Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS)

Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS) Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VA CAC SAN PHAM TU DAU TUONG BANG

KY THUAT SAC KY KHI KHOI PHO (GC/MS)

LUAN VAN THAC SI DUOC HOC CHUYEN NGANH: KIEM NGHIEM THUOC VA DOC CHAT

MA SO: 607315

Người hướng dẫn khoa hoc: PGS Pham Gia Hué

TS Lé Thi Hong Hao

| TEƯỜNG DH DUST HA NOI

“ran Yt apes aul

HA NỌI - 2010 | Ngày a2nc BBM SỐ |

Số ĐKCD: hake bend: Pipe sul

LỜI CÁM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS Pham Gia Hué

TS Lé Thi Hong Hao

Những người thây cô đã luôn quan tâm giúp đỡ, hướng dân tỏi trong suốt qua trình thực hiện và hoàn thành đề tai nay

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các động nghiệp ở Viện Kiêm nghiệm an toàn vệ sinh thực phim Quốc gia, những người đã hết lòng tạo điêu kiện thuận lot va trực liép giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chan thành cảm ơn các tháy cô Bộ môn Hóa Phan tích trường Đại học Dược

Hà Nội đã hướng dân và giúp đỡ tỏi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chan thanh cam on Ban giám hiệu nhà trường, cảm on các thấy cô, cần bo

phong quan ly sau dai hoc các phòng ban khác của trường Đại học Dược Hà Nội đã giún

đỡ tỏi trong suối quá trình học tập tại trường

Cudi cung xin giti loi cam on tới gia đìHH và bạn bè, những người đã hệt lòng ung

họ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điêu kien cho tôi hoàn thành tot de tai

Hà ÀNói, ngày 28 tháng 10 năm 2010

Dược sĩ Tì ran Cao Sơn Học viên cao học khóa 13,

Chuyén nganh Kiém nghiém Thudc va Dée chat

CTHIỚNH Í r TẾ TÚI [TT cocesasaaoiasseaadaibulotleuqbiljiaseioriogisiidagueal

1.1 Tổng quan về lipid và acid béo ——

1.1.3.3 Acid béo omega-9 (1-9) oo .cceecceeeceteeecceeeeceeensneeeceeeseeeeeenneees

1.2 Đậu tương và sản phẩm từ đậu tương -¿ 52 c2c52

1.2.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương - 5: 2525252 Se2222xcccreserereiErrkxereeo

1.2.2 Các sản phẩm từ đậu tương 25-52 2S 22222 czcxrea

ï,3, Cáo phương pháp xác định o1 ĐỀ cac iockcdsacasussua

1,51 S6 /ký Tông hiệnntHớ oap (EU suueeeeerabdenobaiadesdleidsbAjielBiube8ttsigedggmii

1.3.2 Quang phô hồng ngoại biên đôi Fourier (F TIR) . 5-5555 5<<ss=s< Ì,ä Giải thiệu:vẽ sắc kể Khí khối pH¬ soecaseniiniesnioioaoosisioe

21 1,1, KHÍ HE ceneeiieiieiiesaeieensssanareoaseeseeesssssessslasrselbrasesssstecrlayykksig6s

{2Ì 1.5, Bư-nG LIỀN :H1THbsesseeseeoisaanobniiogGUAlLGE0100136003040g10-800010000-1I012A430014g01AnG

Dee cle ee 0à nseasuturtratcgstoVtinattvigorVEATOGGSIOSGBESRGI-BENCEEOVvEONSIPSHIOTG0E0/0500063069X0-09009402)90G2H00

1.4.2 Detector Khoi pho trong se 16) KHL sc.seesescessevecsnstancancasmsnsenceegesesanaecnes

124.22) Rat TIC 1 sccsscosesaccncecesseessseceriawrsenmnisowteaesseuctseoce em mmeanmnorenaraniceenes

1 oh Bh rm i an Tica eins cn emer eremceceenncrsineicesaresnennansstesesicousecresiniennmebsines

