Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư

Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Ứng dụng một số kỹ thuật hiện đại trong tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư

TRUONG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THI HAI

UNG DUNG MOT SO KY THUAT HIEN DAI TRONG TONG HOP ALTRETAMIN LAM

THUOC DIEU TRI UNG THU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2012

TRUONG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ HẢI

UNG DUNG MOT SO KY THUAT HIEN DAI

TRONG TONG HOP ALTRETAMIN LAM

THUOC DIEU TRI UNG THU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYEN NGANH : CNDP VA BAO CHE

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỉnh Thị Thanh Hải

HA NOI - 2012

Loi cam on

Quá trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Dược Hà Nội trong

thời gian vừa qua, bằng những nỗ lực của cá nhân và sự giúp đỡ tận tình của

các thay cô, bản than tôi đã đạt được kết quả nhất định

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường, Bộ món Hóa

hữu cơ, phòng Sau Đại Học và các bộ môn, phòng ban hiên quan của nhà

trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho thành công này

Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỉnh Thị Thanh Hải,

người thấy đã trực tiếp hướng dẫn, quan tâm, giúp đỗ trực tiếp tôi nghiên cứu

và hoàn thiên luận vấn

Trong quá trình thực hiện luận vấn tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường, tôi xin chân thành cảm ơn Thể

Đào Thị Nhung khoa hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc

gia Hà Nội, ThS Phan Thị Tuyết Mai bộ môn Hóa vật liệu - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, The Đặng Vĩ Lương phòng NMR - Viện Hóa học — Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia ThS Tran Ti hj Bich Vân phòng Hóa lý, Viên Kiểm nghiệm thuốc Trung ương — BO Y té

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Giám hiệu Trường Cao đẳng Y tế Ninh

Bình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia và hoàn thành khóa học

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đông đánh giá Luận văn Thạc sĩ cấp Quốc gia đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện Luận văn đạt chất lượng tốt nhất

Tôi xin bày tỏ long biết ơn tới những người than trong gia đình, cùng bạn bè và các đẳng nghiệp đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình

hoc tap

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày02 thang 11 nam 2012

Tac gia Dinh Thi Hai

1.1.1 Tác dụng điều trị ung thư

1.1.2 Chỉ định, dạng bào chế, liều dùng của altretamin

1.2 Các phương pháp tông hợp altretamin

1.2.1 Phương pháp tổng hợp altretamin của Donald W.Kaiser

1.2.2 Phương pháp tổng hop altretamin cua Kapil Arya va

Anshu Dania bang ky thuat vi song str dung xuc tac

1.4 Tổng quan về ỗn định của thuốc

1.4.1 Các kiểu phân hủy nguyên liệu và một số biện pháp khắc

Nguyên liệu nghiên cứu

Thiết bị nghiên cứu

Phương pháp thực nghiệm

Tổng hợp hóa học

Kiểm nghiệm altretamin theo Dược điển Mỹ USP 30

Nghiên cúu độ ổn định của altretamin tổng hợp được

Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU

Kết quả tổng hợp altretamin theo phương pháp của Kapil

Arya và Anshu Dandia sử dụng xúc tác zeolit và kỹ thuật

V1 sóng

Kêt quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đên hiệu suât

của phản ứng tông hợp altretamin

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiếu vi sóng

đên hiệu suât của phản ứng tông hợp altretamin

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mol các chất tham

gia phản ứng đên hiệu suât của phản ứng tông hợp

altretamin

Kêt quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác zeolit đên hiệu

suât phản ứng tông hợp altetamin

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tinh chế đến

hiệu suât của phản ứng tông hợp altretamin

Quy trình tổng hợp altretamin sử dụng kỹ thuật vi sóng

và xúc tác HY zeolit

Kết quả tổng hợp altretamin theo phương pháp của Kapil

Arya và Anshu Dandia sử dụng xúc tác zeolit và kỹ thuật

3.1.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tác động của

sóng siêu âm đên hiệu suat cua phan ứng tông hợp

3.1.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác zeolit đến hiệu

suât phản ứng tông hợp altretamin sử dụng sóng siêu âm

tông hợp

3.1.3.1 — Kiểm tra độ tỉnh khiết

3.1.3.2 — Xác nhận cấu trúc của altretamin tổng hợp được

3.2 Kết quả kiểm nghiệm chất lượng altretamin tổng hợp

được theo các tiêu chuẩn của Dược điển USP 30

3.3 Kết quả đánh giá độ ôn định của altretamin tổng hợp

được

3.3.1 Rà soát tính thích hợp của phương pháp

3.3.2 Kiểm nghiệm nguyên liệu altretamin trước khi tiến hành

theo dõi độ ôn định

3.3.3 Kết quả theo dõi độ ổn định của nguyên liệu altretamin

3.3.4 Kiểm nghiệm nguyên liệu altretamin sau khi tiến hành

4.5 Bàn luận về độ ôn định altretammm tông hợp được

KET LUAN VA DE XUAT

TAI LIEU THAM KHAO

CHU GIAI CAC CHU VIET TAT

Trong luận văn sử dụng một số chữ viết tắt sau:

: Infrared spectroscopy (phé héng ngoai)

: Khối lượng phân tử

: Methanol

: Mass spectrometry (phổ khối lượng)

: Microwave (vi sóng)

: Nhiễm sắc thể

: Relative humidity( độ ẩm tương đối)

: Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối)

: Sắc ký lớp mỏng

:Trung bình

: Nhiệt độ

: United state Pharmacopeia (Dược điển Mỹ)

: World health organization (Tổ chức y tế thế giới)

