Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS)

Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HẠNH YẾN

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI L-CARNITIN VÀ

ACID ALPHA LIPOIC TRONG THUỐC VIÊN

BẰNG SAC KY LONG KHOI PHO LC-MS

(KHOA LUAN TOT NGHIEP DUGC SY DAI HOC KHOA 2003-2008)

Người hướng din : TS Trần Việt Hùng

Nơi thực hiện : Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Thời gian thực hiện: Từ 12/2007 đến 05/2008

-ĐƠ2 @c#/ Œ

2 hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp này, trước hết em xin bày tỏ

lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Việt Hùng, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian qua

#m xin chân thành cảm ơn PGS.TS Thái Duy Thìn, người đã định hướng

và luôn nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian em học tập tại trường và làm

khoá luận này

#m xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương và toàn thể cán bộ Khoa Vật lý đo lường-Viện Kiểm Nghiệm

Thuốc Trung Ương đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện luận văn

#m cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô và cán bộ Bộ môn Hóa Dược, Bộ môn Hóa phân tích đã dạy dỗ, đìu dắt, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và

nghiên cứu

#m xin cảm ơn DS Lê Phương Chi người đã giúp đỡ em rất nhiệt tình trong thời gian làm khoá luận tốt nghiệp

Cuối cùng em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên và

giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường và hoàn thành tốt nhất khoá luận

`

này

Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2008

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHU VIET TAT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

TT No Brii=-.==>.-=" Ố I

NHÀN T, TỔ NG Ga eieiiaaesaaocleenksauTn 3

1.1 Tổng quan về L-Carnitin và Acid Alpha-lipoic - s 3

ki 1 1 li suugu gái cdvasxeecsseebsvadogebi tu Eeeaesose ri 3

1,1 z2 Acid Alpina Lote iv csssisisssncavssincasnunsnnasensonacagieasarstepnebeps ectsuaseesousavas 7

1.2 Tổng quan vé sdc ky long KhOi PlhO ccccccsccsescesecsesessesessesssacevens 12 1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ .- -. 12 122,2, THIẾT Dị 850 ký lòng Khối phổ osvacoeaeoiuelEiol GA, 13

Ue te) EW SOE Lok oe WS da aeeeeieaae Co ra 7“ 17

PHAN 2 THUC NGHIEM VÀ KẾT QUẢ 18

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu và phương phap thuc nghiém 18

eo Lc PN RUVER VEE HỆU NGHIÊN CỮU 5 sisscvsesocesesaccoscatesnsniees lacheceoveeecevdcncsiosi 18

Be eee k UCTS PRIAD THATCH CUO cán eo eeeeesdEveeee 19

2.2 Két quả thực nghiệm và nhận xét 22

PRA a RIAN Wh SAE tuaccgaoaxxeriiresnaeuznnilS =ecixaeai 22 2.2.2 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với L-Carnitin và Acid Alpha

2.2.3 Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định tính

và định lượng L-Carnitin và Acid Alpha LIpoIc - «5: 25

2.2.4 Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS .- 28

áo Bàn THỆ tán b1 ga tac ko bia kxcessseksiaoessaucoosrE TC eae 35

2.3.1 Về phương pháp phân ch LMS cceeeieooice 35

2.3.2 Kết quả khảo sát một số mẫu thuốc có chứa L-Carnitin, Acid

Alpha Lipoic bằng sắc ký lỏng khối phổ - 2 + 2s szss=xz 39

PHAN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤTT -ccvcccrzrrrrrte 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

Acid Alpha Lipoic Acid Deoxyribo Nucleotid Atomic Mass Unit

(Don vị nguyên tử lượng) Atmospheric pressure chemical iozonization (Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường)

Carnitin acetyltransferase Coenzym A

Chuong trinh sac ky

Dung dich Electrospay ionization

(Kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử)

Flavin Adenin Dinucleotid Flame Ionization Detector (Detector ion hoá ngọn lửa) Gas Chromatography-Mass Spectrometry

(Sắc ký khí ghép khối phổ)

High Density Lipoprotein

(Lipoprotein ti trong cao)

High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu nang cao)

High Performance Liquid Chromatography-

- Coulometric Electrode Array Detector

(Sắc ký lỏng ghép detector đo điện tích mảng điện cực)

Liquid chromatography- Mass spectrometry

(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

Limit of quantitation

(Giới hạn định lượng) Nicotinamid Adenin Dinucleotid Primary Systemic Carnitin Deficiency

(Thiếu hụt Carnitin nguyên phát trong tuần hoàn)

Selected Ion Monitoring

Sac ky dé

Total Ion Chromatogram

(Sắc ký đồ toàn ion)

Thiamin Pyrophosphat United States Pharmacopoeia

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình vận chuyển Acyl CoA qua màng ty thể bởi Carnitin 4

Hình 1.2 Quá trình khử carboxyl oxy hoá œ-cetoglutarat thành Succinyl CoA

VI S0 FAN đi Ga loi Nga eeeeeeieeesireeeaeoll E1 8

Hình 1.3 KY thuat Electrospray Íonization: .- - «5< <ss << zzzse 15

Hình 2.4 Máy sắc ký lỏng kh6i phé (LC-MS) Thermo-Finnigan 18

LCQ PVA ARS MOR a ccss caccvansctaconcassnccsuctsenesweteaniousins +sssýcS5<ES04066603054c9Xi5asisrei 18