18

1.45 4 KH số Kỹ tHUÊẾI NỈ bauosuodntidgotti0SiIAilcaliA6E0000100/304481400ix20390n9vsyg12 ca 1.4.3 Ung dụng của sắc ký khí khối phỏ .- -. -5- 5552+<<5++<<sc<:

1L TT d1 Ki [ Ô HhaaaadaaioaiibhiabkàgugStdldioiddioidlilasgesiasfasgegeaai

1322 PA TECH định NT deeeeeiieeeeisbileaoeedalkeaebniaGG1096ig4ukãtacisexbser

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bo vO CCEA ET BỨH soaedsaascsolksssnubtesaolfirlaulinsiitbös/biS2\G00/03/0016001084

2.2 Hóa chất thiết Diec cccccseccscsccssescsssscssescssssesssseevesssvscsecsseaeseesesssveesseaeeveneees

WEEE WRIT BE scnssinnanescsenasvusnsnnnnesinrnencon-enieho bib Si CaS ici uae

2.2.4.3 Pha dung dịch chuẩn 5-5:

5:3 Phương chấp nEghiÊn ĐỨU cúeodoadactdibggödidloloGatcbals(0ags0a6iáxl5i6042-ả8 1 axalxxss 2.3.1 Phương pháp lây mẫu và xử lý mẫu sơ bộ c-.c.c.ccccccee

53.10 SESY đội TÌÊU HỆ cá ae co ogtb2agsesgalll0xs4siã03:044105084689846850)883045603808608

Su Ê Tt nc di BH seeeeeeeerenodnkisoitdestodoScGGESENGRIEEinGiihngeortsimesSt)

2.3.1.4 Mẫu đậu phụ Cà TT HS HT TH HE HE Tư vn

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid béo - - -+++==<s5:

2.3.2.1 Chiết chất béo khỏi nền mẫu 2E 3813181555515 555 1112251552215 51 E125 scg

2.3.2.2 Dẫn xuất hóa tạo FAIME c<csco<ch tt An ErgaSEEkeertrrerkrrakksrsixiee

3.333 Phân tích King CỔ CỔ cávccecu gi ng Chữn ta lQ giàn Git00 til601606180805/8A6118uả-.aexcco2250)

li Tim ah ri ng BE eessnnnnseennasensesseorvoveawtrensneosataatosspsaesersseSU

2.3.3.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký . - ¿525 522c+srSzervsrrrrzerrvrerrrree 30

1317 TiHci0 ri E6, 0D HÌ day ad tao 0i8i666106ã0220A0010130020882ssuae 30

Ð.È 7.1.1 fnứigG truyện HN đueweevoaiasaiiidiriigdiantitnifDiAMadogisx20NMi044n0ct6ME91002074/3uã40006i0A 30

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD)., giới hạn định lượng (LOQ) 3Ú

2.0, T0 lID DU «sec -ceneee-eseenesaneeenseseesnesrserxezegseseeascxrcSt6is82801304885880308018008808060,1E 31

Da oi: HH A eR AEE LAtilibaxeaeareki 31

5.104, Tương đổi l0h dữ Tí Bồ HỆ áá4exaseakediiekosiesdisakodgiontioiskisgsiuchiugikeggidi2ic01000g30E 32 TLIC ð St M2IHISfe:+:518⁄3.5°4§ 24:8 g 5)4! 0 33

3.1 Xãy dựng phương pháp phần LÍch acid ĐO soseeeeoedoioddiiadiagedaiseaesslŠ 3.1.1 Khảo sát các điều kiện phấn TIC BCI HỆ yssceeccebektieckkddkckiiL646386516 C06256 33

3.1118 di nrbu lẩu Liên RE rei itera eeeeinddinionddidioiediosgiiyitsS09000109666i48 33

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện chạy máy GC-MS . 55c Scscccsscsrreeesreersee.2 5

3.1 TRRNI Øinh it: BHỦỔ cung nranoigbiigetgiiGepi08300039/0.8386 8 tzaseospasessza¿MÔ

3.1.2.1 Tính phù hợp của hệ thông .- 5-5556 Scsekeeesrssserrserereeserrsesrecor E2 3.1.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lỌc -¿- - - S22 S2 E13 E3 12 v11 sen errreers TÔ