: Khối lượng của natri tartrat dihydrat

DANH MUC BANG TRONG LUAN VAN

Qui định về điều kiện bảo quản trong các loại thử nghiệm,

thời gian thử và số lô thử nghiệm tối thiểu đối với thuốc yêu

cầu bảo quản điều kiện thường

Một số hóa chất sử dụng trong luận văn

Chỉ tiêu chất lượng của altetamin theo Dược điển Mỹ USP 30

Chỉ tiêu theo dõi độ ỗn định altretamin theo Dược Điển Mỹ

USP 30

Giá trị hiệu suất theo nhiệt độ tiến hành phản ứng

Giá trị hiệu suất theo thời gian chiếu vi sóng

Hiệu suất phản ứng khi thay đổi tỷ lệ các chất tham gia phản

ứng

Hiệu suất phản ứng thay đổi theo xúc tác phản ứng

Hiệu suất phản ứng khi thay đổi lượng xúc tác

Giá trị hiệu suất phản ứng theo dung môi kết tinh

Giá trị hiệu suất theo thời gian siêu âm

Hiệu suất phản ứng chiếu sóng siêu âm thay đổi theo xúc tác

Số liệu phổ cộng hưởng từ proton (H-NMR) và cộng hưởng

từ hạt nhân 13C (C-NMR) của altretamin chuẩn và

Kết quả kiểm nghiệm altretamin theo tiêu chuẩn chất lương

của Dược điển Mỹ USP 30

Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu altretamin ngày

30/05/2010

Kết quả định tính (thời gian lưu) bằng phương pháp HPLC

của nguyên liệu tại các mốc thời gian theo dõi

Kết quả đương lượng nước của thuốc thử

Kết quả hàm lượng nước trong mẫu altretamin

Kết quả thử giới hạn tro sulfat của mẫu altretamin

Kết quả thử kim loại nặng của mẫu altretamin

Kết quả định lượng của mẫu altretamin

Kết quả theo dõi độ ôn định của altretamin trong thời gian 15 tháng

Kết quả kiểm nghiệm mẫu altretamin ngày 18/09/2011

So sánh hai phương pháp tổng hợp vi sóng và siêu âm

Hình ảnh 3D của cytocrom P450 3A4

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất theo nhiệt độ tiến

hành phản ứng

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất theo thời gian

chiếu vi sóng

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất theo thời gian

chiếu sóng siêu âm

Hình ảnh các mẫu altretamin tại các thời điểm nghiên cứu

Sơ đồ chu trình tế bào và vị trí tác động của altretamin

Sơ đồ cơ chế hoạt hóa altretamin và biến đổi DNA

Cơ chế deformyl hóa và tạo liên kết cầu nối giữa 2 phân tử

DNA

Các hướng tổng hợp altretamin

Sơ đỗ quy trình tổng hợp altretamin của Donald Kaiser

Sơ đồ quy trình tổng hop altretamin theo Donald Kaiser đã cải tiến

DAT VAN DE Trong thời đại ngày nay, nền công nghệ khoa học kỹ thuật ngày càng tiên tiến, hiện đại thì cuộc sống của con người cũng ngày càng phát triển Nhưng đi đôi

với điều đó là sự ô nhiễm môi trường toàn cầu ảnh hưởng tới khí hậu trái đất và môi trường sống của nhân loại Ô nhiễm môi trường sống và môi trường làm việc là một

trong những nguyên nhân gây ra bệnh ung thư, một trong các căn bệnh nguy hiểm

của thời đại Theo công bố của WHO, năm 2008 [39] có hơn 12,6 triệu người mắc

mới bệnh ung thu và hơn 7,6 triệu người bị tử vong vì căn bệnh này Nguyên nhân

phổ biến nhất là tử vong do ung thư phổi (1,4 triệu người, chiếm 18,2% số ca tử

vong do ung thư) và ung thư dạ dày (0,7 triệu người, chiếm 9,7% số ca tử vong do

ung thự) Hằng năm, số bệnh nhân mắc ung thư gia tăng liên tục, ước đoán đến năm

2015 sẽ có khoảng 9 triệu người chết do bệnh ung thư, con số này sẽ tăng lên là

114 triệu người năm 2030

Riêng ở Việt Nam, năm 2008 có 111.5§1 ca mắc mới bệnh ung thư và

82.006 ca tử vong do ung thư chủ yếu là do ung thư gan (21.748 trường hợp, chiếm

26,5% số ca tử vong do ung thư) và ung thư phổi (17.583 trường hợp, chiếm 21,4%

số ca tử vong do ung thư) Các bệnh ung thư thường gặp có tỷ lệ tử vong cao ở Việt Nam [3], [8], [39] la ung thu gan, ung thư phổi, ung thư buồng trứng, ung thư vú Hầu hết các loại thuốc điều trị ung thư đều phải nhập ngoại nên giá thành cao không

phù hợp với điều kiện kinh tế của người bệnh

Altretamin là một trong rất nhiều thuốc chống ung thư được nghiên cứu, thử nghiệm lâm sàng thành công và đưa vào sử dụng hiệu quả trong điều trị ung thư phối, ung thư buồng trứng, ung thư vú trên thế giới Loại thuốc này hiện đang được

sử dụng trong điều trị ung thư với các biệt dược như Hexastat (Pháp), Hexinawas (Tay Ban Nha), Altretamin (MY), Hexalen (US Bioscience - MY) Altretamin có

thể được tổng hợp theo nhiều phương pháp khác nhau Trong đó, tổng hợp

altretamin sử dụng xúc tác dị thê và kỹ thuật vi sóng là phương pháp tổng hợp hiện dai mang lại hiệu quả cao có thể triển khai áp dụng ở Việt Nam

Với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu quy trình sản xuất nguyên liệu

làm thuốc ở Việt Nam, chúng tôi tiễn hành đề tài “Ứng dụng một số kỹ thuật hiện

đại trong tông hợp aliretamin làm thuốc điều trị ung thư” với ba mục tiêu như sau:

1, Xây dựng được quy trình tổng hợp aliretamin sử dụng xúc tác zeolit, kỹ thuật vì sóng

2 Tổng hợp được altretamin đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ USP30 (2007)

3 Đánh giá độ ổn định của aliretamin tổng hợp được theo tiêu chuẩn Dược

điển Mỹ USP 30 trong thời gian 15 tháng.