Hình 2.5 SKĐ của dung dịch thử L-Carnitin 10 kig/mlH <5 - 26

Hình 2.6 SKĐ của dung dịch Acid Alpha Lipoic 10 kg/m]l 27

Hình 2.7 SKĐ của dung dịch L-Carnitin 10 g/ml va Acid Alpha Lipoic 5

Hình 2.5 Tương quan hồi qui tuyến tính giữa điện tích píc và nồng độ của các

dung dịch chuẩn L-Carnitin (1-20 tug/ml) phân tích theo CTSK 1 30

Hình 2.6 Tương quan hồi qui tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các

dung dich chudn L-Carnitin (1-20 pg/ml) phan tích theo CTSK 3 31

Hinh 2.7 Tuong — hồi quy tuyến tính giữa điện tích píc và nding độ của

các dung dich chuan Acid Alpha Lipoic (1-20 pg/ml) phan tich theo CTSK 2

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của L-Carnitin kiểm tra

sĩ phù hợp của hệ thống thÐo CS c0 0aecsoedcaeiopes 29

Bảng 2.2 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của L-Carnitin kiểm tra

sự phù hợp của hệ thống theo TS 3 - «5< sssssxs.xeseeeeesezezxe 30

Bảng 2.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của Acid Alpha Lipoic

kiểm tra sự phù hợp của hệ thống theo CTSK 2 < -c<c<csces 31

Bảng 2.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp theo CTSK 3 (mẫu

Bảng 2.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp theo CTSK 2 (mẫu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khoa học công nghệ hiện đại đã mang lại cho nên Y học thế giới nhiều

thành tựu, giúp con người chữa trị nhiều căn bệnh nguy hiểm đe doạ sức khoẻ

và cuộc sống của họ Cuộc sống càng phát triển, nhu cầu của con người ngày

càng lớn, cơ thể con người càng cần nhiều năng lượng để tiêu tốn cho những

hoạt động lao động trí óc, lao động chân tay, hoạt động thể dục thể thao Một

trong các nguồn năng lượng sống này được lấy từ sự thoái hoá acid béo trong

cơ thể Khi các hormon báo hiệu cần năng lượng cho cơ thể, triglycerid dự trữ

ở các tổ chức mỡ được thoái hoá và vận chuyển tới các tổ chức (cơ, xương,

tim, thận ), ở đó các acid béo có thể được oxy hoá tạo năng lượng

Tuy nhiên, chính môi trường sống hiện đại và chế độ sinh hoạt bất hợp

lý cũng là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh cho con người Các gốc tự do

sinh ra trong quá trình sản xuất năng lượng của tế bào, nhưng cũng có thể là

sản phẩm tạo ra từ sự ô nhiễm môi trường, dùng rượu bia, hút thuốc lá, dùng

thuốc, tiếp xúc với tia cực tím, thậm chí do cả những chấn thương tâm lý

Theo nghiên cứu, mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta phải hứng chịu khoảng

10.000 gốc tự do tấn công mỗi ngày Rất nhiều trong số đó nhằm vào ADN và

các chất liệu di truyền Thêm vào đó, màng tế bào, protein và mỡ cũng bị tấn

công Trải qua 70 năm cuộc đời, cơ thể hình thành ước chừng đến 17 tấn gốc

tự do Đây chính là thủ phạm làm sai lệch cấu trúc và rối loạn thông tin trên

những phân tử sinh học, vật chất di truyền và tế bào Từ đây là nguyên nhân

của các quá trình bệnh lý, ung thư, lão hoá, và cái chết theo chương trình

Vì mục tiêu sức khoẻ con người, các nhà khoa học đã không ngừng

nghiên cứu và tìm ra những hợp chất có vai trò quan trọng trong sản sinh năng

lượng sống, trung hoà và loại bỏ các gốc tự do, giúp con người chống lại quá

trình lão hoá, bệnh lý, chống lại mệt mỏi và tăng cường thể lực L-Carnitin và

Acid Alpha Lipoic là những hợp chất như vậy L-Carnitin đóng vai trò trong

chuyển hoá chất béo bằng cách giúp oxy hoá acid béo trong tế bào để tạo ra

năng lượng Acid Alpha Lipoic là chất chống oxy hoá, ngăn ngừa sự tổn hại tế

bào gây ra bởi các gốc tự do, chống viêm, chống khối u, chống lão hoá

Trên thị trường dược phẩm hiện nay đã bắt đầu xuất hiện nhiều sản

phẩm chứa L-Carnitin hoặc Acid Alpha Lipoic hoặc đồng thời cả hai thành

phần này như: VIMESOL”, METABOSOL (Invenmed Group); CARNITIN

TA” (Công ty Thiên Niên Kiện); TOPLIFE FAT REMOVE” (Công ty Dược

phẩm OPV) Các chế phẩm này có thành phần hết sức phức tạp Để định tính

và định lượng riêng từng hoạt chất, một số phương pháp đã được đề nghị Tuy

nhiên trên thực tế chưa có một phương pháp thực sự tối ưu để định lượng đồng

thời hai chất này Trong khi đó, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một phương

pháp có độ nhạy, độ chính xác cao, đã được khảo sát phân tích riêng từng

thành phần

Xuất phát từ những lý do trên, nhằm góp phần đảm bảo chất lượng

thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Định lượng đồng thời L-Carnitin và Acid