1% 15: Ehoftfể HHYỆN THẦN: usxga s02 6608000100500 0(B4G000004G32004600H009 xuat

3.1.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định ÏttiiuiesaneadasndieassoususaoolT

SAO LED UG and baddnadncdtisitagi-lAbiiioideiiai106144016651940861400414301444408AI034000000100023406epia) 47 3a) eG LOO TUN oi canscsnsenesssancionsaanna uns tena Rae RU

3.2 Ứng dụng phương pháp để phân tích một số acid béo omega 3 6, 9 trong đậu

trai ftnrffiSnrif (ĐH ểHRBPEaeaseoeeaoediiestieinldotgiiGG0DIANHDWG 064000005800 CT0)

3.2.1 Xác thành phần một số acid béo omega 3, 6, 9 trong đậu tương và sản phẩm từ

TH TẾ tong thai getcafaesxliu4G340V66i2500823165.6c050E80sdĐ4g01/G080-4g3l00010020310:036:656cs4xg ee 3.2.2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến thành phần acid béo

KHE DO EEHE ssaaaengerarenrteaoserogieserenetsrgvit9iii50g903101161004001000E00i12c08002140028566y2s6)DE

CHUONG 4: BAN LUAN 00777

4.1 Quy trinh chiét chat béo va dan SE IO rcs crac reece aveucmnuammie 4.2 Chất nội chuẩn 5 < 12k S1 St 1144115161311 X11411E1111111111115151511111118 H110

4.3 Phân tích acid béo omega bằng GC-MS - 7 S52

4:4 Kẩt<iiá (bffi th BHIWGHE PlÑÔtuooadsiantiiiitiiia t0 0204CHESD4QĐBG01/026x880

4.5 Hàm lượng acid béo omega trong đậu tương và sản phẩm từ đậu tương

KT 1 HH Là con nhỈĨ Ha nÀ ngư nhan GHEg Hay kögcg2l.cosoyk

TT oe weeeeemremererecceorersrcsornaenvensnannrannsnesammansensansnrconneneraransssnsroreseannrites AMbiaiAsAds

TAI LIEU THAM KHAO —-

TT con H 622683080 46138086.8 668g

: Chemical Ionization (Ion hoa hoa hoc)

: Diode Array Detector (Detector mang diod)

: Evaporative light scattering detector (Detector tan xa bay hoi)

- External Standard (Chat ngoại chuẩn)

: Fatty acid methyl ester (ester methylic của acid béo)

: Flame Ionization Detector (Detector lon héa ngon lửa)

: Fluorescence Detector (Detector Huynh quang)

: Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại biển doi Fourier)

: Gas chromatography (Sac ky khi)

: High Performance Liquid Chromatography (Sac ky long hiéu nang

cao)

: Internal Standard (Chất nội chuẩn)

: Limit of Detection (Gidi han phat hién)

: Limit of Quantification (Gidi han dinh lugng)

: Mass spectrometry (Kh6i pho)

: Refractive Index Detector (Detector chi s6 khtic xa)

: Signal to noise ratio (Ty 1é tin hiệu trên nhiễu)

: Select lon Monitoring (Chon lọc ion)

: Ultraviolet — Visible (Tir ngoai kha kién)

DANH MUC CAC BANG

Bảng 1.1: Một số loại acid béo omega-3 thường gặp - 22 5c 5+cz<cccx sex Bảng 1.2: Một số loại acid béo omega-6 thường gặp 2-5-5555 ss<scssecvs /

Bảng 1.3: Một số loại acid béo omega-9 thường gặp -. o5 sc-ss: c8

Bảng 1.4: Đặc điểm hai loại cột sắc ký khí — lông . scc5c-<-c.<< -~ l6

Bảng I.5: Các loại pha tĩnh chính dùng trong sắc ký khÍ -ccc se se eececseecerseed 17