Chuong 1 TONG QUAN 1.1 Tổng quan về altretamin (hexamethylmelamin)

Altretamin tén khoa hoc 1a N,N,N’,N’,N”,N”-Hexamethyl-[1,3,5]-

triazin-2,4,6-triamin

Công thức cấu tạo

Công thức phán tứ: CaHisNs

He YON CH Nhiệt độ nóng chay: 172°C - 173°C

N ZN Biệt được: Hexastat (Pháp), Hexinawas

bá (Tây Ban Nha), Hexamethylmelamin, Hexalen

⁄ZZ

NSC - 13875

1.1.1 Tac dung diéu trị ung thư

Quy trình tổng hợp altretamin được công bố đầu tiên bởi Donald W Kaiser

và cộng sự năm 1951 [19] Sau 25 năm, vào năm 1976, Sewa và cộng sự [37] đó nghiên cứu tìm ra tác dụng sinh học của altretamin có tác dụng chủ yếu trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thự vú và ung thư phôi Đặc biệt altretamin được sử dụng điều trị ung thư buồng trứng tiến triển sau khi phương pháp trị liệu đầu tiên

thất bại [17], [20], [26], [30], [35-36]

Altretamin với biệt dược Hexalen (ÚS Biosclence) đó được cục quản lý Dược và thực phẩm Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành đưa vào sử dụng trong điều trị ung thư vào ngày 26 tháng 12 năm 1990

Hexalen cũng được cấp phép lưu hành tại châu Âu từ ngày 05 tháng 07 năm 1995.

Chu trình tế bào và tác động của altretamin:

Theo tài liệu “Bách khoa ung thư học”[8] các tế bào ung thư cũng như

các tế bào bình thường đều phải đi qua 4 pha của chu trình tế bào, bao gồm:

- Pha G1 là pha hoạt động cơ năng của tế bào, tế bào trao đổi chất chuẩn

bị cho quá trình tổng hợp DNA Ở pha G1, tế bào có 2n NST

- Pha § là pha của quá trình tổng hợp DNA

- Pha G2 là pha chuẩn bị phân bào, còn gọi là tiền nguyên phân trong đó

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ chu trình tế bào và vị trí tác động của altretamin

Ngoài ra, tế bào còn có thể đi vào tình trạng nghỉ ngơi, gọi là pha G0, từ pha G1 (chủ yếu) hoặc G2 Các tế bảo được coi là “nằm ngoài chu trình” và không bị tác động của hóa chất Các tế bào này có thể quay trở lại chu trình tế

bào theo một cơ chế chưa rỡ

Tuy theo cơ chế tác động của từng loại hóa chất điều trị bệnh ung thư mà

thời điểm tác động của nó vào chu trình tế bào khác nhau Altretamin là một thuốc trong nhóm tác nhân chống ung thư alkyl hóa [17], altretamin tác động

vào pha G1 sớm của chu trình tế bào [7], [16-17], [20], [25]

Cơ chế tác dụng kháng tế bào ung thư của altretamin:

Từ các nghiên cứu cia Ames va cong su (1981) [14], Jackson va Harley

(1991) [23] va mot số nghiên cứu khác [15-16], [20], [29], [32], altretamin

được xếp vào nhóm thuốc điều trị ung thư kìm tế bào nhóm alkyl hóa

Một số tài liệu đã công bố [14-16], [20], [25] cho rằng cơ chế tác dụng

chống ung thư của altretamin có liên quan tới sự oxy hoá bởi enzym cytocrom

P450 cụ thể là cytocrom P450 3A4 (Hình 1.1)

Hình 1.1 Hình ảnh 3D của cytocrom P450 3A4 (CYP3A4)

Hình 1.2 Hình ảnh 3D của một số cytocrom P450 khác

Cơ chế quá trình hoạt hóa altretamin và tác dụng alkyl hóa DNA của tế

bao ung thu [14], [25], [29 ]cé thé được mô tả như sau:

- Đầu tiên một nhóm methyl -CH: / -N(CHa); bị oxy hoá thành alcol bậc

nhất -CH;OH bởi enzym cytocrom P450 3A4

- Tiếp theo là bước dehydrat hoá tạo ra ion methyleniminium, một tác

nhân ái điện tir Ion methyleniminium mang điện tích dương là tác nhân rất hoạt động có nhiệm vụ alkyl hoá DNA

Theo Garcia va cOng sy [20], ion methyleniminium tạo thành là chat trung gian có ái lực electrophil lớn đối với các trung tâm giàu điện tử trên phân tử DNA

Tác dụng trị liệu và gây độc tế bào của các tác nhân alkyl hoá chống ung

thư liên quan trực tiếp và mật thiết tới việc alkyl hoá DNA Nguyên tử N ở vị trí số 1 (N-1) và vị trí số 3 (N-3) của hợp phần adenin, nguyên tử N ở vị trí số

7 (N-7) và nguyên tử O của hợp phần guanin, nguyên tử N ở vị trí số 3 của hợp phần cytosin đều dễ dàng tạo liên kết với tác nhân electrophil (ion methyleniminium)

