Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội

Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH BÌNH

NGHIEN CUU HE VI NAM TREN CAC

VỊ THUÓC TỤC ĐOẠN VÀ THẠCH XƯƠNG BÒ ĐANG LƯU HÀNH TẠI CAC HIEU THUOC DONG DƯỢC

THUOC DIA BAN HA NOI

KHOA LUAN TOT NGHIEP DUOC SI

HÀ NỘI - 2011

BỘ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH BÌNH

NGHIEN CUU HE VI NAM TREN CAC

VI THUOC TUC DOAN VA THACH

XUONG BO DANG LUU HANH TAI

CAC HIEU THUOC DONG DUOC

THUOC DIA BAN HA NOI

KHOA LUAN TOT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dan: Th.S Tran Trịnh Công

Nơi thực hiện : Bộ môn Vị Sinh — Sinh học

HÀ NỘI - 2011

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

Th.S Trân Trịnh Công

Giảng viên bộ môn VI sinh- Sinh học, trường Đại Học Dược Hà Nội-

người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi những kiến thức quý báu

trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ thuật

viên bộ môn Vị Sinh — Sinh Học, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa

luận này

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà

trường cùng toàn thể các thầy cô trường Đại Học Dược Hà Nội đã trang bị

kiến thức, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè

đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 201 ]

Sinh viên

PHAM THANH BINH

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

KY HIEU VIET TAT

Danh muc cac bang

Danh muc cac hinh

7.0.0 6) 20001077 1

1.1.Các nhóm nắm thường gặp trên các sản phẩm có nguồn gốc thực vật 3 1.1.1.Ngành nắm tiếp hợp —ZygO/+yCOfA 55-555 Secscecs+e se cecsree, 3 1.1.1.1.Các đặc tính quan trỌng -« «s12 555551 s2 3

1.1.1.2 Nuôi cây dễ nhận diện 22s £+EzEzEzzxcerererecee 5

1.1.2 Nhóm nắm bắt toàn —Ï£Uf€FOTIyC€f€S .c- cececccce vs scsesecee 6 1.1.2.1 Chi Aspergillus Micheli ex FTrles -. c2 6

1.1.2.2 Chi Penicillium link €X Fries Son vy 12

Nal .sscccesescccsssccsscecsecesescueescteesscseescseseseeeeseteneetenescseesceeeseseneesenenscees 14

PHAN II : ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu VA thiét Dice cecscecsesessesscscscsesssteeecsssseeeses 16 2.1.1.Đối tượng nghiên cỨu - - + + + 2 sec 2E xxx rxrkc 16 2.1.2.Môi trường phân lập và xác định nắm mốc - 5-5 52 <¿ 16 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm oo eesescseseessesescsssessseeeseeseessees 16

1.2 Nội dung nghiÊn CỨU Gv v4 17 2.2.1 Phân lập, phân loại các chủng nắm nhiễm trên 10 mẫu của vị

thuốc tục đoạn 1140009080) 0010108 17

2.2.2 Phân lập, phân loại các chủng nắm nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc thạch xương bồ nghiên cứu - ¿%2 2 s6 +z£zE*£E£e£xzkreerzei 17 2.3 Phương pháp nghiÊn CỨU - - 2S S211 111115351153 111555515555 17 2.3.1 Phuong phap lay mau cccccccescscscsesescsescsessssssssscesessscscsessscsees 17

2.3.2 Phương pháp xác định hàm âm được liệu . 5s «<<: 17

2.3.3 Phương pháp phân lập nắm mốc - +22 25s s+szsz£z£s¿ 17 2.3.4 Phương pháp phân loại nắm mốc + + 2 sex £s£eeei 18

PHAN III: KET QUA NGHIEN CUU, NHAN XET VA BAN LUAN 19

3.1 H6 vi nam trén vi thudc tuc Goan .ccccccccccsccesessececscesesessecececseesesseeeees 19 3.2 Hệ vi nắm trên vị thuốc thạch Xương ĐỒ 0 2G ng re reeeeed 31

PHAN IV: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, 2 5< 5S rersrsrsed 43

AL K€t Ua 43

4.2 Kin nghinc cccccesesecscsssscsesescececsvscsssssessevscscevevavscssesecsvavscevevsceesesesess 44

TAI LIEU THAM KHAO

: Aspergillus flavus and parasiticus Agar

: Corn Meal Agar : Creatine Sucrose Agar : Dichloran 18% Glycerol Agar : Malt Extract Agar 4%

: Potato Dextrose Agar : Dược điển Việt Nam IV : đường kính

: khuẩn lạc

: Lãn Ông

Danh mục các bảng

Bang 1: Các chi, loài và số chủng nắm phân lập được từ các mẫu của vị

thuốc tục đoạn nghiÊn CỨU - 6s xxx 3E cv x cv ưgvgecxe 20

Bảng 2 : Các loài và số chủng phân lập được từ 10 mẫu tục đoạn

014011900911 08 21 Bảng 3: Các chi loài và số chủng nắm phân lập được từ các mẫu của vị

thuốc thạch xương bồ nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 4: Các loài và số lượng chủng phân lập được từ 10 mẫu thạch xương