Bang 2.1: Cac acid béo omega 3, 6, 9 ma dé tài nghiên cứu - 23

Bang 2.2: Thành phần của dung địch chuẩn 37 acid béo -: < -28

Bang 2.3: Cach pha cdc dung dich chudn FAME làm việc . irae ZT Bảng 3.1 : So sánh kết quả giữa một SỐ pHưƠNg THIẾT auebaeaeeeaseiiasoeeennsenre : swans 35 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chương trình nhiét dG COt .c.cccsesseeesseessseeeesseeseneseees 37 Bảng 3.3: Xác định tính phù hợp của hệ thống .- -5- ¿552 5255252c<=ecsese2 42 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleic (C18:1n9) 44

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tinh cua acid linoleie (C18:2n6) 44

Bang 3.6: Kết quả khảo sát tuyến tính của acid y-linolenie (C18:3n6) 44

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tuyên tính của acid a-linolenie (C18:3n3) 45

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tuyên tính của acid arachidonie (C20:4n6) 45

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của EPA (C20:5n3) 45

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyên tính của DHA (C22:6n3) Aenao.46 Bang 3.11: Kết quả xác định độ lặp lại trong mẫu đậu tương i, _- 48 Bang 3.12: Kết quả xác định độ lặp lại trong mẫu đầu đậu nành 48

Bảng 3.13: Kết quả xác định độ lặp lại mẫu nước đậu nành và đậu phụ 49

Bang 3.14: Két quả khảo sát độ đúng của phương pháp .- - - «- 2Ữ Bảng 3.15: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp - .- - 2 Í Bảng 3.16: Thành phần acid béo trong đậu tương và sản phẩm đậu tương 52 Bảng 3.17: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng acid béo

grtre=ne: 3.6 trưng IA DĐ ad ago cntoddLtiici01465018003600013000398268Gã2G90340as0isaSf°

DANH MỤC CÁC HÌNH VỀ

Binh [.1: Cây đấu tường và hai đầu TH ceceaabáincvceenAcSbkcseosaliicbstsvgiacsassszÔ)

Hĩnh Ì.3: Sơ đỗ cầu bo của máy sẵc ký KHÍ ác ceesesiiiaesisaressasesoisesssmseos.LU

Bink 1.5: Sơ đỗ cầu tan của miều khôi HD cuuseanaiehidgiaDnoAiigdk2kgkoL Ai 0616600000406 18

PUSS 1 See AG GUA WET COE CSE BO cesses seccrsscuccrescsrenmrnimacinennacammsee 53

Hình 3.2: Sắc đồ hỗn hop FAME, cét DBS (60m x 0,25mm x 0,25 im) veanee dO

Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hop FAME, cét SP 2380 (30m x 0.25mm x 0.2 tim) 36

Hình 3.4: Phố khối điển hình của các acid béo omega 3, omega 6, omega 9 39

Hình 3.5: Sắc đồ của hỗn hợp chuẩn FAME Ippm .- 5-52 25+ v22 =xzsvxe 40 Hình 3.6: Sắc đồ chuẩn DHA 5 ug/ml (tạ 20.22) và nội chuẩn (tạ 9.50) 4l Hinh 3.7: Sac dé chuan EPA ãug/mI (ty 17.66) và nội chuẩn (tạ 9,52) 4Ï Hình 3.8: Sắc đồ chuân ALA (tạ 11.65) và nội chuẩn (tạ 9,49) 4Ï

Hình 3.9: Mẫu trăng (A) và mẫu thêm chuân (gồm 4 chất C18:3n6, C18:3n3

C20:5n3 và C22:6n3) ở nông độ 0,25 tig/ml (B) - . .- 43 Hình 3.10: Sắc ký đồ xác định LOQ của 4 acid béo C1§:1n9, C18:2n6, C18:3nó6 và

Hình 3.11: Sắc ký đồ xác định LOQ của C20:4n6, C20:5n3 và C22:6n3 47

Hình 3.12: Sắc đồ xác định độ lặp lại trên mẫu đậu phụ -.- 19

Hnh.3.13: Sầu đã mẫu:xáo tỉnh đồ tu Hồi, xásseeaaniiiniadiiis guảnhausaabiiasassauseCÓ

