Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii

Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn bacillus clausii

BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHAO SAT KHA NANG HINH

THANH BAO TU CUA VI KHUAN

Bacillus clausti

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 05/2012

BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYEN THI HIEN KHAO SAT KHA NANG HINH

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bảy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu

sắc tới cô giáo T'% Đàm Thanh Xuân — Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược — Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã luôn động viên, tận tình

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh, DS Nguyễn Khắc

Tiệp cùng toản thé cdc thay cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công nghiệp dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo

trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuôi cùng, tôi xin bày tỏ lòng biệt ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sông và học tập

Hà Nội, ngày 15 thang 5 nam 2012

Sinh viên

Nguyễn Thị Hiền

Đặt vấn đỀ <5 <6 sư Sư g2 ong go g0 g0 5ø 1

Chuong 1 TONG QUAN

1.1 Dai cwong vé probiotic

1.1.1 Giới thiệu về probiotic từ bảo tử - - xxx svevevseserresee 2

1.1.4 Chế phẩm probiotic từ bào tử - + + +xx+xexeEseseerssee 4

1.2 Giới thiệu về bào tử

1.2.1 Đặc điểm của bào tử tac TE 1H ng He re sseesersrd 5 1.2.2 Sự hình thành bào tỬ - - Ccc Ăn S SH nH Hy vế 5 1.2.3 Cấu tạo của bảo th oes eeeeeesecseesseessesneesseesecssecseceneesesneeseenneenseeneeses 6

1.2.5 Sức đề kháng của bào tỬ ch HH TT g reyg 7 1.2.6 Các yếu tô ảnh hưởng tới sự hình thành bảo tử - 8

1.3 Giới thiệu về Bacillus clausii

1.3.1 Đặc điểm sinh lí hình thai cla Bacillus clausii cà: 8

1.3.2 Ứng dụng của Bacillus CLAUSE .o.ccccccccccccccscsssscsescsesssssestseseseaees 9

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất -:- + 5s 2x k+k#E#xt 9E Exekckekesrererered 12

2.1.2 Máy móc, thiẾt bị - sst t1 2971 1 1113 97 1x11 re rerkved 13

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử của Ö ciausii trong các

điều kiện nuôi cây khác nhau . - - + 2 6 SE E*£E£E£vEeEecrkeed 14

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bảo tử 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina - 2 - 14 2.3.2 Giữ giống trên thạch nghiêng . + + << E+xcx se £exced 14 2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giỗng - + - s9 2E x+EkeveEsrererkred 14 2.3.4 Phương pháp thu bào tỬ .- - - G - SH H1 n 11H HS HH ng H111 k4 15 2.3.5 Phương pháp nhuộm màu bảo tử: theo Ôgietska 15

2.3.6 Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của vi khuẩn 16

2.3.7 Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thoi gian 17

2.3.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bảo tỬ - - HH nọ Th cg nk 17 Chương 3 KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát khả năng tạo bào tử B cizusii trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 3.1.1 Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cấy ở điều kiện tự nhiên 19

3.1.1.1 Môi trường lỏng - SH ng xu 20 SN 008i: 0 22

3.1.2 Khả năng hình thành bảo tử khi xử lý nhiệt sinh khối 26

S00 008i 150 01111— 27

3.1.2.2, MO1 trOng AAC oe 28

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bào tử SP 008i 011 32

3.2.2 Môi trường đặc

KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT

Tài liệu tham khảo

Tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối khi nuôi cay 21 trong môi trường lỏng

Tương quan giữa lượng sinh khối và bào tử Ö clzusi khi 23 nuôi cây trong môi trường đặc

Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong trong môi 27 trường lỏng khi xử lí nhiệt

Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi 29 trường đặc khi xử lí nhiệt

Tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối trong môi 33 trường lỏng có Ion mangan

Tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối trong môi 34 trường đặc có lon mangan

khối trong môi trường lỏng theo thời gian nuôi cẫy

Biểu đồ tương quan giữa lượng bảo tử và sinh khối khinuôi 24 cây trong môi trường đặc