Tương tự như vậy, các nhóm -CH: sẽ tiếp tục được hoạt hoá Cơ chế tác dụng của altretamin có thể được mô tả như sơ đề 1.2

Nghiên cứu của Jackson và cộng sự [23], và của Hopkins va cong sy [20] cũng chỉ ra rằng cơ chế tác dụng của altretamin là do sự tạo thành liên

kết cầu nối (cross-linking) liên kết cầu nối tạo thành bởi tác dụng của

formaldehyd được tạo ra bởi quá trình deformyl hoá của altretamin như sơ đô 1.3 với các nguyên tử N ở vị trí số 6 (N-6) của vòng purin trong hợp phần deoxyadenosin

1.1.2 Chi dinh, dang bao ché, liều dùng của altretamin

Chỉ định: Altretamin được chỉ định cho điều trị các u ở phổi, buồng trứng và vú [3], [12], [20]

Dạng bào chế Viên nang 50mg, 100mg

Liễu dùng: Liều hàng ngày, chia 3 — 5 lần, uống xa bữa ăn

- phổi: 150 - 250mg/m”/ngày, đợt 5 ngày, nghỉ 5 ngày lại dùng đợt

khác, phối hợp với thuốc kìm tế bào khác

- U buông trứng: 150 - 250 mg/mÏ”/ngày, trong 21 ngày/tháng

- U vú: 150 - 250 mg/m”/ngày, trong 15 ngày/tháng

Sau đây là một số phác đồ có sử dụng altretamine để điều trị ung thư

biểu mô buồng trứng [3], [7]

1 Phác đồ CAP: (Chu kỳ 28 ngày)

Altretamin 150mg/m”/ngày, uống ngày 1 - 14

Cyclophosphamid 350mg/mŸ, tiêm tĩnh mạch, ngày 1,8

Doxorubicin 20mg/m’, tiém tĩnh mạch, ngày 1,8

Cisplatin 60mg/mỷ, tiêm tĩnh mạch, ngày 1,8

2 Phác đồ Hexa — CAF: (Chu kỳ 28 ngày)

Altretamin 150mg/m”/ngày, uống ngày 1 - 14

Cyclophosphamid 350mg/m”/ngày, uống ngày 1 - 14

Methotrexat 40mg/mỶ, tiêm tĩnh mạch, ngày 1,8

5 - Fluorouracil 600mg/mỷ, tiêm tĩnh mạch, ngày 1,8

3 Phác đô Hexalen: (Chu kỳ 28 ngày)

Altretamin 65mg/m”/ngày, uống ngày 1 — 14

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ cơ chế hoạt hóa altretamin và biến đổi DNA

Sơ đồ 1.3 Cơ chế deformyl hóa và tạo liên kết cầu nối giữa 2 phân tứ DNA

- Dóng vòng trime hóa từ imidic ester

- Thế Cl của cyanuric clorid bằng dimethylamin (phương pháp của Donald

Kaiser, phương pháp của Kapril Arya và Anshu Dandia)

NN Pact carberd mdic ester

Sơ đồ 1.4 Các hướng tổng hợp altretamin Dưới đây là một số phương pháp thường được sử dụng để tổng hợp altretamin:

1.2.1 Phuong phap tông hgp altretamin cia Donald W Kaiser

Quy trình tổng hợp altretamin của Donald W Kaiser

Quy trình tổng hợp altretamin được Donald W Kaiser và cộng sự công

bố lần đầu tiên năm 1951 [19] đi từ nguyên liệu đầu là cyanuric clorid và

dimethylamin với xúc tác là natri hydroxyd khan trong dung môi aceton

Sơ đồ 1.5 Sơ đồ quy trình tổng hợp altretamin của Donald Kaiser

sản phẩm thé

Phản ứng tổng hợp gầm hai bước:

- Bước 1: Hoa tan 1 mol cyanuric clorid vào trong 800ml dung môi aceton, thêm 3,3 mol dimethylamin, rồi thêm vào 1 mol natri hydroxyd, đun

hồi lưu ở 50°C trong 1 giờ Cất loại dung môi Phần cắn thô thu được thêm

xylen, lắc đều rồi cất đăng phí để loại hoàn toàn nước

- Bước 2: Thêm vào hỗn hợp phản ứng 2 mol bột natri hydroxyd khan

rồi đun nóng 3 giờ ở 100°C Xử lý hỗn hợp phản ứng, thu được sản phẩm thô

Kết tinh lại bằng methanol, thu được sản phẩm kết tỉnh màu trắng Hiệu suất

- Sản phẩm kết tinh hình kim mầu trắng

- Nhiệt độ nóng chảy là 172”C — 174°C

- Sản phẩm phụ là: 4,6-dicloro-2-dimethylamino-s-triazin va 2-cloro-4,6- bis-(dimethylamino)-s-triazin Các sản phẩm này dễ tan trong MeOH, EtOH lạnh nên có thể loại bằng cách kết tinh lại từ methanol hoặc ethanol

TS Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến quy trình này [4] nhằm hạn chế dùng dung môi methanol độc hại để kết tỉnh và đạt hiệu suất cao hơn (đạt 71% sau cải tiến) Quy trình được cải tiễn như sau:

- _ Tiến hành phản ứng không qua giai đoạn cất quay loại dung môi aceton

va nước

- _ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng bằng cách dùng dung môi hữu cơ chiết sản

phẩm thô, rửa sản phẩm thô với dung dịch NaCl bão hòa, làm khan bằng

Na;SO¿ khan, lọc, cất quay loại dung môi

- _ Thay thế dung môi kết tinh MeOH bằng các dung môi EtOH

aceton bột Na()H khan

1.2.2 Phương pháp tông hợp altretamin của Kapil Arya và Anshu Diana bằng kỹ thuật vỉ sóng sử dụng xúc tác zeolit

với hiệu suất 88% [5], [28]