Alpha Lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS" với ba mục

tiêu chính:

@ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời L-Carnitin và Acid Alpha

Lipoic bằng sắc ký lỏng khối phé LC-MS

© Đánh giá phương pháp đã xây dựng

© Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số chế phẩm

chứa I hoặc 2 thành phần L-Carnitin, Acid Alpha Lipoic

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ L-CARNITIN VÀ ACID ALPHA-LIPOIC

1.1.1 L-Carnitin

a Dac điểm hoá lý [24], [26], [27] [30]

Tên hoá học: (R) - (3 - carboxy - 2 - hydroxy - N,N,N - trimethyl)- 1-

Độ tan: Tan hoàn toàn trong nước, tan trong cồn nóng

Không tan trong Aceton, Ether ethylic, Benzen

Dung dịch 5% trong nước có pH 5,5 - 9,5

b Vai tro va tac dung cua L-Carnitin [3], [16], [25], [30]

Carnitin được phát hiện ra vào năm 1905, từ đó đến nay, các nhà khoa học đã không ngừng có những nghiên cứu về nó Ngày càng nhiều những tác

dụng và vai trò của nó đối với sức khoẻ con người đã được chứng minh Một

số tác dụng kinh điển của L-Carnitin đã được biết đến là:

- Carnitin tham gia vào quá trình chuyển hoá của các acid béo:

+ Các acid béo chuỗi dài thoái hoá theo con đường j-oxy hoá Quá trình B-oxy hoá xẩy ra trong ty thể vì các enzym cần thiết cho sự P-oxy hoá

tập trung ở Matrix của ty thể, trái lại acyl CoA lại có nhiều ở tế bào chất.Các

acyl CoA lại không vượt qua được màng ty thể, như vậy sẽ có sự trở ngại cho

sự -oxy hoá Vấn đề được sáng tỏ khi ta biết sự B-oxy hoá acid béo được kích thích bởi Carnitin thông qua phản ứng ester hoá:

CH; Acyl carnitintransferase CH;

CH;—N—CH,—CH —COOH + RCOSCoA CH;—N—CH;-CH—CH;-COOH _+ CoASH

Carnitin Acyl carnitin

Chiéu | xay ra 6 mat ngoai cla mang trong ty thé tức khu vực giữa hai màng của ty thể

Chiều 2 xảy ra ở mặt trong của màng trong ty thể (tức trong Matrix) Acyl CoA chuỗi đài không qua được màng trong ty thể, trong khi đó

Acyl Carnitin có thể qua được dễ dàng Sau khi vào trong ty thể, Acyl Carnitin

giải phóng Carnitin và Acyl CoA Acyl CoA lúc này mới bắt đầu quá trình

B-oxy hoá

MATRIX

oO CPTI (Carnitine Palmitoy!Transferase 1) D> Translocase

© CPTI (Carnitine Palmitoy!Transferase II)

Lipid Mang ty thể khong cho Acetyl - CoA đi qua, do đó nó cần có trung

gian vận chuyển là Carnitin thông qua phản ứng:

Carnitin acety]

W transferase

AcetylCoA + Carnitin ——» Acetyl carnitin + CoASH

- Bổ sung L-Carnitin có thể giúp bảo vệ hoạt động của tim và những

chức năng có lợi cho tim L-Carnitin làm giảm tỷ lệ Triglycerid và nâng cao tỷ

lệ HDL - Cholesterol, khi lượng HDL - Cholesterol càng cao thì nguy cơ bị xơ vữa động mạch càng thấp

- Theo nhiều nghiên cứu đã được tiến hành, L-Carnitin có tác dụng làm tăng độ đáp ứng với Insulin ở những bệnh nhân đái tháo đường đã kháng Insulin, do đó cải thiện được tình trạng Glucose trong máu cao ở những bệnh

nhân đái tháo đường typ II

- L-Carnitin cũng được dùng trong những trường hợp thiếu hụt Carnitin

nguyên phát trong tuần hoàn (primary systemic Carnitin deficiency - SCD)

hoặc thiếu hụt Carnitin thứ phát

Chế phẩm VIMESOL? (Do Invenmed Group sản xuất theo bản quyền

Fuma Natural Co., USA; Garden Grove CA 92841 Số chứng nhận: 45139)

Có chứa các thành phần L-Carnitin fumarat, Acid Alpha Lipoic , Nicotinamid,

Đông trùng hạ thảo Sự kết hợp các thành phần trong VIMESOL bổ trợ cho nhau, giúp kích thích các cơ chế tự nhiên để ổn định quá trình chuyển hoá của

cơ thể và hạn chế tối đa tác dụng phụ

c Phương pháp phân tích L-Carnitin [1], [5], [14], [18], [20], [21], [27]