So sánh sự hình thành bào tử khi nuôi cấy trong 2 môi 31

trường đặc và lỏng khi có xử lí nhiệt

khối trong môi trường lỏng có ion mangan

sau 24h

không có lon mangan

ĐẶT VẤN ĐÈ

Trong đường ruột con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinh vật

với khoảng hơn 100 tỉ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi (như các loài thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacteria) va vi sinh vật gây hại (như Clostridium, Staphylococcus ) Cac vi sinh vat cé loi sẽ có tác động tốt cho sức khỏe như tổng hợp vitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong

ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giup hap thu tốt hơn và cải thiện sự rỗi loạn của đường

ruột, cũng như tăng cường sức đề kháng, giúp phòng bệnh Ngược lại, các vi

sinh vật gây hại sẽ gây ra những tác động xấu cho cơ thê như hình thành các

chất gây hoại tử trong ruột, các chất gây ung thư, tiêu chảy Trong cuộc

sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột rất đễ bị tác động bởi các yếu tố

bên ngoài như sự lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn không vệ sinh làm mất cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và có hại, gây nên các bệnh đường

ruột trong đó tiêu chảy là một điển hình Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật

có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở

đường ruột là rất quan trọng

Sử dụng các sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Problotic) nhằm bô sung,

cân bằng lại hệ vi sinh vật đường ruột là một trong các phương pháp phòng và chữa bệnh tiêu chảy Probiotic có thể được sử dụng dưới dạng tế bào (chỉ Lactobacillus, Bifidobacterium ) hoac dang bao tir (chi Bacillus .) trong

đó chế phẩm chứa bảo tử của B clausii duoc ding rat phd bién trén thé giới

Tuy nhiên, ở Việt Nam, vi khuan B clausii van chưa được nghiên cứu nhiều

Do đó đề tài: “Khảo sát khá năng hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus

c[ausi?° được thực hiện dé giải quyết các mục tiêu sau:

1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử Bacillus clausii trong các điều

kiện nuôi cay khác nhau

2 Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bào tử

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN

1.1 Đại cương về probiotic

1.1.1 Giới thiệu về probiotic từ bào tử

“Probiotic” xuất phát từ “prolife”, tiếng Hy Lạp, có nghĩa là “dành cho

Cuộc sông” Theo FAO/WHO probiotic được định nghĩa như sau:

Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuân mà khi cung cấp cho

người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa [12]

Vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotic có thể ở dạng tế bào hoặc bào tử, trong đó các chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn tương

đôi phô biến Trong các loại vi sinh vật có khả năng tạo bào tử, bào tử của các

loài thuộc chi 8zci/us thường được sử dụng để tạo probiotic nhờ các ưu điểm vuot trdi va tinh an toan cao Cac loai hay dung 1a: Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis San pham dau tién chira bao tir cua vi khuan B clausii 1a Enterogermina duoc san xuat

tai Y (nim 1958) [13]

1.1.2 Ưu điểm cia probiotic tir bao tir

Bào tử vi khuẩn có sức đề kháng rất lớn với các điều kiện khắc nghiệt

của môi trường do đó chế phẩm probiotic từ bào tử có những ưu điểm sau:

v_ Trong quá trình sản xuất, các điều kiện như sấy, đông khô không ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng bao tir trong cdc ché pham probiotic

v Trong quá trình lưu hành trên thị trường chế phẩm probiotic từ bảo

tử ít chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nên đảm bảo được yêu câu về tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm

vx Các bào tử có khả năng chịu đựng được pH của dạ dày và tác động của muôi mật, đê tới ruột non và nảy mâm tại đó.

vx Kháng kháng sinh (đặc biệt là vi khuẩn Ö c/zusii trong chế phẩm Enterogermina) [4], [21], [26]

1.1.3 Tinh an toan cia bao tir tao ché pham probiotic

Viéc su dung bat ki loai probiotic nào dù cho con người hay động vật

đều phải nghiên cứu tính an toàn của chế phẩm Đặc biệt là probiotic được lam tir bao tử thi van dé an toàn càng phải được nghiên cứu kĩ lưỡng vì có rất

nhiều loại bảo tử sản sinh độc tính có hại cho sức khỏe con người Khi sử

dụng bào tử cũng như tế bào của vi khuẩn thuộc chi Bacillus, can cha y một

số điểm sau đây:

> Vi khuan chi Bacillus có thể gây ra nhiễm trùng:

Một số chủng Ö cereus có thể gây nôn hoặc tiêu chảy do khi vào trong đường tiêu hóa chúng sẽ nảy mầm thành tế bảo và sinh ra các loại độc tô B thuringiensis có thê sinh ra độc tố gây viêm dạ dày, ruột B licheniformis trong một số trường hợp cũng sinh ra độc tô dẫn tới tiêu chảy và cũng có trường hợp ảnh hưởng nặng tới trẻ so sinh B subtilis cing cé thé gay ra nén mura

> Tinh khang khang sinh:

Một số chủng trong các chế phẩm probiotic chứa bào tử khi sử dụng có

khả năng kháng một số loại kháng sinh như:

- B clausii ATCC 9799 kháng erythromycin, lincomycm, cephalosporins va cycloserines

- B cereus (cing nhu B thuringiensis) cé6 kha năng tạo ra ÿ- lactamase va do đó có khả năng kháng kháng sinh nhom penicillin va cephalosporin

> Để đảm bảo tính an toàn khi tạo ra chế phẩm probiotic từ bảo tử thì cần phải tuân thủ theo nguyên tắc:

-_ Đưa ra tên chi và loài chính xắc.

-_ Chủng phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế

- Chủng phải được đánh giá trong ống nghiệm để xác định an toản và các

yếu tố độc lực

-_ Xác định hoạt động kháng khuẩn

-_ Đánh giá tính an toàn trên tiền lâm sàng trong các mô hình động vật -_ Đánh giá lâm sàng trên động vật để chứng minh hiệu quả

-_ Giai đoạn I (xác định tính an toàn) thử nghiệm ở con người

- Giai đoạn II (hiệu quả) và giai đoạn II (hiệu quả) thử nghiệm

Ở người

-_ Ghi nhãn đúng qui định [13|

1.1.4 Chế phẩm probiotic từ bào tử

Trên thị trường có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bảo tử vi khuẩn, các

loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B clausii, B subtilis, B cereus, B licheniformis véi rat nhiéu dang bao chế khác nhau và số lượng bảo tử cũng khác nhau ở cizusii được sản xuất đưới hai dạng bào chế chủ yếu là viên nang và dạng hỗn dịch — chita 2 ti bao tir trong glycerin B subtilis cé trong rất nhiều chế phẩm, có trong cả chế phâm đơn lẻ và chế phâm phối hợp với

các loại vi khuẩn khác như Lactobacillus acidophilus, dang bao chế có thể ở

dạng cốm bao trong gói hoặc trong nang cứng với số lượng bào tử từ 10” -

10° [13]

Việt Nam đã sản xuất chủ yếu các ché pham probiotic cé chita B

subtilis nhu: Bio-acimin, Bibactyl, Bidisubtilis một số chế phẩm chứa Ö

cereus nhu Subtyl, chế phẩm chứa cả 3 loại B clausii, B subtilis, B licheniformis như: côm vì sinh Bazivic

1.2 Giới thiệu về bào tử

1.2.1 Đặc điểm của bào tử

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt

độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đôi chất bất

lợi Mỗi vi khuân chỉ tạo được một bảo tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào

tử sẽ phát triển thành tế bào sinh dưỡng [1], [4]

Sự hình thành bảo tử là quá trinh té bao sinh duéng chuyén thanh dang

bao tử có khả năng kháng nhiệt, hóa chất, dung môi, bức xạ, sây khô Sự hình

thành bảo tử vi khuân được chia ra làm nhiều giai đoạn như sau:

bao tw ty do bao sinh dưỡng

e_ Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng biệt và màng tế bảo chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành vách ngăn

e_ ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bảo tử

được hình thành và một phần vỏ cũng được hình thành

e _ Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN

e Bao tử chín và được giải phóng ra ngoài

e_ Quá trình hình thành bảo tử mất khoảng 6 - 8h, là quá trình tương

đối phức tạp để tạo ra được cấu trúc bên vững chịu được điều kiện khắc

nghiét [1]

