Nghiên cứu biến đổi sinh học Cua Đồng bằng công nghệ vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi.. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Động vật giáp xác ở nước ta là khá phong phú, một số trở nên quen thuộc và gắnliền với cuộc sống của chúng ta như Tôm,Cua, Ghẹ, Ba khía,…đây là nguồn thựcphẩm nhiều chất dinh dưỡng, cung cấp nhiều năng lượng và khoáng chất cần thiết cho

cơ thể

Tuy nhiên, do hàm lượng vỏ của nguồn nguyên liệu này là khá lớn nên khi thải rangoài môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường do nó rất khó phân huỷ Bên cạnh đó, quaquá trình nghiên cứu, người ta thấy rằng trong thành phần vỏ của các loài giáp xác này

có chứa nhiều chất khoáng, protein, Chitin,…mà đặc biệt là Chitin - một vật liệu rấtquý, đang được cả thế giới quan tâm và nghiên cứu

Bởi vậy chúng ta phải góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà lại tận dụngđược lớp vỏ của các loài giáp xác này làm thực phẩm chức năng Vì lí do này mà tôiđược giao nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu biến đổi sinh học Cua Đồng bằng công nghệ

vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải ”

1.2 Mục đích đề tài

 Nâng cao giá trị kinh tế của Cua Đồng

 Có thể ăn Cua Đồng nguyên con vì lợi ích về dinh dưỡng, kinh tế và môitrường

1.3 Nội dung đề tài

- Nuôi sinh khối các vi sinh vật thí nghiệm

- Thu nhận Chitin từ vỏ Cua

- Làm mềm vỏ Cua bằng các phương pháp hóa và vi sinh vật học

- Phân tích sinh hóa các nguyên liệu tham gia và được tạo thành trong thí

nghiệm

- Chế biến thực phẩm từ Cua Đồng đã được làm mềm vỏ

CHƯƠNG 2

2.1 Cua nước ngọt (Parathelphusidae, potamidae)

2.1.1 Thành phần loài

Theo các kết quả nghiên cứu cho tới nay, thành phần loài Cua nước ngọt ở ViệtNam thuộc hai họ Potamidae và Parathelphuside, bao gồm 19 loài, thuộc 8 giống Cácgiống có số loài nhiều nhất là Ranguna (4 loài), Somaniathelphusa (5 loài) và giốngOrientalia có 3 loài, còn các giống khác (Potamon, Tiwaripotamon, Potamiscus,Larnaudia, Siamthelphusa) chỉ có 1-3 loài

Có thể nhận xét về sự đa dạng về thành phần loài cua nước ngọt Việt Nam, cả vềgiống và loài nhưng còn ít về số họ Tính đặc trưng về thành phần loài được thể hiện ởcác loài có thể coi là đặc hữu của Việt Nam, cũng như một số loài chỉ có ở các nướctrong khu vực Đông Dương Trong khi đó, một số giống, loài khác có ở các vùng lâncận ( Thái Lan, Malaisia, Campuchia, Indonesia, Nam Trung Quốc ) nhưSundathelphusa, Thaipotamon, Ceylonthelphusa, Parathelophusa,…cho tới nay cònchưa thấy ở Việt Nam

Potamiscus mieni và có thể một số loài khác nữa như đã phát hiện ở vùng Tây Bắc (LaiChâu).

2.1.4 Thành phần dinh dưỡng của Cua Đồng

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của Cua Đồng

Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được

2.2 Khái quát về Trichoderma harzianum sp.

2.2.1.Đặc điểm sinh học của nấm T harzianum sp

2.2.1.1 Vị trí phân loại [10,13]

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong việcphân loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.Theo hai nhà khoa học Elisa Espossito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộcloại họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, được phân làm năm nhóm:Trichoderma, Longibrachiatum, Satutnisporum, Pachybarium và Hypocreanum Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma được phân loại nhưsau:

T harzianum được phân thành hai nhóm nhỏ qua việc phân tích chuỗi DNA và hình thái ngoài: T harzianum1 và T harzianum 2.

