H Ả O 56

Đ Ặ T V A N Đ Ể

Đã từ lâu ông cha ta đã biết sử dụng các loại cây cỏ để phòng và chữa bệnh cho nhân dân Ngày nav, với tiến bộ của khoa học kĩ thuật nền công nghiệp hoá dược phát triển mạnh việc sử dụng cây cỏ thiên nhiên trons chiết xuất bào chế và điều trị ngày càng tăng Với một hệ thực vật phong phú và đa dạng, Việt Nam có khoảng gần 4000 loài được dùng làm thuốc, việc xác định nguồn gốc dược liệu khồng dễ dàng nhất là hiện nay tên gọi vị thuốc chưa thống nhất cùng một cây có khi mỗi nơi gọi m ột khác (Sài đất tại một số địa phưcmg tỉnh Vĩnh Phú gọi là Húng trăm) hoặc nhiều cây khác hẳn nhau lại cùng mang một tên (Bồ công anh, Nhân trần, Cam thảo) Mặt khác, thực tế hiện nay việc lưu thông phân phối chưa được kiểm soát chặt chẽ nên trên thị trường có rất nhiều dược liệu không rõ nguồn gốc dẫn đến trong quá trình sử dụng có thể ảnh hưởng đến kết quả điều trị Vì vậy công tác kiểm nghiệm dược liệu để xác định rõ nguồn gốc, tránh nhầm lẫn, giả mạo hết sức quan trọng và cần thiết

Hiện nay với sự ban hành của Dược điển Việt Nam III đã trở thành công

cụ, cơ sở pháp lý cho việc kiểm nghiệm dược liệu góp phần nâng cao hiệu quả

sử dụng thuốc đông dược Tuy nhiên m ột số chuyên luận trong Dược điển mới chỉ ở mức độ mô tả chưa có hình ảnh minh hoạ cụ thể như đặc điểm hình thái cây thuốc, vị thuốc, đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột nén khó đối chiếu, dễ nhầm lẫn Để cụ thể hoá các tiêu chuẩn kiểm nghiệm trong DĐVN III, tạo

điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một sò dược liệu chứa Flavonoid”.

Mục tiêu: Hình ảnh hoá, lượng hoá, tăng thèm các dữ liệu về cây và dược liệu trong quá trình kiểm nghiệm góp phần tạo điều kiện cho việc kiểm nghiệm dễ dàng hơn, đạt hiệu quả cao và chính xác

Nội dung khoá luận:

Kicm nghiệm các mãu dược liệu chuẩn iheo mộl số tiêu chuẩn trong

DĐVN III và đưa ra các ảnh chụp minh họa cây thuốc, vị thuốc, đặc điểm vi phẫu, đặc diểm bột dược liệu.

ứng dụng phưcfng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) trong định tính các hoại chất trong dược liệu, có các anh chụp bản sắc ký, bảng phân tích sắc ký đổ để tăng thêm các dữ liệu cho việc kiểm nghiệm dược liêu

PHẦN I T Ổ N G QUAN 1.1 Tổng quan về Flavonoid

Flavonoid ỉà một trong những nhóm hợp chất polỵphenol tự nhiên, chiếm một số lượng lớn trong thực vật cũng như trong dược liệu có nguồn gốc thực vật Nó có tầm quan trọng rất lớn đối với con người không chỉ vì nó cung cấp chất màu thực vật mà còn vì có nhiều hợp chất trong nhóm có tác dụng sinh lỵ (coumestron, phloridzin, rotenone ) Đa số các dược liệu và chế phẩm đông dược được dùng trong y học cổ truyền và V học hiện đại với các tác dụng: thanh nhiệt, liêu viêm, bổ gan, lợi mật, phòng chống xuất huyết, phòng chống xơ vữa mạch, hạ huyết áp đều có thành phần chính là flavonoid Ngày nay flavonoid nói riêng và các hợp chất polyphenol tự nhiên nói chung đang được nghiên cứu và ứng dụng trong đời sống và y được rất nhiều.[3] [12] [23] [26]

Đến nay có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc [3], Flavonoid có

Đính vào các vòng A, B của khung thường là m ột hoặc nhicu nhóm hydroxyl tự do hoặc đã thay thế một phần Các polyphenol có thể phản ứng với nhau tạo ihành các phân tử phức tạp hcfn hoặc liên kết với các hợp chất khác trong cây như các ose (dạng glycoside) hoặc protein [12J Để phân loại các flavonoid người ta dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và mức độ oxy hoá của mạch 3C

Euflavonoid (Flavonoid chính danh): gốc aryl ở vị trí C-2 Một số chất điển hình: flavan, flavanon, jflavon, flavonol, chalcon, auron N hóm này

chiếm số lượng lớn nhất trong số các hợp chất flavonoid.

