Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội

Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYEN THI HUYEN

NGHIEN CUU HE VI NAM TREN

CAC VI THUOC CAM THAO BAC

VA HUYEN SAM DANG LUU HANH

O CAC HIEU THUOC DONG DUOC |

KHOA LUAN TOT NGHIEP DUGC SI

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

ThS Tran Trinh Cong

Giảng viên bộ môn Vị sinh — Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội - người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi những kiến thức quý báu trong quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Bộ môn Vi sinh — Sinh học,

trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã nhiệt tình giup đỡ tạo mọi điều

kiện cho tôi thực hiện đề tài

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức, giủp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn

giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2019

Sinh viên Nguyễn Thị Huyền

1.1 Các nhóm nắm thường gặp trên các sản phẩm c6 nguon goc thuc

NV nnanererorggi000100710000005109000000000800010009008000010000010274/0000400109Y0509/010016000630370039 3:0 2 1.1.1 Ngành nấm tiếp hợp — ZÿyØ0my€ota - 5c size 2

1.1.1.2 Nuôi cấy để nhận Mien oo ccccccccccececcscsesseneecseecseeveseseseeseveseeneess 4

1.1.2 Ngành nắm túi — ,4S€Ø/HJŒØf 52 cSvcv+se£szvrvrxeesreea 5

liái, - CHẾ đặc [HỦI G10 (ORE ccsncumacmmanmamacnaniaune 5

I.I.2.2 Nuôi cấy để nhận điện -ccc+ci<s<scvea 6

Leldeds BROW DRG [OfÍcssoesoaaaeansenaerrnnenrrrnreensnnseseisressentrrmrsee 6 1.1.3 Nhóm nắm bất toàn — Deuteromycetes - . -5: 5+: 7 1.1.3.1 Chi Aspergillus Micheli ex Fries 7

LLZ2, Cheb Pentcillizm Linkcsex TIÌS eeeeieseeeseeess=es 1]

1.2 Tình hình nghiên cứu mức độ nhiem nam moc trên dược liệu ở

2„⁄zÌNOI dung nghiềN! CỨU :: -:ccccoccscciccirncccii22064600000653661630053666160816360/0000120 54 20

2.2.1 Phán lập, phán loại các chúng nắm nhiễm trên I0 mẫu của vị thuốc cam thảo bắc nghiên CỨ - e555eScseseeeeeeersezerrrrszeeecrrce 2Ô

2.2.2 Phân lập, phân loại các chủng nâm nhiễm trên 10 mẫu của vị

thuốc huyễn sâm nghiÊH GỨN - s5 - sec HS 1 1012161 11144 20

3.3 Phương pRáp hghiêu cứu ciddouGonasgtsie 21

2.3.1 Phương pháp Ïấ HHẪM . 5225 2t 222 test srrrrrervrrrred 2] 2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liỆH - 5: 21

2.3.3 Phương pháp phân lap natn me cccccccceccccsscssesessessessesssvesesessseess 21 2.3.4 Phương pháp phân loại nữm mốc -. 2- ©5+5+5<<5++s55 2I

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Hệ vi nắm trên vị thuốc cam thảo bắc -. . «<< i 3.2 Hệ vi nấm trên vị thuốc huyền sâm 6: 5c 5< se 30

EFYTAIäBH VÀ EHERN NGHỘ -iiiiagoidsieSgidaooraggzeodtrsossai 38

DANH MUC CAC KI HIEU, CAC CHU VIET TAT

: Dược điển Việt Nam II

: Aspergillus flavus : Aspergillus niger

: Aspergillus fumigatus

: Aspergillus parasiticus

: Aspergillus oryzae

: Syncephalastrum racemosum : Potato Dextrose Agar

: Aspergillus flavus and parasiticus Agar : Corn Meal Agar

DAT VAN DE

Ở nước ta thuốc y học cổ truyền và các chế phẩm đông dược đa số có

nguồn gốc thực vật [9] Hiện nay việc sử dụng các sản pham nay phuc vu nhu

cầu chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe của người dân ngày cảng tăng Bên cạnh

đó, các phương pháp, phương tiện chế biến, bảo quản dược liệu còn nghèo

nàn lạc hậu, cùng với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm ở nước ta Điều đó

làm cho các loại dược liệu, các vị thuốc đông dược rất dễ bị nắm mốc xâm

nhiễm và phát triển Ngoài việc làm giảm chất lượng thuốc do bị biến đổi

thành phần hóa học, bị biến màu, sinh mùi vị khó chịu, nam mốc còn sinh

ra các độc tô (mycotoxins) [17]-đây là những sản phẩm chuyên hoá thứ cấp

độc của nấm, gây nguy hại cho sức khoẻ người tiêu dùng Các độc tô nắm này

gây ra nhiều loại bệnh khác nhau cho con người và động vật gọi chung là các bệnh do độc t6 nam (mycotoxicoses), với các tác động từ cấp tính đến mãn

tính, có thể dẫn đến quái thai, ung thư [4, 17]