Hai nhóm nhỏ này khác nhau ở khả năng tạo ra chất kháng nấm bệnh

2.2.1.2 Đặc điểm hình thái [1, 9]

Khuẩn lạc T.harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau lục tươi, lục sẫm Mặt

dưới khuẩn lạc không màu Bào tử áo ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các nhánh, hìnhcầu, nhẵn, không màu, đường kính 6-12 µm

Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 µm, dài tới 250

µm Thể bình có kích thước 3-4 x 5-7µm, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tậncùng, ở dọc các nhánh thường đơn độc Thể bình ở giữa thường dài tới 17 µm và cóđường kính nhỏ hơn, phần rộng nhất khoảng 2-3 µm Bào tử trần hình gần cầu, hìnhtrứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, không vách ngăn, kích thước 2 - 3 x 3 -3,5 µm, nhày ở thể bình

Bào tử T.harzianum Hệ sợi T.harzianum

Hình 2.1 Hình thái vi thể của T harzianum 2.2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của T.harzianum [13]

T.harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp Theo nghiên cứu của Domsch

và cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của T.harzianum vào

khoảng 30 °C, tối đa khoảng 36 °C

T.harzianum cũng có thể phát triển ở nhiệt độ khoảng 5 °C, nhưng sinh trưởngrất chậm và yếu

Giá trị awnhỏ nhất là 0,91 ở 25 °C.

T.harzianum tổng hợp enzyme chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin,

glyotosin…)

Vấn đề độc tố của T.harzianum chưa được biết đến.

2.2.2 Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

2.2.2.1 Bảo vệ thực vật [10]

Một trong những nghiên cứu ứng dụng T.harzianum được quan tâm nhiều nhất

đó là khả năng kiểm soát sinh học và khả năng kháng một số nấm gây bệnh quantrọng ở thực vật Giống Trichoderma này tấn công các nấm bệnh bằng cách tiết ra cácenzyme phân giải chitin Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những kết quảthuyết phục về hoạt động kháng nấm Sclerotium rolfsii (nấm bệnh ký sinh trên cây

thuốc lá) của T.harzianum qua việc tổng hợp các enzyme chitinase

Bên cạnh tác dụng kháng nấm, T.harzianum còn có khả năng ức chế các tác

nhân gây bệnh trên cây trồng Trichoderma là một thành phần đặc hiệu trongTrochodex – một chế phẩm dùng để chống lại sự mục rữa của táo sau thu hoạch Mặt

khác, T.harzianum còn được kết hợp với polysporum trong việc sản xuất Binabt - chế

phẩm được dùng trong chữa trị các vết thương bị nhiễm trùng và thối rữa ở rễ

Backman, Redriguer - Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm T.harzianum ngăn

chặn bệnh do nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia, Pythium sp ,bảo vệ cây họ đậu và

củ cải tránh được bệnh chết ẻo Theo Emxep V.T (1989) nấm Trichoderma không chỉtiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấutrúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển của các vi khuẩn nốt sần

cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây trồng Một

số chủng nấm T.harzianum còn có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống

chịu bệnh của cây trồng

2.2.2.2 Cải thiện năng suất cây trồng [6, 24]

Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bịthoái hóa, chai sạn, làm các loài giun đất không thể phát triển được, hạn chế sự phát

nông nghiệp phát triển trên thế giới có khuynh hướng sử dụng các phân bón hữu cơsinh học thế hệ mới, thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừsâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này

có tác dụng sau:

Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, héo rũ,… và hạn chế các tác hại nguyhiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh,đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân

Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinhdưỡng và kích thích cây sinh trưởng của cây

Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa Đã có

nhiều công trình khoa học chứng minh rằng T harzianum và T koningii kích thích sự

nẩy mầm và tăng trưởng của cây Đối với các loài được trồng trong nhà kính,

T.harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng

hoa

Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra

hệ rễ cứng cáp hơn Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu bắp có T harzianum

T-22 hỗ sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-T-22

Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vậtnốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trongđất, bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng

Như vậy, các chủng nấm Trichoderma sp trong các chế phẩm phân hữu cơ visinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềmchế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dàitrong tự nhiên

2.2.2.3.Trong lĩnh vực xử lý môi trường [10]

T.harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng.