^ Isüflavonoid: gốc aryl ở vị trí C-3 Một số chất chính isoílavon, isoflavanon, ro ten o id , trong đó isoflavon là nhóm lớn nhất với 364 chất đã xác định được cấu trúc

♦ Neoflavonoid: gốc aryl ở vị trí C-2 Nhóm này íl chỉ có trong một sốloài

sắp xếp dựa theo kiểu liên kết trong cấu trúc.[3] [12J [23]

Flavonoid là một trong những nhóm phân bố rông rãi nhất trong tự nhiên

Nó tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín lớp hai lá mầm, rất nhiều họ chứa

flavonoid với đủ các nhóm {Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae, Rỉitaceae ) Lớp 1 lá mầm có khoảng trên 10 họ tìm thấy flavonoid: Araceae, ỉrid a c e a e

Trong ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ số lượng flavonoid không nhiều chủ yếu là dẫn chất của biflavonoid Trong thực vật bậc thấp ít được gặp các flavonoid Động vật không tổng hợp được flavonoid nhưng một số loài bướm thấy có flavonoid do lấy từ ihức ăn thực vật [3

Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: Hoa (Kim ngân), quả (Cam, Quýt), thân và lá (Râu mèo), vỏ thân (Núc nác) ngoài ra còn có trong hạt, rề, thân rẻ, gỗ.[23] [26;

Nó là một nhóm hoạt chất có tính chất rất khác nhau và có khả năng chuyển đổi lính chất giữa các cấu trúc khác nhau của nhóm [11] : Các

flavonoid glv co sid và flavonoid Sulfat phân cực nên không tan hoặc ít tan

trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước Các dãn chất flavonoid có nhóm 7- hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng

Vì vậỵ không có phucfng pháp chung nào để chiết xuấl các flavonoid.[3'

Để xác định sự có mặt CÍIa các dãn chất nhóm flavonoid người ta sử dụng phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda); Dung dịch tlavonoid trong ethanol

them bột magie rồi nhỏ từ từ acỉd hỵdroclorid đậm đặc Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thãm hoặc đỏ tươi.

Đc định lượng flavonoid người ta sử dụng một số phương pháp sau:

° Phương pháp cân: Chỉ dùng khi nguyên liệu giàu flavonoid và ít các chất đi kèm

° Phương pháp đo phổ tử ngoại

° Phưcmg pháp đo màu: bàng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AICI3 [3^

Trong đề tài này chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu trên một số cây và dược liệu sau: Chỉ thực, Chỉ xác, Trần bì, Kim ngân, Râu mèo, Núc nác

1.2 Tổng quan về các dược liệu.

Để thuận tiện cho việc theo dõi, đối chiếu và tránh trùng lặp, tổng quan

về các dược liệu nghiên cứu sẽ được trình bày theo từng dược liệu cùng với kết quả nghiên cứu

• Chỉ xác: Quả chưa chín bổ đồi đã phơi hay sấy khô của cây Cam chua

{Citrus aiirantium L.) lấy tại Viện dược liệu.

• Trần bì: v ỏ quả đă phơi hay sấy khô của cây Quýt {Citrus reticuỉata

Blanco.) lấy tại Viện dược liệu

• Kim ngân: Hoa, cành và lá của hai loài Kim ngân {Lonicera japónica Thunb ; Lonicera confusa DC.) lấy tại Nghĩa Trai Hưng Yên và Vườn

thực vật ĐH Dược Hà Nội

• Núc nác: v ỏ thân cây Núc nác (Orữxyỉum ỉndicum (L.) Vent.) lấy tại

Vườn thực vật ĐH Dược Hà Nội

• Râu mèo: Phần trên mặt đất của cây Râu mèo {Orthosiphon stamineus

Benth.) lấy tại Vườn thuốc Văn Điển

Trong quá trình nghiên cứu có sử dụng các mẫu trên thị trường để kiểm tra, đối chiếu so sánh

2.2 Phưomg pháp nghiên cứu.

Xử Iv và báo quán mẫu

Mẫu dược liệu nghiên cứu có thể là dược liệu tươi hay dược liệu đã phơi khô, sau khi thu về được xử lý bảo quản theo phưoíng pháp chung, cụ thể:

• Mẫu dược liệu cắt vi phẫu có thể dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô được làm mềm, bảo quản trong hỗn hợp Cồn- Nước- Glycerin

• Mẫu dược liệu dùng soi bột được thái nhỏ, sấy khô, nghiền thành bột, báo quản trong lọ kín,

• Mầu dược liệu dùng để chạy sắc ký được ihấi nhò, sấy khô ở nhiệt độ

<60^’c , bảo quản nơi khô ráo.