Qua những vấn đề đã nêu trên chúng tôi thây nắm là nhóm vi sinh vat

có ảnh hưởng quan trọng đối với chất lượng và độ an toàn của được liệu Tuy

nhiên các loại nắm khác nhau có vai trò và ảnh hưởng khác nhau đối với dược

liệu Do vậy việc điều tra hệ vi nấm trên từng cơ chất là một bước hết sức

quan trọng, mang tính quyết định trong việc tìm ra các biện pháp hữu hiệu đề

phòng tránh các tác hại nêu trên Với mục đích, ý nghĩa đó chúng tôi tiễn hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ vì nắm trên các vị thuốc cam thảo

bắc và huyền sâm dang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa

bàn Hà Nội” với mục tiêu :

Phân lập và phân loại các chủng nắm nhiễm trên hai vị thuốc cam thảo băc và huyện sám đến cáp chỉ và loài

Chương 1: TÔNG QUAN

1.1 Các nhóm nắm thường gặp trên các sản phẩm có nguồn gốc thực vật

Các cơ chất có nguồn gốc thực vật như các loại hạt lương thực, cơ

chất thực vật chết „ thường có mặt các nhóm nắm quan trọng như nhóm nắm

bất toan (Fungi Imperfecti hay Deuteromycetes), nganh nam tiép hop

(Zygomycota) và nganh nam túi (4seomyeota) Sau đây chúng tôi xin trình

bày một số nét chính của các nhóm nắm kẻ trên

1.1.1 Ngành nắm tiếp hợp - Zygomycota

lLILILI Cac dac tinh quan trong

Đây là nhóm nẫm khá phổ biến trên lương thực, được thảo Đặc điểm

chung của nhóm này là có hệ sợi nắm cong bao, bao tu tiép hợp được hình thành từ các hệ sợi hữu thụ, bào tử có vách dày, chắc được gọi là bào tử tiếp hợp (zygospore)

Sinh sản vô tính bằng các bào tử nang (sporangiospore), được nội sinh

trong các nang hình cầu hoặc hình quả lê có hoặc không có bọng hoặc phần

trung tâm bên trong nang (colummella), được tiếp nối bởi một cuống nang

(sporangiphore), hoặc các bào tử vô tính được sinh ra trong các nang bào tử chuỗi (chúng được phân ra thành một hàng các bào tử chuỗi-merospore) Nang bào tử chuỗi (sporangium) không có colummella Sporangiole (các

nang bào tử thường có hình cầu, với một hoặc một số ít bào tử và colummella

bị tiêu biến) bắt gặp ở các ho Thamnidiaceae, Cunninghamellaceae va

Choanephoraceae Một số chi được đặc trưng bởi cấu trúc apophysis ( phản

phông lên của cuống nang, ngay sát bên dưới nang) Sợi bò (Stolon) có thé

xuất hiện-là các sợi đặc biệt năm trên bề mặt thạch và sinh các cuỗng nang

sporangiophore Các sợi bò này dính vào cơ chât băng các sợi giông như rê

gọi là rễ giả-rhizoid [hình I1] Một số loài sinh các bào tử thành dày-

chlammydospore, hoặc các bào tử thành mỏng-oidium thường có hình câu,

chúng có thể được sinh ở cuối sợi, xen kẽ, đơn độc hoặc thành chuỗi

Cac bào tử nang, bào tử thành dày-chlammydospore, bào tử thành

mỏng-oidiun nảy mầm sẽ tạo thành hệ sợi mới

Sinh sản hữu tính xuất hiện bằng sự hoà trộn các nang giao tử đa nhân,

đơn bội-gametagium và kết quả cho ta một bào tử tiếp hợp-zyøospore thành dày, màu vàng tới nâu hoặc đen, thường được bao phủ bởi một lớp các gai nhọn và các cấu trúc lỗi ra khác Hai phần sợi ở hai đầu kết thúc của bào tử được gọi là cuống noãn-suspensor Các cuống noãn này có thể giống nhau hoặc không giống nhau về kích thước và hình dạng Đôi khi cuống noãn hình thành các phần phụ hay mấu (như ở một số loai ctia chi Absidia)

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của chi Rhizopus

Ré gia (rhizoid), soi bò (stolon) và nang bào tử (sporangium)

( Sharma, 1998) Hầu hết các thành viên của nhóm này là các sinh vật hoại sinh, tuy

nhiên một sô loài thường øây hại các loại nâm khác, gây các bệnh ở người và

thuc vat Bénh do nam Mucorales gap chi yéu 6 cac chi Rhizopus Rhizomucor, Cuninghamella, Cac chi Mucor, Absidia it gap hon