T.harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6

– Trichlorophenol ; 4,5 – dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muốikhoáng Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự dotrong môi trường khoáng mặn

T.harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin,

glycophosphate, và amino methylphosphonic ( 3-methoxyphenyl)

T.harzianum 2023 (khoa sinh lý thực vật trường Đại học California) có thể phân

giải DDT , endosulfan, pentachloronitrophenol và pentachlorophenol

T.harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24

giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất vàtrong đầm lầy

2.2.2.4 Trong các lĩnh vực khác [12, 26 ]

Trichoderma sp là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại bào.

Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làmcho vải bông mềm và trắng hơn

L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen β- xylanase ( XYN 2) của T.reesei ởSaccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóahemicellululose trong lúa mạch và các cây lương thực khác

2.3 Tổng quan về Chitin

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Chitin [9]

Năm 1811 Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot Trong quá trình nghiêncứu trên một loài nấm Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác với dung dịchkiềm , ông thu được sản phẩm và đặt tên là Chitin (Chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là

“tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc)

Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của Chitin Năm 1843Lassaige chứng minh rằng trong Chitin có mặt của Nitrogen

2.3.2 Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên [8, 25]

Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh họcđược tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật Lượng chitin được sản xuất hàng nămtrên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm /1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật

Trong giới động vật, Chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ

tròn Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi Trong tự nhiên, Chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin- protein Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hóa chất và các men thủy phân gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của Chitin

Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng Chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Chitin – Chitosan và các sản phẩm từ chúng

Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau :

Dán 35%

Bọ cánh cứng 37%

Nhện 38%

Bò cạp 30%

Sâu 20-38% Nấm 5-20% Tôm 33%

Cua 70%

Mực 3-20%

2.3.3 Cấu trúc phân tử và tính chất của Chitin

•Cấu trúc phân tử: [23, 27]

Qua nghiên cứu về sự thủy phân Chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người

ta thấy rằng Chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-(-D-Glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside)

Hình 2.2 Cấu trúc Chitin

Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ , sự khác nhau này thể hiện

ở sự sắp xếp các chuỗi Ở chuỗi α – chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau Tuynhiên, chúng có một cặp xếp cùng chiều Ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theomột chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le vớimột chuỗi ngược chiều trong cấu trúc

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của Chitin

•Tính chất của Chitin [8 ]

Chitin ở thể rắn có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các

trong các dung môi thông thường Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc ( HCl,H2SO4, H3PO4…)

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đặc, chitin bị khử gốc acetyl tạo thànhchitosan

Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại ở bước sóng 884- 890 nm

2.3.4 Sự tách chiết Chitin [8]

Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chínhcủa Chitin là từ vỏ cua và tôm Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạngphức hợp với một số chất như : CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ,… nên việctách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc: đó là loại hết tạpchất đồng thời không làm biến đổi tính chất của Chitin

CaCO3

protein

Nấm, tảo

Hình 2.4 Quy trình tách chiết Chitin

2.3.5 Thành phần của Chitin trong một số loài

Chitinase [ Poly Beta 1-4 – (2-acetalmido-2-deoxy )-D glucoside

glucanohydrolase ] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phânChitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamin liên tiếp nhau trong

chitin Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.

2.4.2 Phân loại

2.4.2.1 Căn cứ vào khối lượng phân tử[14]

Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, Chitinase thuộc hai họ Glycohydrose 18

và Glycohydrolase 19

•Họ Glycohydrolase18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc

Eukaryote, Prokariot và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra

còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetylglucosaminidase.Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonashydrophila, Bacillus circularis, T.harzianum, Aphanocladium album, Serratiamarcescens…

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những Chitinase thuộc nhóm I, II,IV.