Phương pháp này không sử dụng các dung môi có thể gây ô nhiễm môi trường nên được đánh giá là phương pháp thần thiện với môi trường Ngoài

ra, do quy trình đơn giản, dễ tiến hành phù hợp với điều kiện ở Việt Nam

1.2.3 Phương pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự

- Bước 2: Xử lý hỗn hợp phản ứng và kết tỉnh lại từ ethanol, thu được

altretamin là chất kết tỉnh trắng, nhiệt độ nóng chảy 174 — 1759C

1.3 Tổng quan về vi sóng, zeolit và ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ 1.3.1 Tổng quan về vi sóng

Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng

siêu tan, song UHF (Ultra High Frequence wave) [18]

Trong phé dién tr (electromagnetic spectrum), vi song nam ở khoảng

giữa phổ, từ tần số 0,3GHz đến 300GHz, tương ứng với độ dài của sóng trong

khoảng 100cm đến lcm do đó vi sóng còn gọi là sóng cm

Nguyên tắc làm nóng vật chất của vì sóng:

Sự đun nóng bằng vi sóng là làm tăng nhiệt độ của vật chất một cách

đặc biệt, không phụ thuộc vào sự dẫn nhiệt của bình chứa và vật chất Sự tăng nhiệt cục bộ tức thời của vật chất là do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền

ion Những hợp chất càng phân cực càng mau nóng dưới sự chiếu của vi sóng

Với kết cấu có độ bắt đối xứng cao, phân tử nước có độ phần cực mạnh, do đó

nước là một chất lý tưởng, dễ đun nóng bằng vi sóng Ngoài ra, các nhóm

định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH; trong các hợp chất hữu cơ

cũng là những nhóm chịu sự tắc động mạnh của trường điện từ

Vi sóng được ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ (xúc tác phản ứng): Giảm thời gian phản ứng, giảm phản ứng phụ và tăng hiệu suất

1.3.2 Tổng quan về zeolit và ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ [27]

Zeolit bắt đầu được phát hiện vào năm 1756 đến nay đã hơn 3 thế kỷ

Năm 1756, Le Bron Bronstedt là một nhà khoáng học người Thụy Điển đã

phát hiện ra một loại khoáng mới với tên gọi là zeolit, theo tiếng Hy Lạp

“zeo”: sôi, “lithof”:; đá, vì vậy zeolit còn có nghĩa là đá sôi

1.3.2.1 Khái niệm

Zeolit là hợp chất vô cơ dạng aluminosilicat tỉnh thể có cấu trúc không gian ba chiều, lỗ xốp đặc biệt và trật tự cho phép chúng phân chia (rây) phân

tử theo hình dạng và kích thước Vì vậy, zeolit còn được gọi là hợp chất rây

phân tử Thành phần chủ yếu của zeolit là Si, AI, O và một số kim loại kiềm, kiềm thổ khác

Công thức chung cua zeolit 1a:

M»,O Al,O3.x SiO, y HO

Trong đó: M: Cation có khả năng trao đổi

n: Hoá trỊ của cacbon

x: Tỉ số mol SiOz/AlzOa

y: Số phân tử nước trong đơn vị cơ sở ( khoảng từ 1 +12 )

Tỷ số x> 2 là sự thay đổi đối với từng loại zeolit cho phép xác định thành

phần và cấu trúc của từng loại

Zeolit X c6 x = 2,3+ 3

Zeolit Y cé x = 3,1+ 6

Gần đây người ta đã tổng hợp được các loại zeolit có thành phần đa dạng

có tỷ lệ mol S1Oz/AlzOa cao thậm chí có những loại cấu trúc tương tự zeolit

mà hoàn toàn không chứa các nguyên tử nhôm như các silicatic

1.3.2.2 Cấu trúc của zeolit

Zeolit có cầu trúc tinh thể, các zeolit tự nhiên cũng như zeolit tổng hợp có

bộ khung được tạo thành bởi mạng lưới không gian 3 chiều của các tứ diện

cation kim loại hoá trị 1 trong thành phần hoá học của zeolit chính bằng số

nguyên tử nhôm (AI)

1.3.2.3 Tính chất xúc tác bề mặt của zeolit

Zeolit có tính chất acid bề mặt

- Tâm acid Bronsted hình thành từ quá trình xử lý zeolit trong môi

trường acid, đối với các zeolit có tỉ số SiO; /AlzO; cao, có nồng độ thấp ( <

0,05N)

Na’-Z+HCl <> H-Z+NaCl

- Sự trao đổi cation của zeolit với các cation đa hoá trị (như các kim loại kiềm thổ, đất hiếm, kim loại quý) cũng làm xuất hiện dạng proton hoá M"™HZ Céc cation nay được trao đổi dưới dang phân tử ngậm nước Me”(H;O), Nhờ tác dụng ion hoá của cấu trúc zeolit, dạng phân tử ngậm

nước sẽ chuyển thành dạng [Me™ (OH),]H* lam xuat hiện proton Sự biến đôi

này có thê được biêu diễn như sau:

- Ngoài tâm acid Bronsted, zeolit còn có các tâm acid Lewis Sự hình thành tâm acid Lewis là do tồn tại AI trong mạng cấu trúc Khi nguyên tử oxy

bị tách ra, ở nhiệt độ cao, khỏi liên kết với AI thì sẽ xuất hiện tâm acid Lewis

Trong mạng cấu trúc của zeolit luôn tồn tại tâm acid Bronsted, nhưng

đối với loại tâm acid Lewis thì chỉ xuất hiện ở nhiệt độ cao

1.4 Tổng quan về độ ôn định của thuốc [1]

Khái niệm độ Ổn định của thuốc: là khả năng của thuốc (nguyên liệu hoặc thành phẩm) khi bảo quản trong điều kiện xác định giữ được những đặc tính vốn có về vật lý, hoá học, vi sinh, tác dụng dược lý và độc tính trong giới

hạn qui định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc

Sự liên quan giữa tuổi thọ của nguyên liệu và thành phẩm thuốc:

Độ én định, tuổi thọ của nguyên liệu được chất có liên quan, ảnh hưởng đến độ én định, tuổi thọ của thành phẩm bào chế Đi từ nguyên liệu dược chất

có độ ổn định cao chắc chắn thu được thành phẩm bào chế có độ ôn định cao hơn khi sử dụng nguyên liệu có độ ổn định thấp Tuy nhiên, tuổi thọ của

nguyên liệu và thành phẩm bào chế là các dữ liệu độc lập thu được tử các nghiên cứu cụ thể

Có thể phán loại độ ổn định của thuốc theo các đặc tính như sau:

- D6 ổn định hoá học: hàm lượng dược chất, các tạp chất và sản phẩm

phân huỷ còn đáp ứng đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng đề ra

- D6 6n dinh vat ly: còn giữ được các tính chất vật lý ban đầu theo quy định như hình thức bảo quản (mùi vị, màu sắc ), độ đồng nhất, độ hoà

tan, kích thước tiểu phân

- D6 ổn định trị liệu: hiệu lực điều trị không thay đi

- _ Độ ồn định về độc tính: không có biểu hiện đáng kế sự tăng độ độc

- _ Độ ổn định vi sinh: độ vô khuẩn hoặc số vi sinh vật, khuẩn lạc, hiệu

lực của các tác nhân diệt khuẩn còn đáp ứng yêu cầu trong giới hạn tiêu chuẩn

1.4.1 Các kiểu phân hủy nguyên liệu và một số biện pháp khắc phục 1.4.1.1 Phần hủy hóa học

- Thủy phân

Dược chất có các nhóm chức este, amid, lacton, lactam, imid, malonyl ure thường dễ bị thuỷ phân dưới xúc tác của ion hydrogen, các tác nhân acid và lon OH cũng như các tác nhân base Sự có mặt của nước trong dung dịch hoặc trong không khí âm tham gia tích cực vào phản ứng thuỷ phân

- Oxy hod

Dược chất có các nhóm chức phenol, catechol, ether, thiol, nitrit, acid

carboxylic, aldehyd dễ bi oxy theo các phản ứng chuỗi, dây chuyền, xảy ra

dưới tác động của oxy, đôi khi là phản ứng tự oxy hoá được khởi động bằng một lượng rất nhỏ của các tạp chất, vết ion kim loại

- Chuyển hoá đẳng phân

Nhiều dược chất có thể bị chuyển hoá đồng phân quang học hoặc đồng phân hình học Các đồng phân khác nhau, nhất là đồng phân quang học có sự

khác biệt về đặc điểm hấp thu, phân bố, chuyên hoá và thải trừ Vì sự chuyển hoá đồng phân được coi là sự phân huỷ thuốc, có thê làm thay đổi tác dụng

dược lý, gây ra các tác dụng không mong muốn hoặc làm giảm tác dụng điều trị

- Phân huỷ do ánh sảng

Nhiều dược chất có nhân phenothiazin, các hydrocarbon có nhân thơm,

có dị vòng aldehyd, ceton nhạy cảm với ảnh sáng, bi phân huỷ nhanh khi có tác động của ánh sáng

- Su loai nước rong cau tnic hod học và sự mất nước kết tỉnh trong

tinh thé

Quá trình loại đi phân tử nước trong phân tử dược chất thường tạo dây

nỗi đôi liên hợp tham gia vào sự cộng hưởng điện tử với các nhóm chức liền

kề trong phân tử, là quá trình phân huỷ hoá học, như trường hợp phân huỷ đối

với prostaglandin, tetracyclin

- Su polyme hod

Sự polyme hoá là quá trình kết hợp hai hay nhiều phân tử dược chất tạo

ra một phân tử phức hợp Ví dụ sự polyme hoá xảy ra trong dung dich natri ampicilin đậm đặc Một phân tử mở vòng -lactam để kết hợp với mạch nhánh của một phân tử khác tạo ra một dimer có thể tạo tiếp polyme lớn hơn

Các polyme đó là một trong những tác nhân dẫn đến phản ứng mẫn cảm của

kháng sinh họ B-lactam trên người

1.4.1.2 Phần huỷ vật lý

- Chuyển thể đa hình

Đa hình là hiện tượng cùng một hợp chất nhưng có thể tồn tại dưới

nhiều dạng tỉnh thể do quá trình kết tỉnh sử dụng dung môi, pH, nhiệt độ khác nhau Các thể đa hình này có độ tan, tốc độ tan và hoạt tính sinh học mạnh yếu khác nhau, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu lực điều trị

- Bay hơi

Một số dược chất dễ bay hơi ở nhiệt độ phòng có thể bay hơi ra ngoài

qua đồ bao gói làm giảm hàm lượng thuốc Đó là các tinh dầu, este, ceton,

alcol phân tử lượng nhỏ

- Thay đổi các tỉnh chất cơ lý, cấu trúc hoá lý của dạng bào chế

Đối với thành phẩm bào chế Trong quá trình bảo quản, lưu thông, phân phối, theo thời gian, một số tính chất vật lý, hoá lý của dạng thuốc có thể bị biến đổi, không đạt các chỉ tiêu quy định theo tiêu chuẩn chất lượng