Hình 3.14: Hàm lượng acid béo ở các thời gian bảo quản khác nhau 22

ĐẶT VĂN ĐÈ

Ngày nay, cùng với sự phát triền về kinh tế và mức sống ngày càng tăng, con người phải đối mặt với nguy cơ về một số bệnh đến từ chính sự phát triển đó Tỷ lệ

mắc bệnh tim mạch, một vẫn đề của xã hội hiện đại ngày càng gia tăng Bên cạnh

việc tìm ra các phương pháp và thuốc để chữa trị những căn bệnh này, thì chế độ

dinh dưỡng cũng đóng một vai trò quan trọng nhăm phòng ngừa thậm chí có thể

loại trừ được phần nào các tác động của căn bệnh nảy

Cac loai acid béo omega 3, omega 6 va omega 9 khi được sử dụng với tỷ lệ

hợp lý là những acid béo có nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người, đặc biệt là

cho hệ tim mạch Ngoài ra vai trò của chúng đối với sự tạo thành cầu trúc bộ não của trẻ sơ sinh cũng đã được nhiều nghiên cứu chứng minh Hiện nay trên thị

trường có nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng là dầu cá có chứa nhiều các acid

béo nói trên đặc biệt là omega 3 Các loại thực phẩm chức năng loại này có rất nhiều tác dụng đối với hệ tim mạch và rất cần thiết đối với phụ nữ có thai và cho

con bú Tuy nhiên, giá cả của các loại dầu cá này thường cao do quá trình chiết xuất

từ cá biển khá tốn kém, hơn nữa các sân phẩm có nguồn gốc từ cá thường có một số nguy cơ ô nhiễm các chất độc khi sử dụng nhiều như ô nhiễm thủy ngân và các chất polyelorbiphenyl Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất các chế pham omega nhờ

công nghệ vi sinh đã mang lại các kết quả rất khả quan

Bên cạnh các acid béo có nguồn gôc từ động vật, thì một nguồn lớn khác các

chất omega cũng có trong một số loài thực vật, nhiều nhất là trong hạt các loài cây

họ đậu đặc biệt là đậu tương Thành phan acid béo omega 3, omega 6 va omega 9 trong hạt đậu tương thường ít hơn trong động vật, nhưng đậu là loại cây dể trồng

đặc biệt là ở điều kiện thời tiết nhiệt đới do đó có thể để đàng thu được hàm lượng

lớn acid béo omega với chỉ phí thấp Hiện nay các sản phẩm từ đậu tương được sử dụng rất phô biến trong cuộc sống hàng ngày bao gồm dâu đậu nành, đậu phụ, nước

đậu nành Xác định hàm lượng acid béo trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu

tương góp phần quan trọng trong việc nghiên cứu chế độ dinh dưỡng nhăm cung

cấp hợp lý hàm lượng acid béo omega 3, omega 6, omega 9 cho con người Trên thể

giới chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng acid béo trong hạt đậu tương Hiện nay, ở Việt Nam một sỐ tác giả đã nghiên cứu phương pháp xác định acid béo trong một số đối tượng như dầu thực vật, chế phẩm thực phẩm chức năng nhưng những nghiên cứu này mới dừng lại ở việc xác định thành phần các acid béo chứ chưa nghiên cứu đây đủ phương pháp định lượng các acid béo, đặc biệt là acid béo omeøa Hiện nay vẫn chưa có phương pháp chính thức để phân tích acid béo trong đậu tương và sản phẩm từ đậu tương nói riêng, và trong thực phẩm cũng như dược

phẩm nói chung Ngoài ra, việc nghiên cứu hàm lượng acid béo omega 3, 6, 9 trong

đậu tương có thể góp phần nghiên cứu các chế độ ăn nhăm mục đích nâng cao sức

khỏe con người, cải thiện giống nòi Với thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài '“Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu

tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phố (G€C/MS)” với các mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp định lượng một số acid béo omega 3 omega 6 và

omega 9 thường gặp trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật

sic ky khi khéi phé (GC/MS);