Hình 2.6 Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19

2.4.2.2 Dựa vào trình tự aminoacid [15]

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptidenhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme Chitinase thành 5 nhóm:Nhóm I : là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nốivới tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl ( C ) ( peptide nhận biết ) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết

Nhóm II : là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếuđoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương

tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn, chúng đượccảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài

Nhóm III : trình tự amino acid hoàn toàn khác với Chitinase nhóm I và II

Nhóm IV : là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47%trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tửcũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinasenhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn Chitin( vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thựcvật bậc cao

2.4.2.3 Dựa vào phản ứng phân cắt [14]

Enzyme phân giải chitin bao gồm : endochitinase, chitin 1-4 – β –chitobiosidase, N-acetyl –β – D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase

Endochitinase: là enzyme phân cắt nội mạch Chitin một cách ngẫu nhiên tạo cácđoạn olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuối cấy nấmmốc T.harzianum ( 2 loại endochitinase : M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 =40kDa, pI2 = 3,9) , Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8)

Chitin 1,4-β - chitobiosidase: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩmchính là các dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ T.harzianum sp (M =36kDa, pI = 4,4 ± 0,2)

N-acetyl – β - D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt Chitin từmột đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamin

Chitobiase: là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân glucosamin

N-acetyl-D-Hình 2.7 Vị trí phân cắt enzyme Chitinase 2.4.3 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme Chitinase [14]

2.4.3.1 Trọng lượng phân tử

Enzyme Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân

tử khoảng 30kDa ( kilodalton) Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá,

lưỡng cư, thú), một số Chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử của enzyme Chitinase thu nhận từ

nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa

2.4.3.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme Chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng: 3- 10 ở thực vật

bậc cao và tảo; pI: 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá ; pI: 3,5 – 8,8 ở visinh vật

Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 ( g/100ml)

2.4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme Chitinase ở vi sinh vật hoạt động tại

40 °C Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme Chitinase có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau Các enzyme Chitinase thực vật thuộc nhóm III và Chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả

năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80 °C

2.4.3.4 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ enzyme Chitinase từ 4-9 đối với các enzyme

Chitinase ở thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme Chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở

vi sinh vật là 3,5- 8,0

Theo các nhà khoa học, pHop của enzyme Chitinase có thể có sự phụ thuộc vào

cơ chất được sử dụng Đa số các enzyme Chitinase đã được nghiên cứu có pHop

khoảng 5,0

2.4.4 Cơ chế tác động của hệ enzyme Chitinase [11, 16]

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của Chitin và chitooligomer,sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau,nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinasekhông thể phân cắt thêm được nữa

Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme Chitinase ở Trichoderma.

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớnhơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thíchdiacetylchitobiose (GlcNAc)2

β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liêntục từ đầu khộng khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetylglucosamin (GlcNAc).Ngoài ra để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất Các oligsaccharide thường được thuỷ phân bên trong trênmột vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả năngthuỷ phân trisaccharid, một số khác thì không Cũng có hai dạng chitinase thuỷ phânpentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid ; một phân cắtbên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại Chitinase thực chất làenzyme cắt ngẫu nhiên.

Cơ chất đặc hiệu của hệ enzyme Chitinase từ Trichoderma rất phức tạp.Endochitinase , chitobiosidase và β –N- acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơchất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơntrên chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa Chitin là những cơ chấtthích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase.Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loạienzyme trên nhưng β-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làmgiảm độ đục của huyền phù chitin (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase.Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase

và β-N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là GluNAc

Glucosamin là chất có nhiều ứng dụng trong y học Nó đóng vai trò sinh lý sinhhóa trong cơ thể người, tham gia vào chức năng giải độc của gan và thận, chống viêmgan, chống dị ứng và chống thiếu oxi trong máu.

Glucosamin là nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp các chất nhờn và sụn ở các khớp

cơ thể Khi các khớp bị tổn thương, nó là nguyên liệu để cơ thể sản xuất các chất cầnthiết như: collagen, proteoglycan, glucosaminglycan để phục hồi sụn khớp và tái cungcấp chất nhờn giúp các khớp linh động trở lại

Ngoài ra, Glucosamin còn có tác dụng chống ung thư, chữa tổn thương dườngruột, dạ dày