1.2.3 Cau tạo của bào tử

Câu trúc của bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN Bào tử bao gồm:

e ADN nam trong thé bao tử chất

e Mang bao tir bao ngoai bao tử chất

ete Le Se

mang ngoai

Hình 1.3: Cấu tạo bào tử

Bảo tử có các lớp bao bọc chiếm 50% thê tích Vỏ bào tử có nhiều lớp,

bề mặt của các lớp này xù xì với thành phần hóa học chủ yếu là protein có chứa nhiều glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoải ra còn có sự tham gia cua keratin; hydratcarbon; lipid; peptidoglycan và canxi dipicolinat, không chứa acid teichoic Đây là những lớp có khá năng ngăn chặn sự thâm thấu của nước và các chất hoả tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng

bảo vệ bao tử trước các điều kiện bất lợi

Lõi của bào tử chứa một lượng nước rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết cùng với canxi dipicolinat [1], [4]

1.2.4 Sự nảy mâm của bào tử

Bào tử vi khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, pH, dinh

dưỡng sẽ nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng Sự nảy mam của bào tử xảy ra theo 3 giai đoạn: hoạt hóa, nảy mam va sinh trưởng [4]

1.2.5 Sức đề kháng của bào tử

Bào tử vi khuân có sức đề kháng cao đối với các yếu tô vật lý và hoá học

như: nhiệt độ, hóa chất, dung môi, bức xạ Nguyên nhân là đo:

e_ Nước trong bảo tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có

khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ

e _ Do bào tử có lượng lớn ion CaŸ” và acid dipicolinic, protein của bào

tử kết hợp với canxi dipicolinat thành một phức chất có tính chất ôn định cao

đối với nhiệt độ

e_ Các cnzym và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bảo tử đều

tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đôi chất của bào tử đối với

tế bảo bên ngoài

e_ Cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thâm thấu của các lớp mang làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thê tác động tới bảo

tử [4].

1.2.6 Các yêu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử

Sự hình thành bảo tử từ tế bào sinh dưỡng được kích thích bởi nhiều

yếu tô khác nhau Ngay cả trong môi trường nuôi dưỡng vi sinh vật thì sự

giảm nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường (đặc biệt là cacbon, nitơ,

phospho ), hoặc sự thay đôi về nhiệt độ và pH cũng ảnh hưởng tới thời điểm

và thời gian hình thành bảo tử của vi khuẩn [11], [22] Một số báo cáo đưa ra

khoảng pH tối ưu để hình thành nhiều bào tử nhất của vi khuẩn Ö subfilis là

từ 6 — 8 [7] Ngoài ra các thành phần của môi trường cũng có ảnh hưởng tới

sự hình thành bào tử của vi khuẩn đặc biệt là sự có mặt của ion Mn”” lon

Mn”” ở mức độ thấp sẽ cần thiết cho sự tăng trưởng và trao đôi chất của vi

khuẩn và trực khuân cần nhiều Mn”” hơn cho sự hình thành các bào tử kháng

nhiệt vì khi đó, Mn”” sẽ bị oxy hóa thành MnO; bám trên bê mặt bào tử [6],

[8], [19]

1.3 Giới thiệu về Bacillus clausii

1.3.1 Đặc điểm sinh li hinh thai cia Bacillus clausii

> Đặc điểm phân loại:

Bacillus clausii thuộc:

Bộ: Eubacteriales Ho: Bacillaceae

Chi: Bacillus Loai: Bacillus clausii

> Đặc điểm phân bố:

Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất, có thê

la dat vuon (B clausii KSM- K16, B clausii DSM 8716, ATCC 31084 ),

hoặc dat sét (B clausii DSM 9784 ) Ngoai ra co thé tim thay B clausii 6 nước (Ö clzusii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông

An Độ), trong bùn [14], [10], [25].