2 Ứng dụng phương pháp để nghiên cứu hàm lượng một số acid béo omega 3,

6, 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 Tổng quan về lipid và acid béo

1.1.1 Vài nét về lipid

Lipid là các hợp chất hữu cơ có trong động vật và thực vật có thành phân cau

tạo khác nhau thường là este của acid béo và alcol

Lipid có thé chia làm 2 loại: [7]

- Lipid đơn giản: là các este của acid béo với các alcol khác nhau, gồm 3

nhóm:

o Triglycerid: ester cla acid béo voi glycerin

© Cerid: este cla acid béo với các monoalcol có phân tử lượng cao

o Sterid: este cua acid béo voi cholesterol

- Lipid phic tap: 1a loai lipid ma khi thuy phan sẽ tạo thành acid béo alcol

là một thành phần không thê thiếu trong chế độ ăn hàng ngày của con người Ngoài

việc là thành phân cung cáp năng lượng cao nhất (9.3 kcal/kg), lipid còn chứa một

số acid béo không thể thay thể và đóng vai trò là dung môi hòa tan các quan trong nhu vitamin E, vitamin A [7]

1.1.2 Cac loai acid béo

Acid béo là thành phần cơ bản cấu tạo nên lipid, các acid béo hầu hết đều là acid monocarboxylic cé cau tao mach thăng thường có từ 4 đến 26 carbon trong phân tử Trong tự nhiên, đa số các acid béo đều có số C chăn, thường gặp từ 12 đến

226

Acid béo có thể được xếp vào hai nhóm chính là các acid béo no và các acid béo không no [7]

- Acid béo no (bão hòa): là các acid béo mà mạch C không chứa nối đôi, ở

điều kiện tự nhiên là chất rắn

- Acid béo không no (chưa bão hòa): là các acid béo ma mach C có chứa | đến nhiều nói đôi Tùy theo số nói đôi trong phân tử, người ra lại xếp thành các nhóm nhỏ:

o Acid béo khéng no có I nỗi đôi (Monounsaturated fatty acids = MUFAs) co cau tao dang cis

o_ Các acid béo trans (trans fatty acid): Acid béo không no có một nối

doi dang trans, day la cac acid béo có hại :

o Acid béo không no có nhiều ndi déi (Polyunsaturated fatty acids =

PUFAs) Các acid béo loại này có vai trò rất quan trọng đỗi với sức

khỏe

1.1.3 Acid béo omega

Acid omega-x 1a khai niệm quy ước chí một họ acid béo không no có liên

kết đôi C-C ở vị trí n-x có nghĩa là liên kết đôi ở vị trí x từ nhóm methyl cuỗi cùng của acid béo

H;C, -(CH;)n - Cg- C,- COOH

Đánh s6 carbon ctia acid béo bat dau tir carbon của nhóm -COOH1à Cl, sau

đó là C2 C3 ; carbon cạnh nhóm —-COOH là C„ rồi đến Ca, Cụ Và ở cuối mạch là nhém —CH; Carbon cua nhém methyl nay duoc goi la carbon omega (C,,) Khoang

cach ti’ carbon omega đến nói đôi đầu tiên gần nhất nêu có 3 carbon thi goi 1a

omega-3, và acid béo có câu trúc loại nay goi là acid béo omega-3 Cũng tương tự như vậy, còn có acid béo omega-6, omega-9 Tóm lại, chữ số sau chữ omega: 3, 6 hoặc 9 nhằm chỉ vị trí của nối đôi đầu tiên tính từ Cụ, Ký hiệu omega (@) co the

được việt đơn giản là n

Trong tự nhiên có 3 loại acid béo omega là acid béo omega-3, omega-6 và

omesa-9 Những acid béo loại này đều có vai trò quan trọng trong đỗi với các chức năng của co thé

1.1.3.1 Acid béo omega-3 (acid béo n-3)

a Khái niệm

Các acid béo n-3 là những chất có vai trò đỉnh đưỡng thiết yếu điển hình là

acid a - linolenic (ALA) , acid eicosapentaenoic (EPA), va acid docosahexaenoic (DHA) Bảng I.I liệt kê một số acid béo n-3 thường gặp