DO nghiÊn CỨU - G5 s s19 cư S99 5 1 1u vn 33

Danh mục các hình

Hình 1: Đặc điểm hình thái của chi JÈÏuiZØJ1s 5 sec se sesececse 4

Hình 2: Cầu trúc sinh conidi của chỉ AspergiÏÏius 5-5555 csscseseseseee 8

Hình 3: Cấu trúc sinh conidi dạng chỗi của chí Penicilliwm 13

Hình 4: Loài A ƒlayws nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: s-s «sex s2 23 Hình 5: Loài A fưzmigafus nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: . 24

Hình 6: Loài A clayøfus nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: scss 25 Hình 7: Loài Alfernaria alfernafa nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: 26

Hình §: Loài Cunninghamella berthollefiae nhiễm trên vị thuốc tục đoan: 27

Hình 9: Loài Curyularia lunafa nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: 28

Hình 10: Loài Trichoderma sp nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: - 29

Hình 11: loài P cWrinwrma nhiễm trên vị thuốc tục đoạn: . cs- 30 Hình 12: Loài A #ømarii nhiễm trên vị thuốc thạch xương bồ 35

Hình 13: Loài A øiger nhiễm trên vị thuốc thạch xương bồ: 36

Hình 14: Loài A ƒưmigafus nhiễm trên vị thuốc thạch xương bồ: 37

Hình 15: Loài Absidia corymbifera nhiễm trên vị thuốc thạch xương bồ: 38

Hình 16: Loài A s£s nhiễm trên vị thuốc thạch xương bồ: 39

Hình 17 Loài A aculeafus nhiễm trên vị thuốc thạch xương bà: 40

DAT VAN DE

Hiện nay ở nước ta thuốc y hoc cé truyén và các chế phẩm đông

dược đa số có nguồn ốc thực vật [13] Và với những tính năng ưu việt của

nó, người tiêu dùng ưa thích sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên

phục vụ cho nhu cầu khám chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe của mình Bên

cạnh đó, các phương pháp, phương tiện chế biến, bảo quản được liệu còn

nghèo nàn lạc hậu, cùng với điều kiện khí hậu âm nhiệt đới như nước ta thì điều đó làm cho dược liệu, các vị thuốc được liệu và các sản phẩm có nguồn

gốc thực vật rất dễ bị nắm mốc xâm nhiễm và phát triển Ngoài việc làm

giảm chất lượng thuốc như giảm hàm lượng hoạt chất, tính bột do bị biến đổi thành phân hóa học, bị biến màu, sinh mùi khó chịu, nằm mốc còn sinh ra

các độc t6(mycotoxin) - day la san pham chuyén hóa thứ cấp độc của nắm,

gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu đùng Các độc tố nắm gây ra các loại

bệnh khác nhau trên người và động vật gọi chung là những bệnh do độc tố nam (mycotoxicoses), với những tác động khác nhau có thể dẫn tới ung thư,

quái thai |4; 19] Trong các mycotoxin thì độc tố aflatoxin - nguy hiểm gây

ra ung thư gan [6; 15]

Bên cạnh những vai trò to lớn mà hệ vi nắm mang lại thì qua những vẫn đề được nêu trên chúng tôi thấy nắm là nhóm sinh vật có ảnh hưởng quan trọng đối với chất lượng và độ an toàn của được liệu Tuy nhiên đối với mỗi

loại nắm thì có ảnh hưởng khác nhau tới dược liệu Do vậy việc điều tra hệ vi

nắm trên từng cơ chất là một việc hết sức quan trọng, mang tính quyết định trong việc tìm ra những biện pháp phòng tránh các tác hại nêu trên

Với mục đích và ý nghĩa đó chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài

này:

“Nghiên cứu hệ vì nắm trên các vị thuốc tục đoạn và thạch xương bô đang lưu hành tại các hiệu thuốc đồng được thuộc địa bàn Hà Nội

Với mục tiêu sau: Phân lập và phân loại các chủng nắm nhiêm trên hai vị

thuốc tục đoạn và thạch Xương bô đến cấp chỉ và loài

PHẢN I: TÔNG QUAN

1.1.Các nhóm nắm thường gặp trên các sản phẩm có nguồn gốc thực vật

Các cơ chất có nguồn pốc thực vật như các loại hạt, lương thực, cơ chất

thực vật chết .thường có mặt những nhóm nắm quan trọng như nhóm nắm bat toan (Fungi Imperfecti hay Deuteromycete), nganh nam tii (Ascomycota)

và ngành nam tiép hop (Zygomycota) Trong pham vi công trình này chúng tôi xin trình bày một số nét chính của 2 nhóm nắm quan trong : nam bat toan

và nắm tiếp hợp

1.1.1.Ngành nắm tiếp hợp -Zygomycota

1.1.1.1.Các đặc tính quan trọng

Đây là nhóm nắm khá phổ biến trên lương thực, được thảo .Đặc điểm

chung của nhóm nắm này là có hệ sợi nắm cộng bào, các vách ngăn chỉ được hình thành dé phân chia các tô chức đặc biệt như nang bào tử Có dạng sợi