1.1.1.2 Nudi cay để nhận diện

Các chủng của nhóm nắm này thường được nuôi cấy trên môi trường

MEA (Malt Extract Agar 4%) trong cac dia Petri nhua Déi véi chi Mucor, việc nuôi cây như vậy sẽ tạo ra sự phát triển không bị xáo trộn do phát triển

quá mức (Schipper, 1973) Nhiệt độ nuôi cấy thay đổi từ 20°C đối với chỉ

Mucor, dén 20-30°C đối với các chỉ Rjizopus và Syncephalastrum và xâp xỉ

36°C đối với chỉ 4bsiđia Tất cả các loài được nuôi cấy trong môi trường tối

trong vòng một tuần Đề tạo điều kiện cho sự phát triển bào tử tiếp hợp, môi trường và nhiệt độ thường được luân phiên

Khoá phân loại một số chỉ phố biễn trên các loại hạt lương thực: Hesseltine va Ellis (1973) chia ho Mucoraceae thành 20 chi trong đó

chi Rhizopus va chi Mucor 1a quan trong nhat

la Bào tử nang được hình thành trong các nang chuỗi bào tử- merosporangium bao phủ xung quanh một bọng ( phần cuối phông lên của giá

PAIS SPEAR OT OES sascameresancarrrcmmenueernmemnenenmanenins Syncephalastrum

1b Bào tử nang được hình thành trong các nang hình câu hoặc quả lê G101 Hgf0£-GHWDNHIEN: vs bseii9106ãã00E0608566E©058300GE56308I0fa4800d0 2

2a Các nang và giá nang có màu tối, giá nang hầu như không phân

nhánh, thường xuất hiện thành nhóm Đường kính (ĐK) nang thay đổi từ 50-

20U 107: Bi LỪ [HữUNG WO NÓ (vo pusac ndog0011a0)V40000 G3 ID4A338y0S0tcxag Rhizopus

2b Các nang và giá nang không có màu hoặc chỉ có màu nhạt, thường phân nhánh nhiều ĐK các nang không bao giờ vượt quá 100 um Bao tir thường KHÔNG GÔ RÙ cai 0624000161465 6565650606 G4014S40G0E4UAGXSOR'0532XE994938%/48 3

3a Các nang hình quả lê với một apophysis đặc trưng, ĐK 10-40 um

(các nang cuối cùng có ĐK tới §0 tim) s -<5cc<<<<<cc+.-<<+ +44 Sđ7đ

3b Các nang hình cầu không có apophysis, hầu hết có đường kính lớn

1.1.2 Nganh nam tui— Ascomycota

1.1.2.1 Các đặc tinh quan trọng

Hệ sợi của nấm túi có vách ngăn va don bội Sinh sản hữu tính bang

các túi bào tử (aseus), thường được hình thành bằng việc tiếp hợp của hai

nhân từ hai túi giao tử khác nhau (giao tử đực-antheridium, giao tử cái-

aScogonium)

Thường có 8 (đôi khi 2 hoặc 4) bào tử túi được hình thành trong các túi

sau quá trình giảm phân Các túi bào tử thường được bao bọc trong thê quả túi

(ascomata hay ascocarp) Các thể quả này xuất hiện đơn độc hoặc kết tụ lại

thành cụm trong hoặc trên một đệm (stroma), câu tạo bởi hệ sợi dinh dưỡng

Hình thái của các thể quả có ý nghĩa quan trọng trong việc phân loại Chúng

thường có dạng như cóc (apothecia), dạng cầu hoặc gần câu, không có lỗ mở

(cleistothecia), hoặc các thể quả hình bình (perithecia) Các túi bào tử cũng có thê phát triển trong các ô của các lớp đệm (stromata), hoặc mọc lên từ các cầu

trúc gidng goi dém (pseudothecia)

Trạng thái sinh túi bào tử hay teleomorph thường được kẻm theo một hoặc nhiều các trạng thái sinh sản vô tính-anamorph Đa số nắm bất toàn Deuteromycetes (Eungi 1mperfecti) có trạng thái anamorph trong các chu ky

sng cla nam tui Ascomycetes Tat cả các chỉ nắm túi được nói đến ở đây đều thuộc bộ Eurofiaies, các thể quả túi có đặc trưng là các túi bào tử nhỏ hình

cầu hoặc gần cầu chứa các bào tử túi-ascospore có cầu trúc bề mặt đa dạng Dạng vô tính được mô tả ở đây thuộc các chỉ Penicillium, Paecilomyces, Basipetospora va Aspergillus.