N ghiên cứu dăc diểm hình thái bên ngoài

o Mô tả đặc điểm, chụp ảnh cây lại nơi thu hái trực tiếp,

o Mô tả đặc điểm dược liệu

o Các mẫu nghiên cứu được chụp ảnh, mô tả vế hình dạng, kích thước, màu sắc, thể chất, mùi vị

N ghiên cứu đăc diém vi hoc

o Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu của dược liệu.[4] [16]

Tiến hành làm tiêu bản vi phâu cố định theo các bước sau:

C ắt vi phẫu: Dược liệu tươi hav khô đã ngâm m ềm được cắt ngang bằng lưỡi

dao cạo hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tav, chọn các lát cắt mỏng

Tẩy: Ngâm các lát cắt vào dung dịch cloram in hoặc nước Javen, thời gian

ngâm tuỳ từng mầu cụ thể, có thể rút ngắn bằng cách đun nóng —> Rửa bằng nước nhiều lần —> Rửa bằng dung dịch acid acetic 10% —> Rửa bằng nước cho hết acid acetic

Nhuộm: Theo phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh metylen

Nhuộm đỏ son phèn —> Rửa bằng nước —> Nhuộm xanh metỵlen - > Rửabàng nước, "rhời gian nhuộm tuỳ vào tính chất bắt màu của từng mâu cụ thể

C ố định- Vi phẫu sau khi nhuộm được khử nước từ từ bằng cồn với độ cồn

tăng dần 10^', 20'^ 80°,90“, sau cùng là cồn tuyệt đối Lắc vi phẫu 3 lần trong xylen Đặt vi phẫu vào m ột giọt bôm Canada trên phiến kính, đậv lá kính Đc tiêu bản ở chỗ thoáng 2-3 tuần cho ổn định

Tiêu bản vi phẫu cố định được quan sát m ô tả đặc điểm và chụp ảnh dưới kính hiển vi

o Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu

Xác định màu sắc, mùi vị, bột dược liệu bằng cảm quan

Sử dụng các dung dịch khác nhau để lên kính: nước, cloral hydrat, glycerin Quan sát dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm bột dược liệu

Nghiên cứu vé thành phán hoá hoc bằng phương pháp sác kv lớp mỏng hiêu năntĩ cao (HPTLC) [6Ị [21 ]

♦ Nguyên tắc:

HPTLC dựa trên nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng thông thường, tiến hành trong điều kiện chuẩn nhất định với sự hỗ trợ của máy móc và phần mềm vi tính chuyên dụng

Sắc ký đồ dịch chiết trong các điều kiện khác nhau đặc trưng cho các mẫu phân tích là cơ sở để kiểm nghiệm dược liệu theo phưcmg pháp “dấu vân tay” (finger-print)

♦ Các bước tiến hành:

Chuẩn bị dịch chấm sắc kỷ: Cho Ig dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml

methanol Đun sôi trên cách thuỷ khoảng 10 phút Lọc lấy dịch lọc để chấm sắc ký

Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagen GF254 chuẩn của hãng

MERCK Bản mỏng được hoạt hoá ở 1 1 0 't trong 1 giờ, cắt thành bản 20x10 (cm^)

Chấm sắc ký: Sử dụng máy chấm sắc ký CAM AG-Linomat 5.0 với phần mềm

điều khiển winCATS Cụ thể:

Kẹp bản mỏng vào đúng vị trí trên máy chấm Linom at 5.0

Lấy vào xỵlanh chuẩn một thể tích mẫu chấm thích hợp và đặt lên máy Điều khiển quá trình chấm bằng máy vi tính: Dữ liệu cho mỗi lần chấm được khai báo và lưu trong một file Đánh dấu các lựa chọn và nhập các thông

số cần thiết Quá trình chấm vết được tự động tiến hành, đổng thời có thổi khí nén làm khô vết chấm

Triển khai sắc ký: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất tách được tốt

nhất

Quá trình triển khai được thực hiện trong bình sắc ký tiêu chuẩn, dung môi bão hoà tốt quá trình chạy dung môi phải Icn đều (vết dung môi phẳng)

Sau khi triển khai, bản mỏng được lấy ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi.

Quan sát và chụp ảnh: Quan sát và chụp ảnh trong buồng quan sát của hệ

thống CAM AG Reprosta 3 với sự hỗ trợ của phần mcm winCATS ơ ánh sáng

tử ngoại bước sóng 254nm, 366nm, và ở ánh sáng trắng sau khi đã phun thuốc thử hiện màu

Thuốc thủ hiện màu: Phun bằng Vanilin trong ethanol và H2SO4 đặc, sau

đó sấy ngay bản mỏng ở nhiệt độ cao

Xử ỉỷ kết quả: Sử dụng phần mềm Videoscan với độ chính xác phát hiện điều

chỉnh được

Đinh tính: Với mỗi dược liệu khác nhau thực hiện các phản ứng khác nhau theo các chuyên luận ghi trong DĐVN

PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả

3.1 Chỉ thực-chỉ xác

Tổng quan.