điển hình phân nhánh, không có vách ngăn, có nhiều nhân Bào tử tiếp hợp

được hình thành từ các hệ sợi hữu thụ, bào tử có vách dày, chắc và được goi

là bào tử tiếp hợp (zygospore) Phân bố rộng rãi, đa số hoại sinh trong đất,

trên phân động vật ăn cỏ, hoặc hoại sinh gây mốc thức ăn, đặc biệt là các sản

phẩm giàu tính bội

Sinh sản vô tính bằng các bào tử nang (sporangiospore), được nội sinh trong các nang hình cầu hoặc hình quả lê có hoặc không có bọng hoặc phân trung tâm bên trong nang (colummella), tiếp nối bởi một cuống nang (sporangiphore), hoặc các bào tử vô tính được sinh ra trong các nang bào tử chuỗi (chúng được phân ra thành một hàng các bào tử chuỗi- merospore) Nang bào tử chuỗi (sporangium) không có trụ nang (colummella)

Sporangiole (các nang bào tử thường có hình cầu, với một hoặc một số ít

bào tử và colummella bị tiêu biến) bắt gặp ở các họ Thammidiaceae,

Cunninghamellaceae và Choanephoraceae Một số chi được đặc trưng bởi cầu trúc apophysis (phần phồng lên của cuống nang, ngay sát bên dưới

nang) Sợi bò (stolon) có thể xuất hiện- là các sợi đặc biệt nằm trên bề mặt

thạch và sinh các cuống nang (sporangiophore) Các sợi bò này dính vào cơ

chất băng các sợi giống như rễ gọi là rễ giả - rhizoid [Hình 1] Một số loài

sinh các bào tử thành dày - chlammydospore, hoặc các bào tử thành mỏng —

oidium thường có hình cầu, chúng có thể được sinh ở cuối sợi, xen kẽ, đơn độc hoặc thành chuối

Hình 1: Đặc điểm hình thái của chi Rhizopus

Ré gia (rhizoid) ,sợi bò (stolon), va nang bao tur (sporanginum)

(Sharma ,1998)

Sinh sản hữu tính xuất hiện bằng sự tiếp hợp của các nang giao tử đa nhân, đơn bội - gametagium và kết quả cho ta một bào tử tiếp hợp -

ZVgospore thành dày màu vàng tới nâu hoặc đen, thường được bao phủ bởi một lớp các gai nhọn và các cấu trúc lôi ra khác Hai phần sợi ở hai đầu kết thúc của bào tử được gọi là cuống noãn (suspensor) Các cuống noãn này có thể giống nhau hoặc khác nhau về hình dạng và kích thước Đôi khi cuống

noãn hình thành các phần phụ hay mẫu (như ở một số loài của chỉ Abs¿đia)

Hầu hết các thành viên của nhóm này là các sinh vật hoại sinh, tuy

nhiên một số loài thường gây hại các loại nằm khác, gây các bệnh ở người và thực vật Bệnh do nấm Äcorales gặp chủ yếu ở các chi Rhizopus,

Rhizomucor, Cuninghamella [22| Bên cạnh đó một số loài của Mucor và

Rhizopus có vai trò quan trong trong lên men thực phẩm và sản xuất các acid

hữu cơ, nhưng nó cũng gây thôi rữa các loại rau, quả chín sau thu hoạch

1.1.1.2 Nuôi cấy dễ nhân diện

Các chủng của nhóm nắm này thường được nuôi cấy trên môi trường MEA (Malt Extract agar 4%) trong các đĩa pctri nhựa Đối với chỉ Mucor, việc nuôi cấy như vậy không tạo ra sự phát triển không bị xáo trộn do phát

triển quá mức (Schipper,1973) Nhiệt độ nuôi cấy thay đổi từ 20°C đối với chi

Mucor, dén 20-30°C déi véi chi Rhizopus va Syncephalastrum va x4p xi 36°C đối với chí Absiđia Tất cả các loài được nuôi cấy trong môi trường tối trong vòng 1 tuần Để tạo điều kiện cho sự phát triển bào tử tiếp hợp, môi trường,

nhiệt độ thường được luân phiên Các bào tử tiếp hợp sẽ phát triển ở vùng có

sự tiếp xúc ghép đôi.)

Khóa phân loại một số chỉ phố biến trên các loại hạt lương thực :

Hesseltine va Ellis (1973) chia ho Mfucoraceae thành 20 chi trong do chi

Rhizopus va chi Mucor 1a quan trong nhat

la Bào tử nang được hình thành trong các nang chuỗi bào tử -

merosporangium bao phủ xung quanh một bọng (phần cuối phồng lên của giá nang-sporangiophore) 9C@phalastrum 1b Bào tử nang được hình thành trong các nang hình cầu hoặc hình quá lê có lõi nang — colummela -. ‹ - << «<< << sec s< 2+ +2 2 2a Các nang và giá nang có màu tối, giá nang hầu như không phân nhánh,

thường xuất hiện thành nhóm.Đường kính ĐK nang thay đỗi từ 50-360 wm

Bào tử thường CÓ SỌC n0 HH nu nh vxa Rhizopus 2b Các nang và giá nang không có màu hoặc chỉ có màu nhạt, thường phân nhánh nhiều ĐK các nang không bao giờ vượt quá 100m Bào tử thường

|.4i10)015ã9 8-19 xiaadiidaddidiẳŸŸ 3 3a Các nang hình quả lê với một apophysIs đặc trưng, ĐK 10-40zm (các nang cuối cùng có đương kính tới 80m ) .-.⁄- cc<5- << 555 Absidia 3b Các nang hình cầu không có apophysis, hầu hết có đường kính lớn hơn