1.1.2.2 Nuôi cấy để nhận diện

Các chủng phải được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp Các chỉ Byssochlamys, Monascus, Emericella, Talaromyces va Neosartorya hinh

thành bào tử tốt nhất trên các môi trường MEA, OA ở 24-30°C Các chủng

cia chi Eurotium phát triển chậm trên các môi trường này và tạo ra các

conidiophore không điền hình, các thể quả lép Để Eurotium hinh thành bào

tử tôi ưu, phải nuôi cấy trên các môi trường MEA, Czapek bố sung thêm 20-

40% đường kính hoặc 10-30% NaCl Dé phan lap nén ding môi trường DG18 (Dichloran 18% Glycerol agar) Hầu hết các loài nấm túi được nói tới đây

chín sau 10-14 ngày Lưu ý rằng một số loài nấm túi của các chỉ như Talaromyces và Neosarforya, dạng vô tính đôi khi khó tìm thấy và chúng chỉ

xuất hiện trên môi trường già hoặc khi nuôi cây trên môi trường nghèo như

Potato Carrot hoac HA (Hay infusion Agar)

1.1.2.3 Khoá phân loại

la Thể quả túi cố cuéng đặc trưng cuống cầu tạo bởi một sợi đơn Dạng vô tính anamorph là arsi2efOsDOFđ - - - Monascus

Ib Thể quả túi không có cuống, dạng vô tính là Penieilium, PORCUOMVCES NOG ASPOPO Nie ccs sisi: csvarecnsess renee SăN BỀN Hi LTNN Eăb6©x S246 0 Z

2a Thể quả túi không có vách đặc trưng Dạng vô tính là

POSCHOMYCES ssnctsccstcsevisnteenstsvectvarmnevereses cedesanemneaen Byssochlamys

2b Thé qua tui cé mot lép vach ao Dang v6 tinh 1a chi Aspergillus

PRs PAI ois candi nnnik stats nainn Sessa SAS aRe RENEE Me NeR REL ANNIVER 3

3a Dạng vé tinh 1a chi Penicillium Thé qua tui cd lép vỏ bọc đặc

trung, mau vang déi khi chuyén thanh mau hoi do Talaromyces

3b Anamorph 1a Aspergillus Thé qua tii có các tế bào Hủille, hoặc có

conidi (conidial head) Conidi ở dạng chuỗi khô có thể hình thành dạng cột (columnar) hoặc dạng phân kỳ (radiate) Conidi (conidium) chỉ gom một tế bào, bề mặt nhăn hoặc xù xì, có gai, không màu hoặc có màu Một số loài có thể sinh tế bào Hiille (Hiille cell) có thành nhăn, dày đơn độc hoặc thành chuỗi, các hạch nắm (selerotia) là các khói sợi thường có hình cầu cứng

Cac trang thai hitu tinh: Ewrotium, Emericella, Neosartorya và các chì

khac

Các loài của chi Aspergillus la nhitmg tac nhan lay nhiễm phô biến trên

các cơ chất khác nhau [18] Ở các vùng nhiệt đới (như Việt Nam) và cận nhiệt

đới, sự xuất hiện của chúng phô biến hơn rất nhiều so với các loài của chi

Penicillium M6t s6 loai da thu hút được sự quan tâm đặc biệt do chúng là

những tác nhân gây bệnh ở người và động vật hoặc khả năng sinh các chất

chuyền hoá thứ cấp độc Thể nhiễm nam được chú ý nhiều nhất là u nắm phổi

do Aspergillus Loai gay bénh nhiều nhất là 4spergillus ƒumigafus Một SỐ loài khác có tầm quan trọng trong việc lên men các sản phẩm truyền thông

phương đông, hoặc các ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ hoặc cac enzym [18, 21]

Hình 1.2: Cau tric sinh conidi cia chi Aspergillus

Việc phân loại chỉ Aspergillus chủ yêu dựa trên các đặc điểm hình thái Raper

& Fennell (1965) đã chia chi này thành I8 nhóm (group) và da chấp nhận 132

loai voi 18 thir Raper& Fennell (1965) da chia nho chi Aspergillus thành các

nhom (group) Sự phân chia dưới chi này không có vị trí trong mã danh pháp

thực vật quốc tế, bởi vậy Gams & cộng sự (986) đã thay các đơn vị “group”

bằng các “Subgenera” và “Section”

Trong phạm vi công trình này, chúng tôi chỉ giới thiệu ngắn gọn và đưa vào khoá phân loại các loài phổ biến nhất, đặc biệt là các loài thường nhiễm

trên lương thực, sản phẩm có nguồn gốc thực vật Do vậy để có thể nhận diện

chính xác các chủng quan trọng cần tham khảo thêm các tài liệu khác ( Raper

& Fennell 1965, Samson 1992, 1994a &b) Như đã nói ở trên, các loài của chi

Aspergilius là những tác nhân lây nhiễm rất phô biến, do vậy không có một danh sách cụ thể các cơ chất mà mỗi một loài được phân lập Các dữ liệu về

phân bó của nhiều loài đã được Domsch và cộng sự liệt kê 1993,

Các chỉ dẫn đề nhận diện các loài ⁄1sperg¿//zs chủ yếu dựa trên các đặc tính hình thái khuẩn lạc đã được nhiều tác giả công bố như Pitt & Hocking

(1985), Klich & Pitt (1988a), Tzean & cong sự (1990)

Nhôi cấy để nhận điện:

Các chủng đựơc cấy tại 3 điểm trên môi trường Czapek và MEA 2% và

ủ ở 25C Đối với các loài nắm ưa khô như 4 penicilloides, một số loài khác

và trạng thái Zurofium có thê sử dụng các môi trường Czapek và MEA với

20-40% đường kính Nuôi cấy các chủng tại 3 điểm trên các môi trường, sử

dụng đĩa Petri thuỷ tỉnh tốt hơn các đĩa Petri bằng chất đẻo Hầu hết các loài hình thành bào tử trong vòng 7 ngày Màu và cấu trúc của khôi conidi (dạng

cột hoặc phân kỳ) được quan sát tốt nhất bằng kính hiển vi phân tích Do một

số loài của chỉ 4spergillus có thể gây bệnh ở người, đặc biệt là 4 ƒuigatus nên cần có biện pháp phòng tránh hít phải bào tử.

10

Khố phân loại các lồi của chi thường gặp trên lương thực và các sản pham cĩ nguồn gĩc thực vật khác:

la Khuan lac ( KL ) cĩ màu trăng, đen, vàng, nâu hoặc xám 2

1B: 1L 165 TH xũnh lỗ Cay cuc enagta Cua G031 65ã5668120266264008i64635 8

2b Khối conidi màu vàng, một sĩ ngä màu nâu hoặc đen 3 3a Khối conidi cĩ màu nâu tối đến màu đen A.niger 3b Khối conidi khơng cĩ màu nâu, tối hoặc màu đen nhưng cĩ màu

Ợïu, au Vane hodC NEA MAU NAUsisesscvavevserrscecevssescseraseversvesscovescereund

4a Khơi conidi dạng cột thường cĩ màu nâu qué đến màu nâu hong

§Ìhrlk:aaadđaiaiiaiaiiiiaiiâẳ A, terreus

4b Khối conidi khơng cĩ dạng cột màu vàng hoặc nâu Š

Sa Khoi conidi mau ơliu đến nâu sáng, cuống khơng màu hoặc vàng nhạt thường sinh tế bào Hũile -.- - << 2 << 2< z2 =<<<5< s2 A ustus

5b Khối conidi khơng cĩ màu ơliu đến nâu sáng, stipe khơng màu hoặc

vàng nhạt khơng sinh tế bào Hũlle - :ccccc cccc c2 n2 n3 căi 6

6a Khối conidi cĩ màu vàng rong, conidi nhan đến rap

1:0 A, ochraceus

6b Khối conidi mau nau vang, conidi khéng nhan hay rap min 7

Ja Conidi duoc tơ điểm rõ nét băng các mụn cĩc và mấu nhỏ, vách

ngồi và trong cĩ thể phân biệt rõ - A, tamarii

7b Conidi hầu hết ráp, vách trong và ngồi khơng thể phân biệt

CƯ Ơ th ga GD v4 066441663) EVEKLVKETEGGGSEKEEEeA“Zdserees eeessasexeesuulfx“HIDHEEE

8a Conidiophore mau nau điển hình, cĩ mặt tế bào Hũlle và dạng hữu

8b Conidiophore khéng cé mau nau dién hinh, khéng cĩ dạng hữu tính

PPE OIE es cco ea ice a a ene a cia a ce ra ate a eer rer 9

11

9a KL trên Czapek hoặc MEA hầu như bị giới hạn (đường kính KL

9b Khuẩn lạc phát triển nhanh hơn, ñ0 kinh > 1,5 GÌ Il

10a KL có màu thay đổi, khối conidi 2 tầng, đôi khi có tế bào

TT ga on can GHI G(40600/8461034632000315006910/2186809/4G010085000/406000011/4/00000950056010340 giai A, versicolor

10b KL mau xanh lá cây xám, khối conidi | tang, trén MEA, Czapek phat triển rất giới hạn, nghèo bào tử, trên các môi trường nước hoạt tính thấp,

phát triển tốt hơn, tế bào Hủlle không có - - A penicilloidles

11a Trên môi trường nuôi cấy già hoặc các môi trường nước hoạt tính thấp, có giai đoạn hữu tính Zuro/ium màu vằng A, glaucus

11b Khéng cé dang hitu tinh uzofiuzm màu vàng 12 12a Khôi conidi màu xanh lã cây-vàng tới màu xanh lá cây-vàng

12b Khối conidi xanh da trời tới màu xanh lá cây tối 15

13a Khoi conidi cha yéu | tang, conidi mau xanh lá cây-vàng tôi, có

13b Khối conidi 1 hoặc 2 tầng -. - 2S SS s32 14 14a Conidi co gai nho, xanh là cây VÀnG.: eva scccecocces.s-ea A flavus 14b Conidi ráp hoặc nhắn không có quy luật, mau ôliu-xanh lá cây

"1: 00111313 A, oryzae

15a Khéi conidi hình cột, bọng hình chuỳ rộng, conidi ráp đến có Thun 0n v20 n6 66006500000C0606304G3348455)VSSSIGSGWNSSVGWHSMEQuNESssp A, fumigatus