Trong DĐVN III Chỉ thực và Chỉ xác đều có chuyên luận riêng nhưng

là các vị dược liệu của cùng một cây thu hái ở các thời kỳ khác nhau nên chúng tôi xếp chung vào mội phần để tiện theo dõi và đối chiếu

Chỉ thực là quả non có đường kính trên 1 cm đã phơi hay sấy khô của câv

Cam chua (Ciĩrus aurantium L.) và giống cây trồng của nó hoặc cây Cam

ngọt {Citrus sinensis Osbeck.), họ Cam {Riitaceae) [2] [7

Chỉ xác là quả chưa chín có đường kính 3-4 cm, bổ đôi, phơi hay sấy khô

ở nhiệt độ thấp 40-50^C của cây Cam chua {Citrus auranĩium L.), họ Cam {Ruíaceae).[2] [7]

Chỉ thực được thu hái vào tháng 5-6 thường là những quả non bị rụng còn Chỉ xác được thu hái vào tháng 7-8

Trên thực tế, như ở Trung Quốc, Chỉ thực được thu hái ở hcfn 10 cây chi Citrus và P o n à ru s M ột số cây chính: Poncitriis trifolia Raf.; Citrus wiisonii Tanaka.; Citrus aurantỉum L.; Citrus aurantiiim L var am ara E n g l

Ở V iệt Nam, Chỉ thực cũng được thu hái từ rất nhiều cây khác nhau thuộc

họ Cam nhưng chưa xác định chính xác được tên, người ta thường nói đến cây

Chấp {Ciírus hysírix DC.) [201

Cây Cam chua là cây gỗ nhỏ cao 2-4m nhánh không lông, gai thẳng,

răng cưa, cuống dài 3 cm, rộng có cánh 1-1,5 cm Hoa rất thơm, có 20-24 nhị Quả tròn, to, chót lồi, đáy hơi có núm, có 10-12 múi rời nhau ở giữa, nhiều hạl; quả bì dày, lúc non thơm, nạc chua đắng [9] [14;

Chỉ thực có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Ẩ i Độ, M alaysia sau lan rộng ra

nhiều nước Đông Nam Á và Nam Trung Quốc và Châu Âu ở nước ta cây mọc nhicu ở phía nam.

Thành phần hoá học, Chỉ thực và Chỉ xác đều có chứa ílavonoid (hesperidin), alcaloid (0,09%), gỉycoside (20,49% ), saponin (5,86%), đặc biệt chứa không dưới 2,5% tinh dầu [25] với 57 thành phần trong đó nhiều nhất là citronelal, P“pinen và sabinen, tuy nhiên hàm lượng glycoside trong Chỉ xác thấp hơn trong Chỉ thực (9,89% ) [7] [20], Các nhà nghiên cứu khoa học Trung Quốc còn tìm thấy trong dịch chiết từ vỏ quả có các acid amin, N- methyltyramin senephrin [19] [28]

Trong nhân dân dùng Chỉ thực, Chỉ xác với tác dụng như nhau để chữa thần kinh dễ bị kích thích, mất ngủ, ăn uống không tiêu, đầy hơi, ho đờm, tiểu tiện khó [5] [7] [20]

Đối với vị thuốc Chỉ thực, ƠIỈ xác, DĐVN III yêu cầu kiểm nghiệm một

số tiêu chuẩn: Đặc điểm hình thái bên ngoài, đặc điểm bột, định tính bằng phưcfng pháp hoá h ọ c

Riêng với Chỉ thực có thêm phần định tính bằng sắc ký lớp mỏng:

Bản mỏng: Silicagen H có chứa carboxy methỵl-cellulose natri

Dung môi khai triển: inethanol- aceton- cloroíorm - amoniac đậm đặc (3:4:13:0,5)

Dung dịch thử: 0,5 g bột dược liệu trong 5 ml methanol đun hồi lưu trên cách thuỷ 1 giờ, để nguôi, lọc, bay hơi dịch iọc đến khô, thêm 4 ml methanol hoà tan Lọc, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Dung dịch synephrin 0,3 % trong methanol hoặc0,5 g bột Chỉ thực chiết như dung dịch thử để được dung dịch đối chiếu

Kết quả thưc nghiêm

Sau khi tiến hành nghiên cứii đối với Chỉ thực và Chí xác chúng tôi Ihu được kết qua sau:

Đặc điểm hình thái bên ngoài.

• Mò tả dược liệu.