1.1.2 Nhóm nấm bắt toàn — Deuteromycetes

Deuteromycetes hay nam bất toàn bao gồm các tác nhân lây nhiễm thực phẩm quan trọng , nhiều loài có thể sinh các chất chuyển hóa độc Lớp này gồm các dạng chỉ và loài chỉ có trạng thái sinh sản vô tính (trạng thái conidi hay vô tính) là đã biết Sau đây chúng tôi xin trình bày đặc tính của hai chi quan trong la Aspergillus va Penicillium

1.1.2.1 Chi Aspergillus Micheli ex Fries

Chi Aspergillus do Micheli mé6 ta dau tién nim 1729, sau đó được Fries

chấp nhận năm 1832 và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chí Aspergillus chinh thitc mang tén Aspergillus Micheli ex Fries [24]

1.1.2.1.1.Cac dac tinh quan trong cua chi Aspergillus:

Khuân lạc thường phát triên nhanh, có màu trăng, vàng, nâu vàng, nâu tới màu đen, hoặc ngả màu xanh lá cây, chủ yêu được câu tạo bởi một lớp dày của các conidiophore thăng đứng

Conidiphore (thường không phân nhánh) được cấu tạo bởi một cuống (stipe) không phân nhánh, có phần đỉnh phông to gọi là bọng (vesicle) Thể

bình (phialide) được sinh trực tiếp trên bọng được gọi là thể bình một lớp (uniseriate), hoặc trên cuống thể bình (metulae) là thể bình 2 lớp (biseriate) Bọng, thể bình, cuống thể bình (nếu có mặt ) và conidi hình thành một khối

conidi (conidial head) Conidi ở dạng chuỗi khô có thể hình thành dạng cột (columnar) hoặc dạng phân ky (radiate) Conidi (conidium) chi gom một tế bào, bề mặt nhẫn hoặc xù xì, có gai, không màu, hoặc có màu Một số loài có

thể sinh tế bào Hulle cell có thành nhẫn, dày đơn độc hoặc thành chuỗi, các

hạch nâm (sclerotia) là các khôi sợi thường có hình câu cứng

Các loài của chỉ Aspergilius là những tác nhân lây nhiễm phổ biến trên các cơ

chất khác nhau [20] Ở các vùng nhiệt đới (như Việt Nam ) và cận nhiệt đới,

sự xuất hiện của chúng phổ biến hơn tất nhiều so với các loài của chí

Penicillium Một số loài đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt do chúng là

những tác nhân gây bệnh ở người và động vật hoặc khả năng sinh các chất chuyển hóa thứ cấp độc như aflatoxin thường gặp ở A ffavus và A parasiticus Thé nhiém nam được chú ý nhiều nhất là u nấm phổi do Aspergillus Loài gây bệnh nhiều thứ nhất là Aspergilius fmigafus Một số loài khác có tâm quan trọng trong việc lên men các sản phâm truyền thông

phương đông hoặc các ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ hoặc

enzyme [20; 24]

“oi liên

stenemata

‘Otani nhu Mứ ~

Hình 2: Cấu trúc sinh conidi của chỉ Aspergillus

Việc phân loại chi Aspergillus chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình

thái, và quan trọng là dựa vào cấu trúc khối conidi, màu sắc conidi Raper & Fennell (1965) đã chia chi này thành 18 nhóm (group) và đã chấp nhận 132 loài với 18 thứ

Rapper & Fennell (1965) đã chia nhỏ chí Aspergilfus thành các nhóm

Sự phân chia đưới chi này không có vị trí trong mã danh pháp thực vật quốc

tế, bởi vậy Gams & cộng sự (1986) đã thay các đơn vị group bằng các

“Subgenera” va “Section”

Trong phạm ví công trình này, chúng tôi chỉ giới thiệu ngắn gọn và đưa

khóa phân loại các loài phố biến nhất, đặc biệt là các loài thường nhiễm trên

lương thực, sản phẩm có nguồn pốc thực vật Do vậy để có thể nhận diện

chính xác các chủng quan trọng cần tham khảo thêm các tài liệu khác (Rapper

&Fennell 1965, Samson 1992,1994a& b) Nhu da noi 6 trên, các loài của chi

Aspergillus là những tác nhân lây nhiễm rất phố biến do vậy không có một

danh sách cụ thể các cơ chất mà mỗi một loài được phân lập Các dữ liệu về

phân bố của nhiều loài đã được Domsch và cộng sự liệt kê 1993

Các chỉ dẫn để nhận diện các loài Aspergillus chủ yếu dựa trên các đặc

điểm hình thái khuẩn lạc đã được nhiều tác giả công bố như Pitt& Hocking

(1985), Klich &Pitt (1988a), Tzean & cong sy (1990)

1.1.2.1.2.Nuôi cây để nhận diện :