> Đặc điểm hình thái

Bacillus clausii có hình que đứng đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi

khuân Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có hình bầu dục

B clausii có kích thước chiều rộng 1-2um, chiều đài 5um [23]

> Điều kiện nuôi cây

e_ Nhu cầu oxy: Ö cizusii là vi khuẩn hiểu khí do đó trong quá trình nuôi cây cần có sự cấp khí

e Về nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15 — 50°C Mỗi chủng

có nhiệt độ tôi ưu riêng như: chủng Ö c/zusii DSM 8716 có nhiệt độ tôi ưu là

30°C, ching B clausii KSM-K16 c6 nhiét d6 t6i uu 14 40°C, B clausii ATCC

31084 có nhiệt độ tôi wu 14 37°C [24], [25]

e Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7 — 10,5 Chung B

clausii KSM-K]16 có pH tôi ưu là 9,0 [24]

e Về dinh dưỡng, Ö cizusii có thê sử dụng nhiều nguồn cacbohydrat

khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2- ketogluconat ;

nguồn nitơ, phospho, các nguyên tổ vi lượng

> Đặc điểm sinh hóa

Vi khuan B clausii cé kha nang thuy phan duoc casein, gelatin va tinh bột, nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60 Cho phan ứng oxidase, catalase duong tính, khử nritrat thành mtrit [17]

1.3.2 Ứng dụng của Bacilius clausii

B clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản xuất ché pham probiotic

B clausii có khả năng sản xuất nhiều loại enzym như: xylanase, cellulase, amylase, va protease Trong cdc enzym nay quan trọng nhất là protease San xuat enzym protease:

10

Protease 14 enzym quan trọng, chiếm gần 60% tổng doanh số các enzym trên thế giới Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như

chất tây rửa, công nghiệp thuộc da, thực phẩm Protease cũng có thể được

sử dụng với mục đích thủy phân protemn dạng sợi như sừng, lông và tóc [9], [18], [24]

> Sản xuất chế phâm probiotic từ bào tử B clausii

Enterogermina’y

Hình 1.4: Ché pham Enterogermina Bào tử Ö clausii được sử dụng trong sản phẩm Enterogermina (Sanofi - Aventis) — một chế phẩm probiotic có tác dụng hữu hiệu trong điều trị tiêu chảy ở trẻ em Enterogermina chứa bào tử vi khuẩn Ö c/zwsii đưới 2 đạng: dạng huyền dịch trong ống nhựa (2 tý bảo tử trong 5ml) và dạng viên nang (2

tỷ bảo tử trong ] viên nang) Enterogermina được chỉ định trong các trường hợp:

e_ Điều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường ruột và bệnh lý kém hấp thu vitamin nội sinh

e_ Điều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khi

dùng thuốc kháng sinh hoặc hóa tr liệu.

11

e R6i loan tiéu héa cap và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạn

khuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitamin

B clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng sinh nên uống chế phẩm xen kẽ với khoảng thời gian dùng kháng sinh Chế phẩm

sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm (như đã nêu ở mục I.1.2)

Chế phẩm Enterogermna chứa bốn loài Ö clzusii, mỗi loài kháng một

số loại kháng sinh nhất định: O/C kháng chloramphenicol, N/R khang novobiocin va rifampicin, T khang tetracycline, SIN khang streptomycin va neomycin [15]

Ngoài Enterogermina chứa bào tử B clausii con mét sé ché pham khác

chua B clausii nhu: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin, Enterum

12

CHUONG 2 NGUYEN LIEU, HOA CHAT, THIET BI VA

PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất

Hóa chat sir dung pha môi trường

Pepton Trung Quôc

Cao thịt Trung Quôc

Kali clorid Trung Quốc

13

2.1.2 Máy móc, thiết bị

Bang 2.2: Các máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Xuất xứ

Tủ cây Bioair (Italy)

Nôi hâp ALP (Nhật)

Tu say Memmert (Đức)

Tủ lắc Bioshake (Đức)

Lò vi sóng Daewoo (Han Quéc) Nôi cách thủy Trung Quôc

14

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng hình thành bào tử B clausii trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau

2.2.1.1 Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cây ở điều kiện tự nhiên

2.2.1.2 Khả năng hình thành bảo tử khi xử lý nhiệt sinh khối (đun cách

thủy 100”C/1h)