15b Khéi conidi không có dạng cột, bọng hình chuỳ hẹp, thành

MAAN eee e cece cee ce cee sceeeuceecceuecaceeeeeeeeeeeeesegeeeeeeereeens A, clavatus

1.1.3.2 Chi Penicillium Link ex Fries

Chi Penicillium thudéc ho Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp nam bat toàn, trong hệ thống phân loại hình thái Saccardo 1886

12

Chỉ Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau :

Khuẩn lạc thường phát triển nhanh, thường ngả màu xanh lá cây, đôi khi có màu trắng, chủ yếu cấu tạo bởi một lớp dày các conidiophore

Conidiophore có thể mọc lên từ cơ chất, từ các sợi khí sinh, từ các sợi

bò lan trên mặt thạch, hoặc các bó sợi thăng đứng chặt hay lỏng

Conidiophore không màu thành nhẫn hay ráp, chúng có thể đơn độc hoặc kết

thành bó, câu tạo gồm một stipe đơn và được kết thúc hoặc bằng một vòng

xoắn của các thể bình (phialide), đây là câu trúc chỗi 1 vong (mono

verticillate) hoặc bằng các chỗi đa vòng, có các nhánh và metulae (các nhánh gần đoạn cuối mang một vòng phialide) Tất cả các tế bào giữa metulae va stipe được xem như là các nhánh

Kiểu phân nhánh: có thé một giai đoạn phân nhánh (biverticillate), 2 giai đoạn phân nhánh (terverticillate) hoặc 3 (quaterverticillate) tới nhiều hơn

các giai đoạn phân nhánh Các thể bình thường có hình chai, với phần đáy

hình trụ và phần cô đặc trưng hoặc dạng mác, phần đáy hẹp nhiều hay it, thon

nhỏ tới một đỉnh khá nhọn (Acerose) Conidi sắp xếp thành dạng chuỗi dài,

khô, phân ly hay dạng cột, có dạng hình câu, elip, hình trụ hoặc hình thoi,

không màu, hoặc hơi xanh lá cây, thành nhẫn hoặc ráp Một số loài tạo hạch

nam (Sclerotia)

Trang thái hữu tính : Eupenicillium, Talaromyces, Hamigera va cac chi

khac

Nhiều loài của chi Đenicillium là những tác nhân lây nhiễm phố biến

trên nhiều cơ chất khác nhau và đồng thời tiềm ân khả năng sinh độc t6 nam mốc Do vậy việc nhận diện chính xác là vấn đề quan trọng khi nghiên cứu

khả năng lây nhiém do chi Penicillium Viéc nhan diện các loài của

Penicillium da duoc Raper va Thom (1949) thực hiện, chủ yếu dựa trên cơ sở

các đặc điểm nuôi cây, nhưng các đặc tính này cũng đã được chứng minh là

15

khá dễ thay đổi Các đặc tính hình thái thuần chủng có thể được dùng cho việc

phân loại, ngoài ra các đặc điểm như tý lệ phát triển, nước hoạt tính ở các môi

trường và nhiệt độ khác nhau cũng hỗ trợ cho việc xác định loài ( Pitt, 1979), Việc sử dụng các dữ liệu về các chất chuyên hoá thứ cấp cũng cho thấy có giá

tri cho viéc nhan dién (Frisvad, 1981, 1985; Frisvad va Filtenbord, 1983;

Lund & Frisvad, 1994 ) nhiều mô tả chi tiết và các khoá phân loại của

Penicillium cũng đã được công bố ( Pitt 1985),

Hinh 1.3: Cau tric sinh conidi dang chéi cia chi Penicillium Một số loài tạo các chất tiết và mùi sẽ giúp nhận ra vị trí phân loại của chúng, nhưng một điều cần lưu ý là hít phải bào tử và các chất bay hơi có thé

bị stress, gây ảnh hưởng tới sức khoẻ Tuy nhiên gây bệnh ở người chỉ một

loài duy nhất của chỉ gây bệnh cơ hội là P zarnefei [4 22]

Nuôi cấy để nhận diện :

Samson va Pitt (1985) dé xuất nên cấy các chủng ở 3 điểm trên môi

trường CYA (Czapek Yeast Agar) và MEA (2%) ủ ở 25C, tối hoặc sáng Tuy

nhiên nuôi cấy trên môi trường Czapek cũng cho kết quả hợp lý Một điểm lưu ý rằng sự phát triển không điển hình và các chất màu của các loài