Các chủng được cấy tại 3 điểm trên môi trường Czapek và MEA 2% và

ủ ở 25C Đối với các loài nắm ưa khô như A penicilloides, một số loài khác

va trang thai htru tinh Eurotium có thể sử dụng các môi trường Czapek và

MEA với 20-40% đường kính Nuôi cấy các chủng tại 3 điểm trên các môi

trường, sử dụng các đĩa Petri thủy tính tốt hơn là sử dụng các đĩa Pctri bằng chất dẻo Hầu hết các loài hình thành bào tử trong vòng 7 ngày Màu và cấu

trúc của khối conidi (dạng cột hoặc phân kỳ) được quan sát tốt nhất bằng kính

hiển vi phân tích Do một số loài của chí Aspergilius có thể gây bệnh ở người

(đặc biệt là A ƒưnigars), nên cần có biện pháp phòng tránh hít phải bào tử

Sau đây chúng tôi xin giới thiệu khóa phân loại các loài thuộc chỉ Aspergilus

thường gặp trên lương thực và các sản phẩm có nguồn gốc thực vật khác :

la Khuẩn lạc (KL) có màu trăng, đen, vàng, nâu hoặc xám 2

Ib.KL ngả màu xanh lá cây - - n1 se 8 2a Khối conidi màu trắng, ướt - -. -‹‹ << <<: A candidus 2b Khối conidi màu vàng, một số ngả màu nâu hoặc đen 3 3a Khôi conidi có màu nâu tôi đên màu đen A niger

10

3b Khôi conidi không có màu nâu, tôi hoặc màu đen nhưng có màu olru, nâu

vàng, hoặc ngả màu nâu - << c2 1n 155% 4 4a Khôi conidi dạng cột thường có màu nâu quê đên màu nâu hông

;i0 1 A terreus

Ab Khéi conidi không có dạng cột màu vàng hoặc nâu 5

5a Khôi conidi màu oliu đên nâu sáng, cuông không màu hoặc vàng nhạt thường sinh tế bào Hữile - - - ccc 222222 A, ustus 5b Khôi conidi không có màu oliu đên nâu sáng, stipe không màu hoặc vàng nhạt không sinh tế bào Hữile - - ¿ - << c5 c2 << c2 6 6a Khối conidi có màu vàng ròng , conidi nhãn đến ráp mịn Á ocbraceus

6b Khối conidi màu nâu vàng , conidi không nhẫn hay ráp mịn 7

7a Conidi được tô điệm rõ nét băng các mụn cóc và mâu nhỏ , vách ngoài và trong có thê phân biệt rõ - c-c ccSS S222 A tamarii

7b Conidi hầu hết ráp, vách trong và ngoài không thể phân biệt

ƯỢC Co QQ Q Ọ ng 9 9 9 5n ng ĐH ĐH HH HH ĐH He ni n ĐH ko g0 và A wentii

8a Conidiphore màu nâu điển hình, có mặt tế bào Hulle và dạng hỡu tính

ETIH€TIC€ÏÏ( CC CC HQ HH 9 3 5 HH HH E62 s2 A nidulans 8b Conidiphore khoéng co mau nau dién hinh, không có dạng hữu tính

ETIH€FIC€ÏÏ( - CC CƠ CƠ 9g 5 H09 0 6 0 06 0 6 0E 6n n0 6625 9 9a KL trên Czapek hoặc MEA hầu như bị giới hạn (đường kính KL thường

<1,5 cm trong Ì tuần) . ‹ c CC S111 1111 11 111 11 x1 xkg 10

9b Khuẩn lạc phát triển nhanh hơn, đường kính >Í,5 cm 11

11

10a KL có màu thay đổi, khối conidi 2 tầng, đôi khi có tế bào

Hulle - 2c cc {s22 <2 A versicolor

0b KL màu xanh lá cây xám, khối conidi 1 tầng, trên MEA, Czapek phát

triển rất giới hạn, nghèo bào tử, trên các môi trường nước hoạt tính thấp, phát

triển tốt hơn, tế bào Hulle không có - -. - - A, penicillioides

I Ta Trên môi trường nuôi cây già hoặc các môi trường nước hoạt tính thâp, có g1aI đoạn hữu tính Eurofium màu Vàng A glaucus I1b Không có dạng hữu tính Eurofium mầu vàng 12 12a Khoi conidi mau xanh 14 cay — vang tới màu xanh lá cây —- vàng

On eeccecccccccceeecuececeeceuecsueecueccteseeceescseeceeseceuesesseseaesereeraeeeas 13 12b Khối conidi xanh da trời tới màu xanh lá cây tối - 15

13a Khôi conidi chủ yêu một tầng , conidi mau xanh 14 cay — vàng tôi, có gai

GGHỊ L cesses eeeeeeneeeee nas A, parasiticus

13b Khối conidi 1 hoặc 2 tầng ‹ - -c‹ cccc cc n1 seg 14

14a Conidi có gai nhỏ, xanh lá cây vàng A flavus 14b Conidi ráp hoặc nhẵn không có quy luật, màu oliu - xanh lá cây

l5a Khối conidi hình cột, bọng hình chùy rộng, conidi ráp đến có

l5b Khối conidi không có dạng cột, bong hình chùy hẹp, thành

12

1.1.2.2 Chi Penicillium link ex Fries

Chi Penicillium thudc ho Moniliaceae, b6 Moniliales, lớp nim bất

toan, trong hé théng phan loai hinh thai Saccardo 1886

Chi Penicillium cé dac tinh quan trong sau:

Khuan lạc thường phát triển nhanh, thường ngả màu xanh lá cây, đôi khi có mầu trăng, chủ yêu cầu tạo bởi một lớp dày các conidiophores

Conidiphore có thể mọc lên từ cơ chất, từ các sợi khí sinh, từ các sợi bò

lan trên mặt thạch, hoặc các bó sợi thắng đứng chặt hay lỏng Conidiphore

không màu thành nhẵn hay ráp, chúng có thể đơn độc hoặc kết thành bó, cầu

tạo gồm một stipe đơn và được kết thúc hoặc bằng một vòng xoắn của các

thể bình (phialide), đây là cấu trúc chổi một vòng (monoverticillate) hoặc

bằng các chéi da vòng, có các nhánh và metulae(các nhánh gần đoạn cuối

mang một vòng phialide) Tất cả các tế bào giữa metulae và stipe được xem

như là các nhánh

Kiểu phân nhánh : có thể một giai đoạn phân nhánh (biverticillate), 2

giai đoạn phân nhánh (terverticillate) hoặc 3 ( quaterverticillate) tdi nhiều nơi

các giai đoạn phân nhánh Các thể bình thường có hình chai, với phần đáy

hình trụ và phần cổ đặc trưng, hoặc dạng mác, phần đáy hẹp nhiều hay it, thon nhỏ tới một đỉnh khá nhon (acerose) Conidi sắp xếp thành dạng chuỗi dài,

khô, phân ly hay dạng cột, có dạng hình cầu, clip, hình trụ hoặc hình thoi,

không màu, hoặc hơi xanh lá cây, thành nhẵn hoặc ráp Một số loài tạo hạch nam (Sclerotia)

Nhiéu loai cua chi Penicillium là các tac nhan lay nhiém pho bién trén nhiêu cơ chât khác nhau và đông thời tiêm ân khả năng sinh d6c t6 ndm moc

Do vậy việc nhận diện chính xác là vân đê quan trọng khi nghiên cứu khả

13

nang lay nhiém do chi Penicillium Viéc nhan dién cdc loai cha Penicillium da

được Raper va Thom (1949) thực hiện, chủ yếu dựa trên cơ sở các đặc điểm

nuôi cấy, nhưng các đặc tính này cũng được chứng minh là khá dễ thay đi Đường kính khuẩn lạc được xác định dễ dàng và cung cấp các thông tin có giá

trị Các đặc tính hình thái thuần chủng có thể được dùng cho việc phân loại,

ngoài ra các đặc điểm như tý lệ phát triển, nước hoạt tính ở các môi trường và nhiệt độ khác nhau cũng hỗ trợ cho việc xác định loài (Pitt,1979) Việc sử

dụng các dữ liệu về các chất chuyển hóa thứ cấp cũng cho thấy có giá trị cho

việc nhận điện (Frisvad,1981,1985; Frisvad và Filtenbord,1983; Lund&

Frisvad, 1994 ), nhiều mô tả chi tiét va cdc khéa phan loai cia Penicillium cũng đã được công bố (Pitt 1985)

Một số loài tạo các chất tiết và mùi sẽ giúp nhận ra vị trí phân loại của chúng nhưng một điều cần lưu ý là hít phải bào tử và các chất bay hơi có thê

bị stress, gây ảnh hưởng tới sức khỏe Tuy nhiên gây bệnh ở người chỉ một

loài duy nhất của chí gây bệnh cơ hội là P marneff&i |4; 25]

Hình 3: Cấu trúc sinh conidi dạng chỗi của chỉ Peniciliurn

Mặc dù vậy cũng có một số công trình đáng chú ý Đó là công trình nghiên

cứu về hệ nắm mốc đặc trưng trên được liệu ở kho của tác giả Nguyễn Thị

Sinh năm 1984 [15] Một số dẫn liệu quan trọng giúp định hướng cho các công trình nghiên cứu tiếp theo về nắm mốc và mycofoxin trên được liệu mà

tác giả đã công bố là: hệ vi nắm đặc trưng trên dược liệu bảo quản trong đó nỗi bật là sự có mặt các loài của 2 chi Aspergillus va Penicillium, dac biệt là

sự xuất hiện của loài A JÏavus trên 80% được liệu nghiên cứu Ngoài ra tác giả

cũng cho biết độ 4m tương đối tối thiểu cần thiết cho sự phát triển của hệ vi

nắm được liệu ở kho là 75%, từ 65-85% các loài thuộc chi Aspergillus chiếm

ưu thê về sô lượng chủng

Một công trình khác mang ý nghĩa thăm dò của tác giả Nguyễn Hữu

Tuấn về sự có mặt của loài A.ffavus và khả năng tạo aflatoxin trên được liệu

đã cho thấy tỷ lệ nhiễm A.ffavus khá cao (90%) Tuy nhiên do thiếu chất

chuẩn aflatoxin tác giả chỉ phát hiện được aflatoxin G2 trên các mẫu được liéu nan nghé va nguu tat đã nghiên cứu