C hỉ thực: Dược liệu hình bán cầu, một số hình cầu đường kính 0,5-2,5 cm

Vỏ ngoài màu lục đen có vết cuống quả hoặc vết sẹo của vòi nhuỵ Trên mặt

và múi quả màu nâu Mùi thơm, vị đắng hơi chua (Hình 1 a)

C h ỉ xác: Dược liệu hình bán cầu đường kính 3-4 cm, vỏ quả ngoài màu

nâu ỏ đỉnh có những điểm túi tinh dầu dạng hạt, vẫn còn vết vòi nhuỵ và vết cuống quả Mặt cắt lớp vỏ quả giữa màu trắng hơi nhô lên, đày 0,4-1 cm Ruột quả có từ 10-15 múi Múi khô nhăn màu nâu đen trong có hạt Mùi thơm, vị đắng hơi chua (Hình Ib)

❖ Đặc điểm vi học.

• Đặc điểm bột.

Bột m àu vàng nâu mùi thơm, vị đắng hơi chua

Soi dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm: Biểu bì vỏ quả ngoài là các tế bàohình đa giác hoặc hình chữ nhật (3) Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình lăng trụ nàm riêng lẻ (8) Lỗ khí (2) và các mảnh biểu bì mang lỗ khí hơi tròn

đường kính 16-25 ß m (5) Cấc tế bào vỏ quả giữa hơi tròn hoặc không đều,

dạng chuỗi ngọc nàm rải rác (9) Có rất nhiều túi chứa tinh dầu nằm trong lớp biểu bì (1) Khá nhiều mạch xoắn nằm riêng lẻ hoặc nằm trong các mô (7) Ngoài ra còn thấy rất nhiều thể inuHn nằm rải rác hoặc thành đám.( Hình Ic)

► Định tính,

Định tính bằng các phản ứng hoá học.

2 phúl, lọc Lấy 5 ml dịch lọc thêm một ít bột magie và vài giọl acid

hydroclorỉd (TT), đổ yên —> Thấy xuấl hiện màu đỏ tía

phút, lọc Lấy I ml dịch lọc thêm 5 mg kali tetrahydroborat, lắc đều thêm vài

giọt aciđ hỵdroclorid (TT) —> xuất hiện màu đỏ anh đào

Định tính bàng HPTLC.

Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.2 sử

dụng bản mỏng là silicagen GF254 với hệ dung m ôi là M ethanol- Aceton-

Cloroform- Amoniac đậm đặc (3:4:13:0,5), thu được kết quả:

• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ của dịch chiết Chỉ thực, Chỉ xác trong methanol quan sát ở ư v

254nm (Hình 1.1.1; Hình 1.1.2)

• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ của dịch chiết Q iỉ thực, Chỉ xác trong methanol quan sát ở u v

366nm (Hình 1.1.3; Hình 1.1.4)

• Sắc ký đổ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông sô' của sắc

ký đồ của dịch chiết Chỉ thực, Chỉ xác trong methanol quan sát ở ánh

sáng thường sau khi phun hiện màu (Hình 1.1.5; Hình 1.1.6)

Nhân xét: Chỉ thực và Chỉ xác là quả của cùng m ột cây thu hái tại các thời

điểm khác nhau nên chỉ khác nhau ở đặc điểm hình thái bên ngoài còn về đặc

điểm vi học, định tính và sắc ký về cơ bản là giống nhau

Hiện nay trong DĐVN III kiểm nghiệm Chỉ thực yêu cầu bản mỏng

khác silicagen co chứa carboxy methyl-cellulosc natri nhưng chúng tôi tiến

hành nghiên cứu trên bản mỏng silicagen GF254 cho kết quả tách khá tốt,

tăng thêm các dữ liệu cho việc kiểm nghiệm dược liệu Chỉ thực

Bản mỏng silicagen GF254 là bản mỏng được sử dụng phổ biến nên nếu

không có gì đặc biệt trong việc kiểm nghiệin chúng ta có thể nên đưa silicagen

GF254 vào dùng thay thế cho silicagen H có chứa carboxy mcthỵl-cellulose natri.

Trong quá trình nghiên cứu, chúng lôi cũng liến hành so sánh các mẫu Chì thực, Chỉ xác lấy tại Viện dược liệu và thu thập trên thị trường, thấy kết quả sắc ký cũng có sự khác biệt Điều này phù hợp thực tê Chỉ thực, Chỉ xác

có thể được thu hái từ các loài Cam khác nhau

Hình Ic; M ột số đặc điểm bột chỉ thực: 1-túi chứa tinh dầu;