2.6.2 Calci trong cơ thể người [19]

Calci là chất khoáng thiết yếu cho hoạt động bình thường của rất nhiều quá trìnhnội và ngoại bào khác nhau bao gồm co cơ, dẫn truyền thần kinh, phóng thích hormon

và đông máu Ngoài ra, ion Calci còn đóng vai trò then chốt trong hệ thống truyền tinnội bào và liên quan đến quá trình điều hòa hoạt động của nhiều enzyme khác nhau.Mặc dù có vai trò nội bào rất quan trọng nhưng khoảng 99% lượng Calci của cơthể được dự trữ ở xương ( khoảng 1kg calci) Tại đây Calci liên kết với các ion khác đểtạo nên các dạng tinh thể hydroxyapatite Khoảng 1% Calci của xương có thể trao đổi

tự do với dịch ngoại bào và như vậy lượng Calci này có vai trò đệm, hạn chế nhữngdao động trong cân bằng Calci

Calci sau khi được hấp thụ từ thực phẩm sẽ theo máu đến xương, răng nhưngkhông nằm ỳ thụ động Sau một thời gian, Calci lại được huy động trở lại dòng máutuần hoàn, để nhờ đó xương có cấu trúc luôn luôn đổi mới Nhưng ngược lại, cấu trúccủa xương vì thế mà không có độ bền vững cố định Khuynh hướng huy động Calcithay đổi tùy theo loại xương, nên có loại xương cứng cáp như xương đùi, có xươngbọng hơn như xương bả vai, xương dễ thất thoát calci là xương hàm.

2.6.4 Vai trò Calci trong cơ thể [21, 22]

Calci cần thiết cho cấu trúc của xương, răng, cho đến tiến trình vận động của bắpthịt và quy trình đông máu

Calci giúp làm lành vết thương, điều hòa chức năng của tim, điều hòa trung khugiấc ngủ, đồng thời đảm bảo tình trạng êm dịu thần kinh

Calci góp phần ổn định quân bình kích tố, yểm trợ hoạt động của men và giữ vaitrò quan trọng trong chu trình chuyển hóa chất sắt

Calci là thành phần cần thiết để trấn an não bộ và xoa dịu hệ thần kinh ngoại biên.Cùng với hai khoáng tố natri và kali, Calci chi phối hoạt động dẫn truyền tín hiệu thầnkinh

Calci cũng có khả năng khống chế một số chất béo và cholesterol trong đườngruột – dạ dày

2.7 Vi khuẩn lactic [5]

2.7.1 Phân loại

Theo khóa phân loại Bergey thì vi khuẩn lactic được xếp chung vào họLactobacteriaccae Chúng được chia thành các giống : Streptococcus, Pediococcus,Lactobacillus, Leuconostoc

2.7.2 Đặc điểm

Hình thái : vi khuẩn thường có 2 dạng :

Hình cầu : Diplococcus (2 hình cầu), Tetracoccus (4 hình cầu), Streptococcus( hình cầu chuỗi).

Hình que : hình que đơn và hình que chuỗi

Sinh lý : tất cả Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, không

tạo màng nhầy, kỵ khí bắt buộc, thu nhận năng lượng nhờ thải ra acid lactic và phângiải hydratcacbon Khác với vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn lactic là loại lên men bắtbuộc, không chứa cytochrome và catalase

Chúng có nhu cầu về mặt dinh dưỡng khá phức tạp Ngoài glucose, NH, chúngcòn đòi hỏi hàng loạt vitamin: lactoflavin, thiamin, acid pantothenic, acid nicotinic,acid folic, biotin… và các acid amin Vì thế thường nuôi cấy chúng trên môi trường có

bổ sung cao nấm men, cao thịt, nước chiết cà chua

Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm :

+ Vi khuẩn lactic đồng hình : sản phẩm chính của lên men lactic đồng hình là

Acid béo cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic Phosphate làmuối quan trọng nhất cần cho vi khuẩn lactic Ion ammonium không thể dùng nhưnguồn đạm duy nhất nhưng có vài ảnh hưởng trên biến dưỡng của vài amino acid Sựhiện diện của những chất khoáng không quá thiết yếu và hàm lượng tự nhiên trongnhững môi trường phức tạp hầu hết là đủ