Công trình nghiên cứu gần đây nhất (1/2003) của tác giả Trần Trịnh

Công [7] nghiên cứu về mức độ nhiễm nắm mốc và aflatoxin B1 trên một số

vị thuốc đông được đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội Kết quả của công

trình đã cung cấp cho chúng ta những bằng chứng cụ thể về mối đe dọa tiềm tang của nầm môc và độc tô aflatoxin, nhat là các vị thuôc có nguôn gôc quả

15

và hạt Trong số 6/15 vị thuốc có nguồn gốc quả, hạt mà tác giả nghiên cứu đã phát hiện thấy 4 vị thuốc là nguồn gốc cơ chất rất phù hợp cho các loài nắm sinh độc tố phát triển Vị thuốc đầu tiên là hạt sen, một loại hạt được dùng

phô biến từ lâu đời đã bị nhiễm loài A favus trung bình tới 40% trong các

mẫu tác giả nghiên cứu Đặc biệt hơn tác giả đã phát hiện thấy 4/20 mẫu hạt sen lay ở các hiệu thuốc đông dược và các chợ thực phẩm bị nhiễm aflatoxin

BI với hàm lượng dao động 17,5-434 ppb (ng/g) Trong khi đó giới hạn tối đa

của độc tố này trên lương thực, thực phẩm mà ngành y tế cho phép chỉ là

10ppb Hai vị thuốc khác trong số 6 vị thuốc có nguồn gốc quả hạt là ngũ vị

tử và phá cô chỉ đã bị nhiễm loài A niger với tỷ lệ lần lượt là 91 và 30,6%

Đây là một loài tuy không phải là loài nguy hiểm như A.ffavus hay A.parasificus nhưng cũng có kha năng sinh aflatoxin Vị thuốc cuối cùng trong số 6 vị thuốc trên là bá tử nhân cũng cho thấy đây là cơ chất đặc trưng

của một loài nào đó thuộc chi Penicillium, chi nim ma theo céc nhà nghiên

cứu độc tô nắm trên thế giới là có khả năng sinh nhiều mycotoxin có hại cho

người và động vật [6, 15]

Ngoài ra, trong những năm gần đây cũng có một số công trình nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định hệ vi nắm trên các vị thuốc đông dược nói riêng và dược liệu nói chung Đáng chú ý là công trình nghiên

cứu của tác giả nguyễn Hồng Liên về mức độ nhiễm các loài thuộc chi

Penicillium trên một số vị thuốc đông dược và công trình nghiên cứu về loài

Aspergilius và độc tỗ aflatoxin của các tác giả Hoàng Thị Thanh Huyền ,Phan

Thị Bích Vân, Mai Thị Ánh, Phùng Kế Toại [10,17,1,16]

Bên cạnh đó, có công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Huyền

[9] nghiên cứu hệ vi nắm trên vị thuốc sinh địa và sài hồ nam tại các hiệu thuốc đông dược tại địa bàn Hà Nội cho thấy 2 loại thảo được này chủ yếu

nhiễm các loài thường gặp của chi Aspergillus.

l6

PHÂN II : ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1.Đổi tượng nghiên cứu

Hai vị thuốc tục đoạn và thạch Xương bồ, mỗi vị 10 mẫu được thu thập

từ các hiệu thuốc đông được trên địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông) chuyên về

phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập và phân loại

nắm

2.1.2.Môi trường phân lập và xác định nấm mốc

- Môi trường PDA (g/l): glucose : 20g, Thach: 15g , Khoai tay : 250g,

Dich chiết khoai tây (vđ) :1 lít Khử trùng ở 121°C trong 15 phút

- Môi trường Czapek-dox (g/l) : saccarose: 30g ; NaNO3 :3g ; KCI: 0,5g; K2HPO4: 1g ; MgSO4.7H20: 0,5g ; FeSO4.7H20 : 0,01g ; Thach: 17,5g;

Nước cất (vđ): 1 lít Khử trùng 121°C trong 15 phút, pH = 6,2 + 0,2

- Môi trường AFPA (xác định nhanh các chủng thuộc loài A.flavus và

A.paraciticus) : peptone :10g ; Cao nam men : 20g; Sắt amoni citrat :0,5g Chloramphenicol : 0,1g ; Thach :15g ; Nuoc vd: 1 lít Khử trùng 121°C trong

15 phút

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm

- Kính hiển vi Axiostar plus (Carl Zeiss- Đức, gắn máy chụp anh kỹ

thuật số SONY - Nhật Bản)

-_ Tủ cấy vô trùng BIOAIR ,cộng hòa liên bang Đức

— Nồi hấp tiệt trùng Hirayama Model HL 3030

— Máy đo độ âm Precisa (Thụy Si)

— Cân kỹ thuật

17

1.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu hệ vi nầm trên các vị thuôc tục đoạn và thạch xương bô đang lưu hành tại các hiệu thuốc đông được thuộc địa bàn Hà Nội