Penicillium trên CYA và Czapek có thê xuất hiện, thường là do thiếu các vết

kim loại nặng, đặc biệt là đồng Khó khăn có thê được giải quyết khi bỗ sung

thêm dung dịch đồng hoặc kẽm Các đĩa Petri thuỷ tinh cho kết quả tốt hơn so

với các đĩa Petri nhựa, khi nuôi cây bằng các chủng khô (bào tử khô) Hầu hết

các loài hình thành bào tử sau 5-7 ngày Một số loài thuộc nhóm

Terverticillate Penicillium, khi su dung moi truong CREA (Creatine Sucrose

Agar) cũng rất hiệu quả trong việc phân biệt các loài có mối quan hệ rất thân

thudc Cac loai Penicillium Terverticillate thudc chỉ P aurantiogriseum/ verrucosum complex la rất khó xác định khi chỉ dựa trên cơ sở các cấu trúc

hình thái của chúng Khóa phân loại dưới đây sẽ trợ giúp bỗ sung cho sự nhận

điện loài

Khoá phân loại các loài phổ biến của chỉ Đenicillium trên các cơ chất

chết có nguồn gốc thực vật như các loại hạt lương thực :

1a Khuẩn lạc màu trắng ( hoặc xanh lá cây xám nhạt) « 2

Ib KL ngả màu xanh lá cây, đôi khi hệ sợi khí sinh màu vàng 3

25, KODIMOD ROE CG SUPE II: ona ncacensensxwnmnnnnwewenewnaee P, camemberti

2b Conidiophore có stipe nhẫn - - : - : - -:-‹- P nalgiovense

3a KL trên môi trường Czapek phát triển và hình thành bào tử nghẻo

nàn, conidiophore ngắn với phialide lớn đặc trưng (dài 12-20 wm, conidi hinh

elip đến hình trụ là căn nguyên gây thối lụi quả họ cam chanh P digitatum

3b KL trên Czapek phát triển và hình thành conidi phong phú, conidiophore với stipe dài đặc trưng và phialide bé hơn (5-12 wm) 4

4a Conidiophore một vòng (đơn giản, không phân nhánh) P giabrum 4b Conmdiophore phan HHˆDDN:cccscoaicviiávxceecci462464646684406448634 60 5

5a Phialide hình kim, conidiophore chủ yêu kết thúc bằng vòng

metulae và phialide (biverticillate) đôi khi có chổi 3 vòng (terverticillate) 6

§b Phialide hình chai, conidiophore 2 vòng, 3 vòng đến 4 vòng 8

l§

6a Khuan lac phat trién nhanh, đường kính lớn hơn 1.,Š cm trong | tuần

trên mỗi trƯỜN: NA koeeveoeeeceo ni iuebiboiciGesast6biovio li043020630 P funiculosum

6b KL bị giới hạn, ĐK < 1,5 cm trong I tuần trên môi trường

9a Khuân lạc bị giới hạn trên MEA, hầu hết có ĐK < 1,5 cm trong |

bưu, mộ re) 60 TARY VIE er seca sewn sexcesecarawseracaxcovsmmenmeveqanvan: P.citrinum

9b Khuẩn lạc có ĐK > 1,5 em trên MEA trong | tuân, mặt trái xanh lá cay tOi toi den nhat cccecceeeceecececceeeeceeseeceececeee: P corylophilum

10a Conidiophore có stipe nhẵn trên Czapek & MEA; đôi khi có thành

Tập trên Nga Bhng bi D D4 QGXEDDDERISNENGSERSIGAIE%SIGBSIEDIEISSEEEIEESSIEEVGER iI

10b Conidiophore cé stipe hoi rap téi rap nhiéu hodc g6 ghé (mun

lla Conidiophore lon, cdc stipe réng 4-6 um kết dày chắc, khuẩn lạc

hau hét Dị BIỂI DÑ z8 26724601503 001 N09 5001660520000 000185888 P brevicopactum

11b Conidiophore với các stipe rộng 2,5-4 cm, khuẩn lạc phát triển

tương đối nhanh .- c c 22222211222 2223121282111 1 152x153 eg 12

12a Khuẩn lạc dạng nhung, thường có giọt tiết và mặt trái màu vàng,

conidi có đạng hình cầu tới elip - -‹ P chrysogenum

12b Khuẩn lạc có conidi kết cụm, không có giọt tiết màu vàng, conidi Hình:s 3y eên, cll tổi BẦN PP cua võng vi gũ 000904 986XESNM.GISSSARD0A30001-034848088 13

13a Thể bình ngắn, chiều dài < 6,5 um, conidiophore thường có cầu trúc 4:vòng (quatorVErtIGIIBĂE so cossscseeebseveaekeaniesaerienasravise P griseofulvum

I3b Thể bình đa số có chiều đài > 6,5 im, conidiophore 3 vòng /4

16

14a Khuẩn lạc có DK 4-5 cm sau 14 ngay, conidi hinh cau dén elip, tac

14b Khuẩn lạc có DK 2-2,5 cm sau 14 ngày, conidi có dạng hình elip đến hình trụ, tác nhân gây thối quả họ cam chanh - /#alicum