- Phương pháp phân tích acid amin: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

sử dụng kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột (Thiết bị AMINOQUANT)

Nguyên tắc: Dẫn xuất hoá L-Carnitin bằng thuốc thử FMOC (9

fluorenyl methyl chlorofomate) Sau đó được cho qua cột sắc ký, L-Carnitin sẽ được rửa giải và đi ra khỏi cột, được phát hiện bởi detector Tín hiệu này được

chuyển tới máy ghi, ta có được sắc ký đồ Dựa vào độ lớn của pic (chiéu cao

hay diện tích pic), ta xác định được nồng độ của L-Carnitin trong mẫu thử

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sử dụng detector huỳnh quang

Phương pháp này thường được áp dụng để định lượng Camitin trong

dịch sinh học (huyết tương hoặc nước tiểu) Dùng thuốc thử tạo huỳnh quang

để tạo dẫn chất hoá trước cột với Carnitin, thuốc thử được sử dụng ở đây có

thể là 6°-methoxynaphthacyl trifuoromethansulfonat hoặc 2°-phenanthrenacy]

trifuoromethansulfonat (triflat) Điều kiện sắc ký như sau:

+ Cot: c6t nh6m (Merk Aluspher 250-4, 5um, Darmstadt)

+ Pha động: Phân tích Carniin trong huyết tương: 1,5 mmol/L

trietylamin, 4,0 mmol/L acid succinic và 39,0 ml/L nước cất, bổ sung acetomtril vừa đủ I1 lít Phân tích Carnitin trong nước tiểu, lượng nước giảm

xuống còn 34,0 ml/L

+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút

+ Thời gian phân tích: 45 phút

+ Thể tích tiêm mẫu: 50 pL

+ Nhiệt độ cột: 40°C

+ Detector huynh quang RFIOAXL:

Néu ding thudéc thir 6’- methoxynaphthacyl trifuoromethansulfonat:

bước sóng kích thích là 247 nm, bước sóng phát xạ là 431 nm

Nếu dùng thuốc thử 2 -phenanthrenacyl triflat: bước sóng kích thích là

260 nm, bước sóng phát xạ là 433 nm

Ưu điểm của phương pháp là độ tin cậy và độ lặp lại tốt; giới hạn phát

| hiện Carnitin trong huyết tương là 30 + 130 tưmol/L, trong nước tiểu là

80 + 180 pmol/L, thé tích mẫu cần lấy nhỏ (15 4Ì), rất thích hợp phân tích

Carnitin trong huyết tương trẻ sơ sinh; sử dụng detector huỳnh quang cho độ nhạy cao

- Phương pháp đo quang phổ, sử dụng phản ứng xúc tác enzym

Nguyên tắc: Carnitin phản ứng với Acetyl CoA, xúc tác bởi Carnitin

acetyltransferase, tao ra CoA tu do

L-Carnitin + Acetyl-CoA —“*, Acetylcarnitin + CoA

CoA chứa hai nhóm thiol, phản ứng với 5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic

acid) (DTNB) tạo ra ion thiophenolat, tương ứng với tỷ lệ Carnitin Định lượng

bằng đo quang phổ tại bước sóng 412 nm

- Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Đây là phương pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp này

có tính đặc hiệu và độ nhạy cao, định lượng L-Carnitin trong thuốc, dich sinh

học (máu, huyết tương, nước tiểu)

1.1.2 Acid Alpha Lipoic

a Đặc điểm hoá lý [24], [26], [27], [31]

Tên hoá hoc: 5 - (1,2 - dithiolan - 3 - yl) valeric acid

Tên khác: Acid thioctic

m= ; Ì

FADH;

NAp*+ NADH+ H*

Hình 1.2 Qua trinh khit carboxyl oxy hoa a-cetoglutarat thanh Succinyl CoA véi su

tham gia của Acid lipoic

- Bên cạnh đó, Acid Alpha Lipoic còn được biết đến với vai trò là một

chất chống oxy hoá mạnh tổng hợp Acid Alpha Lipoic tác dụng qua 4 khả

năng sau [9], [10], [11], [13]:

I- Gắn và gdp cdc kim loại nặng Hơn nữa, Acid Alpha Lipoic có khả

năng xâm nhập qua hàng rào máu não và qua màng tế bao dé dang Do đó, nó

có thể được sử dụng trong những trường hợp nhiễm độc các kim loại nặng như

thuỷ ngân

2- Chọn lựa các gốc tự do Gốc tự do là sản phẩm của quá trình biến dưỡng trong cơ thể nhưng cũng có thể là sản phẩm tạo ra từ sự ô nhiễm môi

trường, hút thuốc lá, dùng rượu bia, dùng thuốc , thậm chí cả do chấn thương

tâm lý Hậu quả của các gốc tự do đó chính là hàng loạt những căn bệnh nguy

hiểm như ung thư, xơ vữa mạch, các biến chứng về mắt, sự lão hoá Do khả

năng trung hoà các gốc tự do, các chất chống oxy hoá (Vitamin C, Vitamin E,

Ubiquinone, Glutathion, Acid Alpha Lipoic ) da duoc khuyén ding trong

những trường hợp này Ta có thé dễ dàng nhận thấy được tính ưu việt của

AAL, so với những chất chống oxy hoá khác, đó là khả năng trung hoà các gốc

tự do trong nước và trong cả chất béo

3- Tái tạo các chất chống oxy hoá nội sinh.Cơ thể chúng ta luôn có

những cơ chế bảo vệ để hạn chế tác hại của các gốc tự do, đó là quá trình

chống oxy hoá, thông qua các chất chống oxy hoá Hệ thống bảo vệ chống gốc tự do trong cơ thể gồm 3 hệ chất: | |