- Phân huỷ do vi khuẩn, nắm mốc

Sự phát triển của vi khuẩn, nắm mốc trong chế phẩm có thể làm cho

thuốc không đạt các chỉ tiêu về độ vô khuẩn, nội độc tố, chí nhiệt tố, đồng thời cũng là nguyên nhân phân huỷ dược chất, làm giảm hàm lượng, thay đổi

hình thức cảm quan, độ trong

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phân huỷ dược chất

1.4.2.1 Nhiệt độ

Cơ sở lý thuyết nghiên cứu ảnh hướng của nhiệt độ đến tốc độ phản

ứng dựa trên phương trình của Arhenius, thường dùng phương trình ở dạng tích phân:

Trong dé: k: Hằng số tốc độ phản ứng

T: Nhiệt độ tuyệt đối

E: Năng lượng hoạt hoá R: Hằng số khí lý tưởng Dựa vào quan hệ giữa tốc độ phản ứng và nhiệt độ, phương pháp lão

hoá cấp tốc đã áp dụng biện pháp bảo quản thuốc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ

bảo quản bình thường (điều kiện thực trong quá trình lưu thông phân phối

thuốc) để thúc đây nhanh tốc độ phân huý, rút ngắn thời gian theo dõi, đánh giá để dự báo tuổi thọ của thuốc Tuy nhiên, phải đảm bảo nhiệt độ lão hoá

cấp tốc không làm thay đổi cơ chế phân huỷ thuốc

1.4.2.2 pH

pH của dung dịch thuốc ảnh hưởng lớn đến độ én định của thuốc, sự thay déi pH có thể làm tăng hay giảm tốc độ phân huỷ dược chất, đôi khi làm

thay đổi cơ chế phân huỷ

1.4.2.3 Lực ion trong dung dịch

Tốc độ phản ứng có thể chịu ảnh hưởng của lực ion theo phương trình Sau:

logK =logK, +10Z,Z 4/14 Trong đó:

Za, Zp la điện tích các ion

u là lực ion (một nửa của tổng bình phương điện tích các ion c6 mat trong dung dịch.)

K là hằng số tốc độ phân huỷ

Kg là hằng số tốc độ ở độ pha loãng vô cùng

1.4.2.4 Ánh sáng, độ âm và đồ bao gói

Độ ẩm là tác nhân chính gây phân huỷ thuốc ở các dạng bào chế rắn

Ánh sáng tác động đến độ ổn định của thuốc như đã nêu trong mục phân huỷ

do ánh sáng Đồ bao gói với loại vật liệu thích hợp có thể hạn chế được tác động của độ Am và ánh sáng đến độ ôn định của thuốc

1.4.3 Các phương pháp đánh giá độ ôn định

1.4.3.1 Phương pháp thứ cấp tốc

Phương pháp thử cấp tốc là các thử nghiệm nghiên cứu làm tăng tốc độ

phân hủy hóa học cũng như phân hủy vật lý của thuốc bằng cách bảo quản thuốc trong điều kiện có tác động cao hơn mức độ bình thường ở điều kiện

thực Mục đích của lão hóa cấp tốc là xác định các thông số động hóa học của

quá trình phân hủy, từ đó tính toán, dự báo tuổi thọ của thuốc

1.4.3.2.Phương pháp thử dài hạn

Phương pháp thử dài hạn là thử nghiệm bảo quản thuốc trong điều kiện thực, toàn bộ các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn đều được đánh giá kéo

dài theo thời gian đến khi thuốc không còn đáp ứng chất lượng đề ra Thử

nghiệm dài hạn có ý nghĩa xác định chính xắc tuổi thọ, thời hạn sử dụng của thuốc

Dé có thể tiến hành thử nghiệm dài hạn phù hợp với điều kiện khí hậu thực, thuận lợi cho việc lập kế hoạch nghiên cứu độ ổn định, chọn điều kiện

bảo quản, đồ bao gói, người ta chia khí hậu của các nước làm bốn vùng: Vùng khí hậu I: Vùng ôn đới (ôn hòa) 21°C, 45% RH

Vùng khí hậu II: Vùng cận nhiệt đới, lục địa (tương đối âm) 25°C, 60%

RH

Vùng khí hậu II : Vùng sa mạc (nóng và khô) 30°C, 35% RH

Vùng khí hậu IV : Vùng nhiệt đới (nóng và âm) 30°C, 70% RH

Bảng 1.1 Qui định về điều kiện bảo quản trong các loại thử nghiệm, thời

gian thứ và số lô thử nghiệm tối thiếu đối với thuốc yêu cầu bảo quản

điều kiện thường

thử nghiệm Điền kiện bảo quản tối thiểu

Dài hạn (trong Với các nước châu Âu, Nhật, Mỹ: 25°C + 12 thán

Theo quy định trên, Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu IV [2]

Để xây dựng nội dung nghiên cứu độ ổn định của một chế phẩm, chúng tôi

tham khảo các hướng dẫn chỉ tiết của WHO [29],ICH [21], [22], ASEAN

[13] và của một số nước

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Hóa chất sử dụng tại phòng thí nghiệm là các hóa chất thông thường, hóa chất tinh khiết, tỉnh khiết phân tích của công ty hoá chất Đức Giang (Việt