2-lỗ khí; 3-biểu bì vỏ quả ngoài; 4-mảnh mô có chứa tinh thể calci oxalat

9-mô mềm vỏ quả

Track 1

Total Height Total £t^a : iO?J?2 ^3

Hình 1.1.1; Kết quả sắc ký dịch chiết Chì thực quan sát ở

ánh sáng tử ngoại bước sóng 254tim

sác kí đồ Cliỉ tlụrc - Chi xác ở bước sóng 254nm

Total H iỉigM 15627 s Tùial ^ ^ 3 le iS ỹ S

Hình 1.1.2: Kểt quả sắc ký dịcli chiết Chỉ xác quan sát ở

ánlì sáng từ ngoại bước sóng 254nni

16

Hình 1 ỉ 5; Ket quả sắc ký dịch chiết Chỉ thực quan sát ở

ánh sáng thường sau khi hiện màu

Sắc kí đồ Chỉ thực-Chỉ xác quan sát ở ánh sáng thường

Dược liệu là vỏ quýt đã phơi hay sấy khô Người ta cho rằng vỏ quýt phơi

Về đặc điểm thực vật, Quýt là cây gỗ nhỏ cao 3-5m, gai ngắn, cành không lông Lá xoan bầu dục tưcfng đối nhỏ, mép có răng nhỏ, không lông, dài 7 cm, rộng 3,5 cm; gân phụ 5-8 cặp; cuống tròn dài 0,6-0,7 cm Hoa 1-3 ở nách lá, cọng 1 cm, lá đài xanh không lông, cánh hoa dài 1 cm Quả hơi bẹp, đầu cắt ngang hay lõm, đáy tròn có chút núm, quả bì màu vàng hay cam mỏng, dễ bóc

Q uýt có nhiều tạp chủng phức tạp như: Tangerine có trái màu cam là tạp chủng giữa Quýt và Cam

Quýt được trồng khắp nơi trong nước ta đặc biệt là các vùng Nghệ An,

Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Giang Trên thực tế trong nhân dân sử dụng vỏ của nhiều loại quýt khác chưa xác định được tên khoa học quýt giấy, quýt tà u , Thành phần hoá học của vỏ quýt tươi: tinh dầu 3,8% chủ yếu là limonen, flavonoid (hesperidin), các vitamin A, B, các chất vô cơ như Brom Nước quýt

có đường, acid citric, vitamin c , carotene Lá cũng có chứa tinh dầu khoảng0,5%

Ngoài công dụng của quả quýt trong thực phẩm, v ỏ quýt và lá quýt để chế tinh dầu, quýt còn là vị thuốc quan trọng và thông dụng trong nhân dân và đông y

v ề mặt tác dụng, theo y học cổ truyền Trần bì có vị cay đắng, tính òn, quy kinh tỳ và phế có lác dụng kiện tỳ, hoá đờm được sử dụng trong các bài thuốc để chữa ăn uống không tiêu, ăn không ngon, nôn mửa, trừ đờm [5] [20J

Do Trần bì có chứa Brom nên còn có tác dụng làm dịu thần kinh [14]

Nước quýt có tác dụng giải rượu, giải khát, bồi bổ; lá quýt hơ nóng chữa đau bụng, ho

Ngoài vị thuốc Trần bì nhân dán còn sử dụng các vị thuốc Thanh bì (vỏ quả quýt còn xanh phơi hay sấy khồ), Quất hạch (hạt quýt phơi khô).[20]

Đối với vị thuốc Trần bì DĐVN III yêu cầu kiểm nghiệm một số tiêu chuẩn sau: Đặc điểm hình thái bên ngoài, đặc điểm bột, định tính hoá học

Kết quả thưc nghiẽm

Đặc điểm hình thái bẽn ngoài.

Bột màu nâu, mùi thcfm hắc, vị cay

Soi dưới kính hiển vi thấv: Mảnh vỏ quả ngoài gồm các tế bào hình dạng khác nhau thành hơi đày M ảnh mô mềm Sát dưới lớp vỏ quả ngoài có các tinh thể calci oxalat hình khối Mảnh mạch vòng, vạch, điểm

Các đặc điểm bột của Trần bì không có gì khác so với các hình ảnh minh hoạ trong tài liệu [2 2 ]

* Định tính.

Định tính bằng các phản ứng hoá học.

Cho 2g bột dược liệu vào bình nón 100 ml thêm 10 ml ethanol 96% đun

hồi lưu cách thuỷ 10 phút, lọc Dịch lọc chia 3 phần và làm các phản ứng sau:

♦ Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiêm thêm một ít bột Magie (TT) vài giọt acid hydroclorid đặc (TT) '-> xuất hiện màu đỏ hồng

clorid 5% —> xuất hiện màu xanh đen

♦ Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm thêm vài giọt dung dịch Natri

Định tính bằng HPTLC.

Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.2, với

hệ dung môi Diethylether : Ethylacetat (50:1), thu được kết quả :

• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ của dịch chiết Trần bi trong m ethanol quan sát ở ư v 254nm (Hình 2.1)

• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ của dịch chiết Trần bì trong m ethanol quan sát ở u v 366nm (Hình 2.2)

• Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ của dịch chiết Trần bì trong methanol quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun hiện màu (Hình 2.3)

Nhân xét: Với hệ dung môi Diethylether: Ethylacetat cho kết quả tách tưcíng đối tốt Ngoài việc sử dụng vaniiin trong cồn và H2SO4 làm thuốc thử hiện

HPTLC để kiểm nghiệm dược liệu chứa flavonoid Đồng thời chúng tôi cũng tiến hành so sánh các mẫu dược liệu lấy tại Viện dược liệu và thu thập trên thị trường thấy cũng có một số khác biệt (Kết quả sắc ký)

Ảnh 2a: Cây quýt Ảnh 2b: Vị ứiuổc trần bì

Total h eight 53S6.81 Total fir^3 : n m i

Hình 2.1; K.ết quả sắc kí dịch chiết trần bì quan sát ở ánh sáng tử ngoại

bước sóng 254 nm

Tctal Height 3 2 4 7 8 9 Total f ir ^ a : 6 8 5 3 8 3

Hình 2.2: Ket quả sắc kí dịch chiết Trần bì quan sát ở

3.3 Kim ngân

Tổng quan

Kim ngân là vị thuốc kinh nghiệm được sử dụng rất nhiều trong nhân

dụng hoa sắp nở (Kim ngân hoa), cành và lá (Kim ngân cuộng) đã được phơi hay sấy khô

Chi Lonicera L có khoảng 10 loài ở Việt Nam, tất cả đều dùng làm thuốc Trong đó có hai loài được dùng phổ biến: Lonicera japónica Thunb và Lonicera confusa DC.

Cây Kim ngân có tên khoa học là Lonicera japónica Thunb thuộc họ Cơm cháy {Caprifoiiaceae), còn có tên khác: Dây nhẫn đông, Boóc kim ngần

(Tày), Chừa giang khằm (Thái)

Cây leo bằng thân quấn dài 9m, cành non có màu xanh, có lông mịn bao phủ, cành già nhẵn hơi đỏ Lá nguyên mọc đối, hơi dày hình trái xoan đài 4-7

cm, rộng 2-4 cm gốc tròn, đầu nhọn nhẵn, cuống lá dài 0,5-0,6 cm, có lông.Cụm hoa mọc ở nách lá gần ngọn thành xim 2 hoa Lá bắc giống lá con hình mũi mác, tròn có iông thưa ở mép Đài có 5 răng, có lông Hoa khi mới

nở cánh hoa màu trắng sau chuyển sang vàng nhạt, mùi thơm nhẹ, 5 cánh hoa

dính liền nhau thành ống ờ phía dưới, chia thành 2 môi Nhị 5, thò ra ngoài

cánh hoa đính ở họng tràng Bầu nhẵn, quả hình cầu màu đen Kim ngân ra

Kim ngân có nguồn gốc ở vùng Đông Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, ở Việt Nam, Kim ngân chu yếu ở vùng núi và trung du phía bắc: Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Scfn, Bắc Giang

Lonicera confusa DC - Kim ngân lẫn, Kim ngân núi.

Cây ỉeo 2-4m, cành có lông, hơi xám Lá có phiến hình trái xoan, tròn hay gần tim ở gốc, nhọn hay gần nhọn ở đầu, mặt trên nhẩn, mặt dưới có lông

Hoa cũng mọc thành xỉm 2 hoa ở nách lá gần ngọn Tràng dài 1,6-3,5 cm, đường kính ống tràng 0,5-2 mm, có nhiều lông, lúc đầu có màu tráng sau chuyển sang vàng Bầu có lông, lá bắc hình dùi hẹp và dài [9J L14J [17] [18] Cây ra hoa vào tháng 6-9, ra quả vào 10-11.

Phân bố ở Nam Trung Quốc và vùng Ấn Độ-M alaysia ở nước ta Kim ngân

lẫn mọc ở các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Tây

Ngoài 2 loài phổ biến ở trên ta còn gặp một số loài khác: [9] [14]

L canibodiana Pierr ex Danguy - Kim ngân lông.

L dasystyỉa Dehd - Kim ngân dại, Kim ngân quả nhám.

L hiỉdebrandiana Coll et Hemsl - Kim ngân quả to.

L.hypogỉauca Miq - Kim ngân lá mốc.

L macrantha (D.Don) spreng - Kim ngân hoa to.