* Các enzym nội bao nhu Mn SOD, CuZn SOD, glutathion peroxydase

* Các chất phi enzym phân tử nhỏ (bây gốc tự do): vitamin E, vitamin

C, Coenzym Q10

* Các phối tử tạo phức khoá các ion kim loại như: Transferin,

Lactoferin, Feritin

AAL trực tiếp tăng cường tái tạo Vitamin C, Glutathion, Coenzym Q10 và gián tiếp phục hồi Vitamin E Chính khả năng này đã góp phần tăng cường hệ

thống bảo vệ chống gốc tự do của cơ thể

4- Khả năng sửa chữa những tổn hại tế bào do gốc tự do gây ra Do

nguyên nhân của những tổn hại này là khi các oxy phản ứng lấy đi một điện tử

và phá huỷ mô, tổ chức sống, các chuỗi ADN, các thành phần khung của tế bào, Protein và màng tế bào đều bị ảnh hưởng

- Acid Alpha Lipoic còn có tác dụng tăng cường sự hấp thu glucose 6

cơ và tăng sự nhạy cảm của cơ thể đối với Insulin, cải thiện các triệu chứng thoái hoá thần kinh gây ra do đái tháo đường

Chế phẩm METABOSOL”” (Do Invenmed Group sản xuất theo bản

quyền Euma Natural Co., USA; Garden Grove CA 92841 Số chứng nhận:

45139) là sự kết hợp của Acid Alpha Lipoic va cac loai thao dược như Kỳ tử, Sơn thù, Hoài sơn, Nhàu Bên cạnh tác dụng của Acid Alpha Lipoic, cdc

nghiên cứu y học hiện đại cũng đã chứng minh tác dụng và lợi ích của các

thảo được phối hợp vừa nêu

b Các phương pháp phân tích Acid Alpha Lipoic [12], [19], [22], [27]

- Sử dụng sắc ký khí:

Phân tích Acid Alpha Lipoic sử dụng sắc ký khí với detector ion hoá ngọn lửa (FID - Flame lonization Detector) Khí mang từ cột cùng với không khí và Hydro đã được đốt cháy ở đầu đốt kim loại, Acid Alpha Lipoic cố trong

khí mang được đốt cháy Quá trình oxy hoá trong ngọn lửa phát ra electron cùng với ion Sản phẩm đốt electron và ion làm tăng độ dẫn điện của ngọn lửa

Các electron và ion này được tập hợp ở điện cực góp, cho nên dòng điện tạo ra

tỷ lệ thuận với nồng độ ion có mặt trong khí mang đến ngọn lửa Detector có khoảng tuyến tính rộng, rất nhạy và đáp ứng với hầu hết các chất hữu cơ

Sắc ký khí kết hợp detector khối phổ (GC-MS) cũng là một phương

pháp được sử dụng

10

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC:

Theo SP 30, phương pháp định lượng Acid Alpha Lipoic trong thuốc

viên là sử dụng sắc ký hiệu năng cao pha đảo với detector UV ở 220 nm Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là có độ đặc hiệu và độ nhạy thấp

Trong phân tích Acid Alpha Lipoic sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao,

có nhiều loại detector khác cũng đã được sử dụng như: detector huỳnh quang, đetector điện hoá:

+ Trong sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang, ta đùng một thuốc thử tạo huỳnh quang để làm dẫn chất hoá của AAL Phương pháp này rất thích

hợp để phân tích AAL trong huyết tương và nước tiểu Tuy nhiên nhược điểm

của phương pháp là xử lý mẫu rất phức tạp + Sắc ký lỏng sử dụng đetector điện hoá được coi là phương pháp khá

nhạy để phân tích AAL Có thể dùng detector đo độ dẫn (Conductivity

detector) hoac detector do dong (Amperometric detector) VGi detector do độ

dẫn, ta sử dụng điện cực kép Hg-Au để phân tích, giới hạn phát hiện có thể lên

đến nồng độ nanoMol Nhưng khi số lần tiêm là 30-50 lần thì độ nhạy của

phương pháp bị mất đi

- Phương pháp HPLC-CEAD:

Sử dụng sắc ký lỏng kết hợp với detector đo điện tích của mảng các

điện cực (CEAD - coulometric electrode array detector) Cột sắc ký sử dụng là cột ACE 3-C-I§ (150 mm x 3,0 mm, kích thước hạt 3um); pha động