2.2.2 Khảo sát ảnh hướng của ion mangan đến sự hình thành bào tử

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina

Pha 100ml môi trường canh thang (MITI) trong bình nón dung tích 250ml, đậy bằng nút bông không thâm nước, hấp tiệt trùng ở 113°C trong 20 phút, để nguội Tiến hành cấy giống Ö cizusii từ chế phẩm vào bình nón trong tủ cây vô trùng Nuôi cấy trong máy lắc ở 37°C, 110 vòng/phút trong 24h

Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường

2.3.2 Giữ giỗng trên thạch nghiêng

Pha môi trường canh thang thạch (MT2), đun sôi cho đồng nhất các

thành phần trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín,

hấp tiệt trùng ở 113°C trong 20 phút Để nguội bớt rồi đặt nghiêng Dùng que cây cây giống trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng theo hình ziczac trong tủ cây vô trùng, để trong tủ ấm 37°C, trong khoảng 48h Sau khi khuẩn lạc mọc thì cất giống vào tủ lạnh

Định kỳ 2 tháng cây truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn

2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống

Chuẩn bị 100ml môi trường MTI trong bình nón dung tích 250ml Hấp tiệt trùng ở 113C trong 20 phút Để nguội, đùng que cấy cây khuẩn lạc trong

2.3.4 Phương pháp thu bào tử

2.3.4.1 Phá vé mang té bao bang lysozyme

Ly tâm dịch sau khi lên men, thu căn (5000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Căn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng

15 - 20ml dung dich lysozyme (1 mg/ml), u 6 37°C trong 30 phút để phá

vỡ vỏ bọc tế bảo, giải phóng bảo tử

Ly tâm dịch thu cắn (tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Hòa căn trong dung dịch KCI IM để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn (6000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Tiếp tục hòa cắn trong dung dich NaCl 1M để loại hoàn toàn vỏ tế bảo, ly

tâm dịch thu căn (6000 vòng/phút trong 10 - 15 phút)

Thu căn và rửa bằng nước cất 3 lần thu được bảo tử

Lượng bào tử được xác định bằng phương pháp cân hoặc đo độ đục hoặc

đếm số lượng bào tử [16]

2.3.4.2 Xử lí bằng nhiệt

Dịch nuôi cấy sẽ được đun cách thủy ở 100°C trong 1h để diệt hoàn toàn

dạng sinh đưỡng và tạo điều kiện đề bảo tử hình thành

Sau đó xác định lượng bào tử thu được bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc hoặc xử lí bằng Iysozyme như trên rồi cân lượng bảo tử [3]

2.3.5 Phương pháp nhuộm màu bào tứ: theo Ôgietska

Nguyên tắc:

16

Mang bao tir: day, chắc, chứa nhiều lipid khó bắt màu nên phải xử lý

đề tế bảo chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bảo bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Tây màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm bằng thuốc nhuộm màu bằng thuốc nhuộm

bồ sung Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bảo có màu phân biệt Tiến hành:

- Làm tiêu bản vết bôi và để vết bôi khô tự nhiên

- Nhỏ vài giọt HCI 0,53% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn côn cho bốc

hơi, giữ 2 phút rồi rửa nước cất

- Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, rồi nhỏ dung dịch fuchsin Ziehl, hơ nóng

cho đến khi bốc hơi, nếu thuốc nhuộm cạn phải bô sung ngay và giữ trong 5 phút

- Bỏ giấy ra và rửa vết bôi lại bằng nước cất

- Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H;SO¿x 1% trong 2 phút

- Rửa vết bôi bằng nước cất

- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen Loeffler trong 5 - 15 phút

- Rửa nước cất, để khô tự nhiên vết bôi

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu: bào tử màu đỏ, tế bào màu

xanh [2|

2.3.6 Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của vi khuẩn

s% Trong môi trường lỏng:

Chuẩn bị môi trường lên men MTI, hấp tiệt trùng ở 113C trong 20 phút Cây dịch nhân giống Ö c/zwsii vào, nuôi cây trong máy lắc ở 37C, 110

vòng/phút Tại các thời điểm khác nhau (1, 2, 3, 4, 5 ngày) lẫy mẫu đem nhuộm tiêu bản theo Ôgietska để xác định thời điểm xuất hiện bảo tử trong