2.2.1 Phân lập, phân loại các chủng nấm nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc tục đoạn nghiên cứu

2.2.2 Phân lập, phân loại các chủng nấm nhiễm trên 10 mẫu của vị

thuốc thạch xương bô nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu dựa trên cơ sở phương pháp FAO [21] Mẫu dược

liệu được trộn đều, chia theo phương pháp đường chéo, lấy khoảng 0,5-1 kg

làm mẫu đại diện Mẫu đại điện lại được trộn đều, lấy 1⁄4 theo phương pháp

đường chéo để nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu

Xác định băng máy đo độ âm Precisa : được liệu được nghiền thô, đường

kính không quá 3mm, sau đó cho khoảng 1g dược liệu đã nghiền vào đĩa cân, đậy nắp cân chờ ỗn định và đọc kết quả

2.3.3 Phương pháp phân lập nắm mốc

Phương pháp phân lập nắm mốc trên được liệu được áp dụng dựa trên cơ

sở của phương pháp Samson và cộng sự [21,24] Các mẫu dược liệu được

phân lập nắm mốc băng cách đặt trực tiếp trên môi trường PDA Khối lượng

được liệu nghiên cứu 40g/mẫu đối với tục đoạn và 40g/mẫu với thạch xương

bô Các mẫu dược liệu được khử trùng hệ nâm bên ngoài bang cách ngâm

18

trong dung dich Natri hypochlorit 1% mới pha trong 2 phút Sau đó rửa sạch bằng nước cất khử trùng Để ráo nước và đặt nhanh các mẫu dược liệu vào đĩa Petri đã có môi trường PDA bằng kẹp vô trùng Mỗi đĩa đặt 12-15 mẫu tùy

từng vỊ.Sau đó các đĩa được ủ trong tủ âm ở nhiệt độ 25-30°C, sau 3-5 ngày

tiền hành phân lập các chủng nắm mọc chuyền sang môi trường Czapek-Dox,

ủ ở nhiệt độ 25°C, sau 3-5 ngày tiến hành các bước phân loại và kết luận

Trên cơ sở đó tính được tý lệ % số chủng phân lập được của các loài so với tong số chủng nắm phân lập được

2.3.4 Phương pháp phân loại nấm mốc

Cơ sở chủ yếu của phương pháp là so sánh các đặc điểm hình thái vi học,khuân lạc của các chủng nâm trên các môi trường nuôi cây chuân:

— Phân loại các loai cua chi Aspergillus, Penicillium va các chị khác dựa

theo mô tả chí tiết của các loài, khóa phân loại của Rapper& Fennell

1965 [23], Pitt & Hocking 1985 [22], Samson và cộng sự 1995 [24] và

K.H Domsch 1980 [20]

— Xác định 2 loài A flavus, A paraciticus theo phuong pháp hóa sinh của PItt & hocking [22] : các chủng của 2 loai A flavus, A.parasiticus khi cây trên môi trường AFPA và ủ ở nhiệt độ 30°C sau 42-48h sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái khuân lạc

—_ Phân loại các chi nắm theo khóa phan loai cua Barnet va Hunter [18]

19

PHẢN II : KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN

3.1 Hệ vi nắm trên vị thuốc tục đoạn

Tục đoạn là rễ được phơi, sây khô (Radix Dipsacl) của cây tục đoạn (Dipsacus japonicus), ho Tuc doan (Dipsacaceae) [2; 3; 13] Yéu cầu về hàm

âm dược liệu của DĐVN IV là không quá 10% [5]

Tục đoạn có chứa nhiêu nhất là alcaloid, benzene ngoài ra có tính dâu,

chat mau, chat chat, saponm, đường

Theo YHCT tục đoạn có tác dụng bổ gan, thận, mạnh gân cốt, thông

huyết mạch, chỉ thống Chủ trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối, chân thương sưng đau, gãy xương bong gân, đứt gân, an thai, cầm máu, lợi sữa, giải độc trị

mụn nhọt

Kết quả về mức độ nhiễm nắm mốc trên 10 mẫu của vị thuốc tục đoạn

được trình bày ở bang 1 va 2

Qua kết quả của bảng 1 và 2 chúng tôi thấy một số điểm đáng chú ý về

hệ vi nầm xuât hiện trên vị thuộc này là:

-_ Hàm ẩm của tất cả mẫu được liệu dao động từ 7,02-14,79%, trong 10

mẫu nghiên cứu có nhiều mẫu đạt tiêu chuẩn hàm âm theo DĐVN IV

(<10%) nhưng tât cả các mẫu đêu bị nhiễm nầm mộc

- Tổng số chủng nắm phân lập được trên môi trường PDA là 363 chủng thuộc 16 loài của 10 chi Trong đó mẫu bị nhiễm thấp nhất là 24 LÔ (11 chủng, 2 chi ,3 loài) với hàm 4m là 9,56% và mẫu có số chủng được phân lập nhiều nhất là 36 LO (116 chủng, 7 chí, 11 loài) với hàm

âm là 14,79% Điều này cho chúng ta thấy mối liên quan giữa mức độ

nhiễm nẫm và hàm âm của dược liệu Hầu hết các mẫu có hàm âm

cao thì mức độ nhiễm nam mộc cũng cao