Nam), công ty hoá chất Quảng Châu, công ty hoá chất Shanto Xilong Quảng

Đông (Trung Quốc), hãng Aldrich (USA), hãng Merck Một số hóa chất sử

Bảng 2.1 Một số hóa chất sử dụng trong luận văn

STT | Tên hoá chất | Nguôn gốc STT | Tên hoá chất | Nguôn gốc

2 |Dimethylamin | Merck 16 | HY zeolit Merck

4 | Ethyl acetat Merck 18 | Natri sulfat khan | Trung Quốc

H,SO, Merck- Đức | 23 | NH; Merck — Dire

10 | HCl Merck — Ditc 24 | (NHy),CO; Merck — Ditc

11 | HNO, Merck- Đức | 25 | Thioacetamid Merck — Đức

12 | CH;COOH Merck- Đức | 26 | Glycerin Merck - Đức

13 | CHCOONa Merck - Đức 27 | Pyridin Merck —- Đức

14 | SO, Merck — Đức 28 | Methanol Merck — Đức

2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Phếu lọc hút chân không Buchner

- Cân điện tử Shimadzu EL — 300

- Cân phân tich Mettler AB 204

- Máy phản ứng vi sóng - siêu âm SINEO UWave 1000

- Tu sy Memmert

- Tủ sấy hút chân không Shellab

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cất quay

- Bình định mức, pipet, dụng cụ thủy tính đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích

- Ban mong silicagel Kieselgel 60 F254 (Merck)

- Máy đo nhiệt d6 nong chay Electrothermal Digital

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin — Elmer (phong thi

nghiệm Hóa vật liệu, khoa Hóa học, Trường DH khoa học tự nhiên, ĐH quốc

gia Hà Nội)

- Phổ khối lượng (MS) ghi trên máy LTQ Obitaltrap XL (phòng thí

nghiệm Hóa vật liệu, khoa Hóa học, Trường DH khoa học tự nhiên, DH quốc gia Hà Nội)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR và 'C - NMR) ghi trên máy

Bruker - AV500 (phòng Phân tích cấu trúc, viện Hoá học, viện Khoa học và công nghệ Việt Nam)

2.3.2 Kiếm nghiệm Altretamin theo Dược điển Mỹ USP 30 [38]

Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm altretamin của Dược điển Mỹ USP 30: Bảng 2.2 Chỉ tiêu chất lượng của altretamin theo Dược điển Mỹ USP 30

sắc ký đô dung dịch thử phải cho pic co thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chinh trên sắc ký đô dung dịch altretamin chuân

định trên 1g chê phâm) Tro sulfat Không được quá 0,1 %

Kim loại nặng Không được quá 0,004 % ( 40ug/g)

Định lượng

( phương pháp HPLC) Hàm lượng altretamin phải đạt từ 98,0% đến 102,0

%, tinh theo chế phẩm khan

e_ Hóa chất thuốc thử: Theo USP 30

e_ Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 30 (phụ lục 231, phương pháp 2) Chuẩn bị mẫu thử:

Cân khoảng 0,5g chế phẩm trong chén sứ, làm âm bằng H;SO¿ và đun nhẹ cho đến khi chảy hoàn toàn Thêm 2ml HNO», 5 giọt H;SO¿ và đun nóng cho đến khi không còn khói trắng bay ra Nung ở 600°C cho đến khi không còn carbon —> làm nguội —› thêm 4ml HCI 6N —› đun cách thủy 15 phút — bốc

hơi đến cắn Làm âm cắn với 1 giọt HCI, thêm 10ml nước nóng —› để yên 2 phút — thêm từng giọt NH: 6N cho đến khi có phản ứng kiềm với giấy quỳ

—> pha loãng với nước đến 25ml Điều chinh pH 4,0 bang acid acetic IN > lọc —> rửa chén sứ và giấy lọc với 10ml nước Kết hợp dịch lọc và pha loãng với nước thành 40ml

Ống thử: 2ml đệm acetat pH 3,5 + 1,2ml thioacetamid glycerin + 40ml dung

dịch thử trên — pha loãng với nước thành 50ml, trộn đều và để yên 2 phút

Ống chứng: 2ml đệm acetat pH 3,5 + 1,2ml thioacetamid glycerin + 40ml

dung dịch chì 10ppm —> pha loãng với nước thành 50ml, trộn đều và để yên 2

phút

e_ Yêu cầu: Màu của ống thử phải nhạt hơn màu của ống chứng

d Tro sulfat

e© Hóa chất, thuốc thử: Theo USP 30

e_ Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 30 (phy luc 281)

Cân khoảng 2g chế phẩm trong chén sứ (đã được nung 600°C trong 30

phit), lam ẩm bằng 1ml H;SO¿„ và đun nhẹ cho đến khi cháy thành than Thêm 1ml H;SO¿ và đun cho đến khi hết khói

Nung ở 600°C cho đến khi cháy thành tro

Để nguội trong bình hút âm Cân

e Nước:

Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 30 (phụ lục 921, phương pháp 1)

Dung môi pha mẫu: hỗn hop methanol — nuéc (65 : 35)

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn altretamin trong dung môi pha mẫu có nồng độ altretamin khoảng 0,025mg/mI

Chuẩn altretamin: 25mg pha trong 50ml dung

môi —› lẫy 1ml pha trong 20ml dung môi —› dung dịch chuẩn

- Dung dich mau: Hoa tan một lượng chế phẩm trong dung môi pha mẫu

để thu được dung dịch có nồng độ altretamin khoảng 0,025mg/mI Thử altretamin: 25mg pha trong 50ml dung môi — lẫy 1ml pha trong 20ml dung môi — dung dịch thử

e Kết quả: Hàm lượng altretamin trong chế phẩm, tính theo chế phẩm khan, được tính theo công thức:

C,: Néng d6 dung dich tht (mg/ml)

a: Độ âm (%)