Acetonitril/Methanol/Kali dihdro photphat 50mM pH 3 - 350/65/585, v/VW;

tốc độ dòng 0,45 ml/phút; điện cực palađi, điện thế của điện cực được đặt ở +300, +400, +450, +500, +550, +600, +650 va +700 mV

- Phuong pháp sắc ký lỏng khối phổ HPLC - MS

Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phân tích Acid

Alpha Lipoic Hiện nay trên thế giới, phương pháp này đang ngày càng được

11

áp dụng rộng rãi để phân tích Acid Alpha Lipoic có trong nhiều sản phẩm như: các thuốc, dịch sinh học, thực phẩm chức năng

1.2 TONG QUAN VE SAC KY LONG KHOI PHO [2], [4], [7] [8], [15],

[23].{28] [29]

1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [7], [23]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kỹ thuật phân tích khối phổ (MS)

là hai kỹ thuật phân tích đã ra đời khá lâu Tuy nhiên, không phải ngay từ đầu,

các nhà phân tích đã nhận ra được hiệu quả to lớn của việc kết hợp HPLC-MS

Nguyên nhân chủ yếu của sự chậm trê này là vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân không cao (hệ thống phân tích khối

phổ) Vì vậy, mặc dù kỹ thuật sắc ký lỏng ra đời trước sắc ký khí nhưng kỹ -_ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được thực hiện trước kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

Sau quá trình thử nghiệm dài, mãi đến năm 1970, việc kết nối này mới thành công

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector khối phổ (MS)

Trong kỹ thuật LC-MS, hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được

tách qua cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ

Trong phân tích được phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp LC-

MS cho:

- Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi

- Phân tích thuốc trong dịch sinh hoc

- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc

- Trường hợp không sử dụng được các detector khác: Không phát

hiện được bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng định Chính vì vậy, phân tích khối phổ ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ Đặc biệt, nét nổi bật của phân tích

12

khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy, độ đặc hiệu cao Giới hạn phát hiện có thể đến 10” gam Do vậy thường dùng kỹ thuật này để phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp

1.2.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ [2], [4], [7], [8], [23] [28], [29]

a Pha động

Pha động trong sắc ký lỏng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách

Pha động thường là hai dung môi (hữu cơ hoặc dung dịch nước) hoà tan vào

nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

Có hai cách dùng pha động để rửa giải:

* Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký

* Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 đến 4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong

quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi)

b Hệ thống bơm

Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung

môi qua hệ thống sắc ký Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

* Phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng qua cột tách, dòng không liên tục sẽ gây nhiêu đường nền

* Không có xung ở áp suất cao

* Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn

mon)

c Cột tách và pha tĩnh

Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tỉnh hoặc chất

dẻo có chiều đài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm Kích thước của hạt

13

nhồi trong cột thường là 5-10 tưn Các chất nhồi thường được sử dụng là Silica gel, nhôm oxyd, polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C§, C18

Cột tách sắc ký lỏng yêu câu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên

bề mặt và có thể chịu được áp suất cao

đ Hệ tiêm mâu

Mẫu lỏng hoặc dung địch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở

đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mâu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50 + 20 4L

e Detector khối phổ [7], [23] [29]

Một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC là detector Việc

chọn đetector để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hoá của chất cần phân tích

Việc sử dụng khối phổ kế làm detector cho sắc ký đem lại một số ưu điểm

sau:

® Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về cấu tạo hoá học của chất

phân tích

¢ Có tính chọn lọc, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích

$ Có độ nhạy cao (phân tích được hàm lượng siêu vết trong mẫu thành

phần phức tạp) vì dòng khối phổ nhạy

® Nguyên tắc hoạt động

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion

(m/2) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng

nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra

trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10? Pa đến 10 Pa

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có

cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó

14

cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác

định cấu trúc và định lượng các chất

#& Nhiệm vụ của detector khối phổ

- Trong phân tích định tính: Khi ghép với thiết bị sắc ký lỏng, chất phân

tích được xác nhận bằng:

+ Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định t„ đặc trưng cho chất phân tích

+ Phổ khối tương ứng của hoá chất phân tích hoặc phổ khối biểu diễn

cường độ các 1on sinh ra từ một ion xác định của chất phân tích

Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ chắc chắn hơn là chỉ dựa vào thời gian lưu

- Trong phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu, giúp cho

định lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao

% Các bộ phận của detector khối phổ [2] [7],[23] [28], [29]

-Bộ nạp mâu: Đưa mẫu vào máy Trong máy sắc ký lỏng khối phổ, bộ nạp mẫu là đầu ra của máy sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ

- Bộ phận ion hoá + Nhiệm vụ:

® lon hoá chất cần phân tích

¢ Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hơi

® Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối

$ Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân

không sâu

® Rút ra ngoài các phân tử trung hoà và ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo

+ Kỹ thuật ion hoá: Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật: phun điện tử

(ESD va ion hoa bang hod học ở áp suất thường (APC])

15

Kỹ thuật sử dụng trong khoá luận này là kỹ thuật ESI, kỹ thuật được sử

dụng phổ biến nhất trong LC-MS Kỹ thuật này được mô tả như sau:

Evaporation *Rayteigh Coulomb Evaporation * Analyte lon

Lirmet Exptosion

a 99 tree Gan =< ~> —_™~ “ON sa e> 4 <> ~® 8 a»

Cứ

See" a Gre 37" 2 7 @ mà

Hình 1.3 Kỹ thuật Electrospray Ionization

Các phân tử hoá chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống

mao quản bằng kim loại cao thế 3-5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo ion

dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tuỳ chất khảo

sát) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao

quản Dưới tác dụng của điện thế cao và luồng khí phun nitơ, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện thoát ra từ đầu ống mao quản

Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích

có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ vỡ dần

thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó, các ion dương hoặc âm tạo thành

được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài

- Bộ phận phân tích khối

Bộ phân tích khối được coi là quả tìm của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách

các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phân riêng biệt Các ion được gia

tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector

- Bộ phận phát hiện ion

16

Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử

của máy khối phổ

1.2.3 Một số kỹ thuat LC-MS [7]

a Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)

Với một hỗn hợp nhiều chất, sau khi được tách ra qua cột sắc ký lỏng

và đưa vào detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ môi chất Ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram)

và phổ khối được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN)

FULL SCAN cho day đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương

pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

b Xỹ thuật phân tích chon loc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo

thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu S/nhiễu đường nền N

Ky thuat SIM nhay hon FULL SCAN

c Kỹ thuật MS/MS

Đối với kỹ thuật MS/MS, một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân

tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2

Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm

giảm nhiễu đường nền rất đáng kể

17

- Chất chuẩn L-Carnitin fumarat đối chiếu hoá học (Chất chuẩn làm việc của

khoa Vật lý Đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc T.Ư.)

- Chất chuẩn Acid Alpha Lipoic đối chiếu hoá học (Chất chuẩn làm việc của

khoa Vật lý Đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc T.Ư.) -Dung môi tinh khiết dùng cho sac ky: Methanol, Nước, Acid acetic

- Cột sắc ký Beta Basic C18 (5cm x 2,1mm, 5pm)

- Máy lắc siêu âm Branson 5200

- Cân phân tích Mettler AB204 (Thụy Sỹ)

- Bình nón, bình định mức, pipet và các dụng cụ thuỷ tinh khác

c Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là Acid Alpha Lipoic và L-Carnitin trong thuốc viên

Để tiến hành, chúng tôi sử dụng một số chế phẩm sau:

s® Viên nang VIMESOL do Invenmed Group cung cấp

Công thức viên nang: L-Carnitin fumarat 200mg, Acid Alpha Lipoic 100ng,

Nicotinamid 50mg, Đông trùng hạ thảo, Tá dược v.d — l nang

s Viên nang METABOSOL do Invenmed Group cung cấp Công thức viên nang: Acid Alpha Lipoic 100mg, Ky tử, Nhàu, Hoài Sơn, Quế

Chi, Son Thu, Cát Căn, Hoàng Bá, Tá được v.ả — Ì nang

e Vién nang CARNITIN TA L-Carnitin fumarat 350 mg của công ty TNHH

Thién Nién Kién

e Viên nang TOPLIFE FAT REMOVE của công ty Dược phẩm OPV

Công thiic vién nang: L-Carnitin tatrat 60mg, DL-Methionin 50mg,

Ta duoc v.d Tnang

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

a Chuẩn bị mẫu

- Bao gồm mẫu chuẩn và mẫu thử

b Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với L-Carnitin và Acid Alpha Lipoic

Sử dụng phương pháp điều chỉnh tự động (Autotune) của máy LC-MS

c Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phé (LC-MS) dé dinh tính và

dinh luong L-Carnitin va Acid Alpha Lipoic

Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký như cột, pha động, tốc độ dòng, điều kiện

khối phổ cho các chương trình sắc ký sau:

19

- Chương trình sắc ký LC- MS định tính và định lượng L-Carnitin

- Chương trình sắc ký LC- MS định tính và định lượng Acid Alpha Lipoic

- Chương trình sắc ký LC- MS định tính và định lượng đồng thời L-Carnitin và

Acid Alpha Lipoic

d Đánh giá phương pháp

- Độ tuyến tính:

Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích pic và nồng

độ chất phân tích Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui

(y=ax+b) và hệ số tương quan r

- Giới hạn phát hién LOD va giới hạn định lượng LOO

Giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi chất được xác định bằng 3 lần tỈ số

giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó Độ nhạy được xác định bằng hệ số góc của đường hồi qui giữa tín hiệu (Y, mV) và nồng độ (X, Hg/mL hoặc ug/8)

Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện

Ngoài ra, giới hạn định lượng còn được xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỉ số S/N = 10

20

e Phương pháp xử lý số liệu Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào

các hàm số trong Microsoft Excel

Tiến hành thí nghiệm n lần, thu được các kết quả x, là Xị, X;, Xạ X,

Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = xx100

Tương quan hồi qui tuyến tính:

- Phương trình hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:

Y=ax+b Trong đó:

+ Hệ số góc (a) được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel

+ Hệ số chắn (b) được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

2.2.1 Chuẩn bị mẫu

- Mẫu chuẩn:

+ Dung dich chuén L-Carnitin 10 pg/ml trong Methanol (Pha dong 1) và trong

Methanol: 0,1% acid acetic trong nudéc (1:1) (Pha động 2) dùng để khảo sát

phổ khối của L-Carnitin

+ Dung dịch chuẩn Acid Alpha Lipoic 10 pg/ml trong pha dong 2 để khảo sát phổ khối của Acid Alpha Lipoic

+ Day cdc dung dịch chuẩn L-Carnitin có nồng độ: 1 ug/ml, 2 tg/ml, 5tg/ml,

10 ug/ml và 20 pg/ml trong pha động 1 và pha động 2 để khảo sát độ lặp lại

và độ tuyến tính đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ

+ Day cdc dung dich chudn Acid Alpha Lipoic c6 néng dé: 1 pg/ml, 2 pg/ml,

5 g/ml, 10 g/ml va 20 g/ml trong pha dong 2 để khảo sát độ lặp lại và sự phù hợp của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ

- Mâu thử:

Lấy 20 viên nang, cân chính xác và tính khối lượng trung bình thuốc trong nang, trộn đều, nghiền mịn và làm đồng nhất bột thuốc trong nang Cân chính

xác một lượng bột thuốc để pha được dung dịch có nồng độ khoảng: L-

Carnitin: 10 kg/ml; Acid Alpha Lipoic: 5 ng/ml Tiến hành lọc qua giấy lọc

thường, sau đó lọc qua mang 0,45 um Với các lưu ý cụ thể sau:

** Với những mẫu thử chỉ chứa L-Carnitin: Tiến hành pha mẫu

2.2.2 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với L-Carnitin và Acid Alpha Lipoic

Để xác định điều kiện khối phổ, trước tiên chúng tôi pha dung dịch

chuẩn của từng chất trong pha động, sau đó bơm trực tiếp bằng syringe và

chạy chương trình Tune để điều chỉnh các thông số khối phổ

a Tối ưu hoá điều kiện bắt ion phân tích đối với L-Carnitin, mảnh m/z 162

- Với pha động 1

+ Pha dung dich L-Carnitin 10 pg/ml trong pha dong 1 bơm trực tiếp vào máy

khối phổ qua syringe chudn (Unimetrics 500 pL) véi tc d6 SpL/phut

+ Gọi phương pháp Tưne Plus để xác định điều kiện khối phổ:

Bước I1: Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm và gọi phương pháp bằng cách: trên cửa sổ Ïwsfrumment Sefup, chọn biểu tượng máy khối phổ LCQ Advantage Max MS sẽ xuất hiện hình máy khối phổ

Bước 2: Nhắp chuột vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI)

Bước 3: Bơm L-Carnitin vào hệ thống khối phổ với tốc độ dòng

5 uL/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 162 (Hình PLI -

Phụ lục 1)

Bước 4: Nhấp vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ

chạy chế độ Automatic Tune (Hình PL3 - Phụ lục 1)

Bước 5: Trong ô Mass (m/2), đánh số 162 dé Tune cho mảnh 162, máy

sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hoá các thông số sao cho bắt ion m/z = 162 tốt

và nhạy nhất Quá trình này mất khoảng 5 phút Sau khi máy đã tự động điều chỉnh, sẽ quan sát thấy tín hiệu của ion m/z 162 lớn hơn ban đầu Lưu file

Tune lai dat tên là L-Carniin-I LCQTune

23

- Với pha động 2

+ Pha dung dich L-Carnitin 10 pg/ml trong pha động 2 bơm trực tiếp vào máy

khối phổ qua syringe chuẩn (Unimetrics 500 HL,) với tốc độ 5ItL/phút

+ Quá trình xác định điều kiện khối phổ cho L-Carnitin trong pha động 2 cũng tương tự như với pha động 1 Luu lai file Tune, dat tén 1A L-Carnitin-2 LCQTune

b Tối ưu hoá điều kiện bắt ion phản tích đối với Acid Alpha Lipoic, mảnh

m/z 205

- Pha dung dich Acid Alpha Lipoic 10 g/ml trong pha dong 2 bơm trực tiếp

vào máy khối phổ qua Syringe chuẩn (Unimetrics 500 HL) với tốc độ 5

uL/phút

- Gọi phương pháp Tưne Plus để xác định điều kiện khối phổ:

Bước 1: Khởi động phần mềm và gọi phương pháp: tương tự như với L-

Carnitin Bước 2: Nhắp chuột vào Tune Plus xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Negative ESI (-ESI)

Bước 3: Bơm Acid Alpha Lipoic vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5

uL/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 205

Bước 4: Nhấp chuột vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune

Bước 5: Trong ô Mass (m/z), đánh số 205 để Tune cho mảnh 205, máy

sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hoá các thông số sao cho bắt ion m/z = 205 tốt

và nhạy nhất Sau khi máy đã tự động điều chỉnh, sẽ quan sát thấy tín hiệu của ion m/z 205 lớn hơn ban đầu Lưu file Tune đặt tên Acid Alpha Lipoic