2.7.3 Các con đường lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí với sự tích lũy acid lactic trong môitrường Tùy theo tính chất các sản phẩm sinh ra mà người ta chia làm 2 loại :

+ Lên men lactic đồng hình

Qúa trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic Lượng acid lactic chiếm 98% tổng sản phẩm lên men Có thể có một ít sản phẩm phụ khác như : ethanol, acidacetic, CO2, acetoin

90-Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường phân giải EMP

Vi khuẩn thực hiện kiểu kên men này chủ yếu là 2 giống Lactobacterium vàStreptococcus

Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acidlactic và công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xút sữachua, phomai Chúng đóng vai trò quan trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việctạo hương cho các sản phẩm phomai rắn

+ Lên men lactic dị hình

Sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệkhá cao như sau : acid lactic 40% , acid acetic 10% , các chất khí 20%

Cơ chế chuyển hóa trong lên men dị hình chưa được giải thích đầy đủ Theo giảthiết hiện nay thì các vi khuẩn lactic dị hình thiếu enzym chủ yếu của con đường EMP,

đó là aldolase và triosephosphate isomerase

Giống vi khuẩn chủ yếu lên men lactic dị hình là Leuconostoc và giống phụ làBetabacterium

Lên men lactic dị hình ít có ý nghĩa trong công nghiệp Qúa trình lên men

tạo thành nhiều sản phẩm cuối nên việc tách và cô lập các sản phẩm giống nhaurất tốn kém Tuy nhiên, quá trình lên men này cũng có vai trò rất quan trọng trong việcchế biến một số loại thực phẩm Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho các sảnphẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn

2.7.4 Vài đại diện của vi khuẩn lactic

Giống Streptococcus

Hình cầu hay oval, kích thước từ 0,5-2 µm ( biến đổi theo loài) Hiện diện ở

dạng cầu đôi hoặc chuỗi khi phát triển trên môi trường lỏng, Gram dương, không di

động hoặc hiếm khi di động Không tạo bào tử, không có benzidine, không có catalase,

+ Streptococcus lactis : ưa nhiệt vừa, tế bào hình cầu Khi còn non tạo chuỗi

ngắn, khi về già thường xếp đôi Chúng lên men được glucose, lactose, galactose,maltose, dextrin, không lên men được saccharose Phát triển tốt trong môi trường sữahoặc casein thủy phân, hiện diện hầu hết trong các sản phẩm sữa Độ acid dao động từ

1100T- 1200T, tạo mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm sữa Chúng có khả năng phát triểntốt ở nhiệt độ 30-350C, làm đông tụ sữa từ 10-12 giờ

+ Streptococcus cremosis : Tế bào hình cầu nhỏ hơn Streptococcus lactics, nhưng

hình thành chuỗi dài hơn Có khả năng lên men được glucose, không lên men đượcsaccharose, maltose và dextrin Tạo acid trong môi trường sữa dao động từ 100-1100T.Nhiệt độ thích hợp 25-300C, chúng hiện diện trong kem, bơ, phomai

Giống Lactobacillus

Hình que, thường đơn độc hoặc chuỗi, không di động, không tạo bào tử, Gramdương trở thành Gram âm khi già hay môi trường bị acid hóa, kị khí tùy ý Không cócatalase, không có cytochrome ( do không có porphyrines ) và benzidine Sắc tố hiếmkhi tạo thành nếu có thì là màu vàng, cam hay màu rỉ

Yêu cầu dinh dưỡng phức tạp, tiêu thụ đường cao, một nửa sản phẩm cuối của sựtrao đổi chất từ carbohydrate là lactate Môi trường dinh dưỡng phức tạp, cần phải cóacid amin, peptid, dẫn xuất của acid nucleic, vitamin, acid béo hay ester của acid béo.Biên độ nhiệt độ rộng 5-350C, nhiệt độ thích hợp là 30-420C

pH thích hợp là 5,5-5,8

2.7.5 Ứng dụng

Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai,

Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi.