13a, Cond! G6 Gal (BGHITIIREET:scesavasscdssacssaaswucese P echilulatum

15b Conidi nhẫn đến hơi ráp (ráp mịn) - -. -‹ 16 lóa Conidiophore với stipe gồ ghê mụn cóc, conidi hình cầu ĐK 4-5

um, khuan lạc dạng nhung, không tạo mùi, mặt trai khuân lạc xanh lá cây tối

Be Fi ếố ẽẽ ốc P roqueforti

lób Comidiophore với stipe ráp nhưng không xù xì dạng mụn cóc,

conidi hình cầu tới elip, DK 3-4,5 um, khuẩn lạc kết cụm, thường tạo mùi,

TiSt trải Không bố Triển xinh lỗ Đầy TÔ acid co bo ni Go 02XEGA 00046920155 068.0022d9584 17

17a Khuan lac voi hé soi mau vang, giot tiết màu vàng cam

AG puva ca che t0 090122 40 00009 24449028087061816:60800606.0205606/66 ee P, hirsutum

I7b Khuân lạc không có hệ sợi màu vàng và giọt tiêt màu vàng cam

18a KL trên các môi trường thông dụng Czapek & MEA , ở 25C, 7

ngay co DK < 10mm, mau vàng-xanh lá cây nhạt, conidi có ĐK (2,5)2,8- 3,2(3,5) pm, Ít khi lớn hơn kích thước trên ‹-:-‹ P verrucosum

18b KL trén Czapek & MEA 6 25°C, 7 ngay, DK > 10mm Í 9

19a Conidi có DK tương đôi bé (2,5)2,8-3,2(3,5), hình elip có chiều

đài tới 3,5(4,0)um, phát triển yếu trên môi trường CREA, tạo acid, không tạo

19b Conidi tương đối lớn có ĐK 3-4(5)um, dạng hình elip có chiêu dai

tới 4,5-6 um; phát triển tốt trên CREA, thường tạo cả acid và base 2

20a KL màu xanh lá cây xám trên MEA Conidi hình gần câu tới elip,

phát tiền nghÉo trên CA sccccccoccccoEiỎ0EL.00ycnaueni P aurantiogriseum

đã cho thấy tỷ lệ nhiễm A flavus kha cao (90%) Tuy nhiên do thiếu chất

chuan aflatoxin tac gia chi phát hiện được aflatoxin G; trên các mẫu dược liệu

nàn nghệ và ngưu tất đã nghiên cứu

Công trình nghiên cứu gần đây nhất (1/2003) của tác giả Trần Trịnh Công [2] nghiên cứu về mức độ nhiễm nắm mốc và aflatoxin Bị trên một số

vị thuốc đông dược đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội Kết quả của công

trình đã cung cấp cho chúng ta những bằng chứng cụ thể về mối đe dọa tiêm

tàng của nằm mốc và độc tổ aflatoxin, nhất là các vị thuốc có nguồn gốc quả

và hạt Trong số 6/15 vị thuốc có nguồn gốc quả, hạt mà tác giả nghiên cứu đã phát hiện thấy 4 vị thuốc là nguồn cơ chất rất phù hợp cho các loài nâm sinh

độc tố phát triển Vị thuốc đầu tiên là hạt sen, một loại hạt được dùng phô

biến từ lâu đời đã bị nhiễm loài 44 Zzvus trung bình tới 40% trong các mẫu

tác giả nghiên cứu Đặc biệt hơn tác giả đã phát hiện thấy 4/20 mẫu hạt sen

lấy ở các hiệu thuộc đông dược và các chợ thực phẩm bị nhiễm aflatoxin Bị với hàm lượng dao động 17,5-434 ppb (ng/g) Trong khi đó giới hạn toi da của độc tố này trên lương thực, thực phẩm mà ngành y tế cho phép chỉ là IOppb Hai vị thuốc khác trong số 6 vị thuốc có nguồn gốc qua, hạt là ngũ vị

tử và phá có chỉ đã bị nhiễm loài 4 miger với tỷ lệ lần lượt là 91 và 30,6%

Đây là một loài tuy không phải là loài nguy hiém nhu 4, flavus hay A

parasificus nhưng cũng có khả năng sinh aflatoxin VỊ thuốc cuối cùng trong

số 6 vị thuốc trên là bá tử nhân cũng cho thấy đây là cơ chất đặc trưng của

một loài nào đó thuộc chỉ Đenicilliwm, chì nam mà theo các nhà nghiên cứu

độc tô nâm trên thê giới là có khả năng sinh nhiêu mycotoxin có hại cho

19

ngudi va dong vat [S, 14] Ngoai ra, trong nhirng nam gần đây cũng có một số

công trình nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định hệ vi nắm

trên các vị thuốc đông dược nói riêng và dược liệu nói chung [1, 2, 3, 7, 8, 10,

I1, 12, 15] Đáng chú ý là công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hồng

Liên về mức độ nhiễm các loài thuộc chỉ Penici/lium trên một số vị thuốc

đông được [8] và công trình nghién ciru vé loai Aspergillus va doc t6 aflatoxin

của các tác giả Phan Thị Bích Vân, Nguyễn Thị Lý, Mai Thị Ánh, Phùng Kế Toại [15, 10, 1, 14].