Thành phần hoá học: Hoa và lá có chứa ílạvonoid, chất chính là luteolin-7- rutinosid (lonicerin), ngoài ra còn có các luteolin glucosid khác và

phân cùa nó; tinh dầu (a-pinen, geraniol, eugenol, linalol) , saponin, carotenoid và 1 số thành phần khác Lá còn có loganin, secologanin

Theo kinh nghiệm nhân dân và trên thực tế Kim ngân thường được dùng riêng hay phối hợp với các vị khác chữa mụn nhọt, mày đay, lở ngứa, ban, sởi,

tả, lỵ, ho do phế nhiệt, điều trị thấp khớp, viêm mũi do dị ứng và bệnh dị ứngkhác, ở Trung Quốc, Kim ngân được dùng như 1 thuốc hạ sốt, dễ tiêu, trị lỵ Hoa phơi khô dùng để lợi tiểu Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm của Kim ngân [15]

Ycu cầu kiểm nghiệm với Kim ngân hoa theo DĐVN III, DĐTQ có một

số tiêu chuẩn sau: mô tả dược liệu, đặc điểm bột, định tính bằng phucfng pháp hoá học

Kết quá thưc nghiêm

Kim ngân cớ rất nhiều loài khác nhau trong khoá luận chúng tôi chỉ tiên

hành nghiên cứu hai loài thông dụng nhất: Lonicera japónica Thunb và Lonicera confusa DC.

3.3.1 L ja p ó n ica Thunb., Lam iaceae

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi tiến hành trên cả hai dược liệu là Kim ngân hoa và Kim ngân cuông

❖ Đặc điểm hình thái bên ngoài.

• Mò tả cây.

Cây leo, cành lúc non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, nhẩn sau ngả màu

đỏ Lá màu xanh thẫm, mọc đối, hình trứng dài, cuống ngắn, cả hai mặt có lông mịn Hoa mọc từng đôi ở kẽ lá, lức mới nở màu trắng, sau chuyển sang vàng Cùng m ột lúc trên căy có cả hoa trắng (mới nở) và hoa vàng (Ảnh 3a)

• M ô tả dược liệu.

Kim ngân hoa: Nụ hoa hình ống hơi cong queo, dài 1-5 cm M ặt ngoài màu vàng đến nâu, phủ đầy lông ngắn Phía dưới ống tràng có 5 lá đài nhỏ, màu lục, trong nụ có 5 nhị và một vòi nhụy Dược liệu có mùi thơm nhẹ, vị hơi đắng (Ảnh 3c)

Kim ngân cuộng: Cành và lá được cắt thành từng đoạn nhỏ dài 4-6 cm, cành có màu nâu đỏ, lá mọc đối có màu lục xám khô quăn, phiến lá dày mặt trên có ít lông, mặt dưới nhiều lông mịn, cuống lá dài (Ảnh 3b)

0,08 min riêng lẻ hay tập trung thành đám Tinh ihể calci oxalat hình cầu gai Manh biểu bì mcing lỗ khí.

• Vi phẫu lá

Phần gân lá: Gân trên lá hơi lồi, gân dưới lồi nhiều Biểu bì trên và dưới cấu tạo bởi một hàng tế bào xếp đều đặn, thành ngoài hoá cutin, mang các lồng che chở Mô dày trên và dưới cấu tạo bởi những tế bào tròn, thành dày

• Vi phẫu thân

M ặt cắt thân tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì là một hàng tế bào nhỏ xếp đều đặn mang nhiều lông che chở đơn bào Mô dày gồm 2-3 hàng tế bào thành dàv, xếp sát dưới lớp biểu bì Mô mềm cấu tạo từ những tế bào thành

vòng Li be tạo thành vòng liên tục Tầng phát sinh libe-gỗ không nhìn rõ Gỗ gồm các mạch gỗ xếp thành, các hàng tập hợp lại thành bó Mô mềm ruột gồm các tế bào tròn, đa giác có thành hoá gỗ, càng vào phía trong kích thước

tế bào càng lớn dần Khuyết trung tâm, ở cành non cấu tạo từ các tế bào thành cellulose mỏng, rỗng ở cành già

Các đặc điểm bột của Kim ngân hoa L.japonica không có gì khác so với

các hình ảnh minh họa trong tài liệu [2 2 ;

❖ Định tính.

Định tính bằng phản ứng hoá học

♦ Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 20ml ethanol 90%(TT) Lắc kĩ, đun cách thuỷ 15 phút, lọc Cô dịch lọc trên cách thuỷ đến khi còn khoảng 5mL Lấy Im l dung dịch vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt HCl đặc và một ít bột M g (TT) dung dịch chuyển từ màu (TT) vàng sang da cam đến đỏ

♦ Lấy Ig bột dược ỉiệu cho vào ống nghiêm, thêm lOml nước cất, lắc nhẹ trong 5 phút, lọc Cho vào 2 ống nshiệm mỗi ống 2ml dịch lọc Tliêm 2-

3 giọt NaOH 10% (TT) vào ống nghiệm thứ nhất, dung dịch có màu