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate : acidlactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, côngnghiệp thực phẩm

2.8 Acid acetic [3]

Công thức phân tử: CH3COOH

Khối lượng phân tử: M = 60,05

Trong giấm có các loại đường như đường trái cây, đường mạch nha,… là mộttrong những nguồn năng lượng cho hoạt động của cơ thể

Trong giấm có các vitamin B1, B2, vitaminC, có từ trao đổi chất của vi sinh vậttrong quá trình lên men của thức ăn và nguyên liệu Những chất này là thành phần cấuthành chất xúc tác của một số men nào đó trong quá trình trao đổi chất của cơ thể conngười

Công dụng của giấm :

Trung Quốc là nước sử dụng sớm nhất liệu pháp trị bệnh bằng giấm Có rất nhiềuphương thuốc kinh nghiệm dân gian dùng giấm để điều trị các chứng bệnh như quai bị,nấm ngoài da, nấm móng tay (chân),…Sau đây là một số công năng của giấm :

o Làm giảm và loại trừ mệt mỏi: giấm có chứa nhiều acid hữu cơ, có thểthúc tiến quá trình trao đổi đường và loại trừ được sự mệt mỏi nhờ quá trình phân giảicác acid lactic và pyruvic

o Điều tiết độ kiềm acid trong dịch cơ thể, duy trì sự ổn định tương đối củamôi trường trong cơ thể con người: Theo sự phân tích của các nhà dinh dưỡng học,

phản ứng kiềm tính Do cơ thể con người hằng ngày ăn các loại thức ăn có tính acid( thịt, cá , trứng , gạo, …) uống một chút giấm có thể trung hòa phản ứng acid từ đóduy trì cân bằng acid kiềm của môi tường bên trong cơ thể.

o Giúp tiêu hóa, có lợi cho hấp thụ: giấm ăn có thể nâng cao độ chua củadịch vị, chất thơm bay hơi, và amino acid trong giấm có thể kích thích trung ương thầnkinh, thúc đẩy cơ quan tiêu hóa, bài tiết số lượng lớn dịch tiêu hóa, giúp tăng cườngcông năng tiêu hóa của dạ dày Đồng thời, còn có thể khiến cho các loại muối vô cơ( canxi, sắt , phospho trong thức ăn hòa tan càng nhiều, có thể phòng các loại vitamin C

bị phá hủy) Điều đó không những nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà còn cólợi cho tiêu hóa và hấp thụ

o Phòng suy lão: giấm có thể hạn chế và giảm sự hình thành oxy hóa chất

mỡ trong cơ thể, có tác dụng làm chậm sự suy lão

o Phòng cao huyết áp sơ cứng động mạch: giấm có tác dụng hỗ trợ rất tốtđối với việc điều trị bệnh cao huyết áp và sơ vữa động mạch

o Tăng cường công năng bài tiết của thận, đề phòng sự hình thành sỏi trong

cơ thể: dịch nước tiểu thường có tính acid, dễ khiến cho các loại muối trong nước tiểukết thành sỏi Giấm có thể làm cho dịch nước tiểu chuyển thành kiềm tính, do đó giảmđược sự hình thành sỏi

o Phòng trị béo phì : theo nghiên cứu, trong giấm chứa amino acid, ngoàithúc đẩy mỡ quá nhiều trong cơ thể chuyển biến thành năng lượng, còn có thể giúp tiếnhành thuận lợi quá trình trao đổi chất của các chất dinh dưỡng đường và protein trong

cơ thể do đó có tác dụng giảm béo rất tốt

o Bảo vệ làn da, làm đẹp: giấm không những có tác dụng hạn chế thâm đentrên da, giảm được vết đồi mồi tuổi già mà còn tăng tuần hoàn huyết dịch của da, loạitrừ tế bào già chết, thu nhỏ lỗ chân lông, làm cho da trơn bóng

o Làm tỉnh rượu : acid acetic cùng với ethanol phản ứng thành aceticacetate, giảm nhẹ ảnh hưởng độc tính của cồn với thần kinh, từ đó làm tỉnh rượu

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP3.1 Vật liệu

Chủng nấm mốc T harzianium sp do phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực

phẩm, Viện sinh học nhiệt đới cung cấp

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

3.1.4.1 Môi trường PGA(Potato Glucose Agar) là môi trường giữ và nhân