Bảng 1.1: Một số loại acid béo omega-3 thường gặp

Tên thường gọi Ký hiệu Tên khoa học

b Tac dung cua acid béo n-3

Trong các loại acid béo thi cdc chat omega 3 là loai acid béo c6 nhiéu loi ich

hơn cả, với vai trò quan trọng nhất là tác dụng trên hệ thống tim mạch Các chất này

có tác dung bdo vé tim mach, lam bẻn vững thành mạch, tránh sự hình thành các

cục máu đông qua tác động đên sự kêt tụ của tiêu câu Làm giảm lượng triglycerid

mau, giam loan nhip tim, giảm tỷ lệ bị bệnh suy động mạch vành giảm chứng nhéi mau co tim [21] [30] [34] Cac nghién etru cho thấy việc sử dụng thường xuyên các

sản phẩm có chứa acid béo n-3 làm giảm nguy cơ đau tim và các cơn đột quy do thiếu máu cục bộ gây ra Các chất bổ sung có chứa EPA và DHA có tác dụng kích

thích sự lưu thông máu, làm tăng phân hủy fibrin, một hợp chất liên quan đến tạo cục máu đông và hình thành sẹo, và thêm vào đó đã được dùng để làm giảm huyết

áp, tuy nhiên những chất có bổ sung ALA lại không cho thấy tác dụng này [27]

Ngoài ra, các acid béo omega 3 còn có tác dụng đối với sự tạo thành não bộ

của trẻ sơ sinh Thành phần của não là chất béo trong đó DHA chiếm khoảng 1⁄4 lượng chất béo, do đó não cần một lượng acid omega-3 (nhất là DHA) đẻ duy trì

hoạt động Người ta còn thấy răng DHA kìm hãm sự lão hóa não, ngăn ngừa Sự SUY giảm trí nhớ Với trẻ em, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy những trẻ được bỗ

sung DHA đạt được các điểm nhận thức cao hơn, ít mặc phải các vẫn đề về hành vi

và cảm xúc kỹ năng vận động cũng phát triển sớm hơn Còn EPA trong cơ thể nó

được xem là acid béo thiết yếu để chuyển hóa thành các chất sinh học quan trọng

nhu prostaglandin, leucotrien [21] [23]

Đối với da, nhóm acid béo omega-3 đóng vai trò chủ chốt trong cầu trúc đa

và đặc biệt là với tầng sừng vì chúng ngăn ngừa hiện tượng mất nước giữa các lớp

đa, vì vậy nhóm này có tác dụng làm da mềm mại và tươi trẻ Ngoài ra, acid béo

omega 3 con được ghi nhận là làm giảm nguy cơ tiểu đường giúp cho mắt được

linh hoạt, tinh nhanh: giúp người bệnh nhanh chóng thoát khỏi chứng trầm uất; tác

dụng tiêu diệt tế bào ung thư và nhiều lợi ích khác đã được chứng minh [16] [23]

Một số nghiên cứu báo cáo có thể có tác dụng chỗng ung thư của acit béo omepa-3 (đặc biệt là ung thư vú đại tràng và tuyến tiền liệt) Aeid béo omega-3 làm giảm tốc

độ tăng trưởng khói u tuyến tiền liệt [16] [39]

Trong khi đó nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng khi sử dụng lượng acid béo

ormega-3 dưới 3 g/ngày không gây ảnh hưởng đến sức khỏe FDA khuyến cáo răng

tông số lượng axit béo Omega-3 từ thức ăn không quá 3 gam mỗi ngày, trong đó có không quá 2 gam mỗi ngày là từ các chất bổ sung dinh đưỡng [13].

1.1.3.2 Acid béo omega-6 (n-6)

Tên thường gọi Ký hiệu — Tên khoa học

Acid linoleic | C18:2n6 cis 9,12-octadecadienoic acid

Acid dihomo y-linolenic C20:3n6 cis 8,11,14-eicosatrienoic acid

Acid docosatrienoic C22:2n6 cis 13,16-docosadienoic acid

b Tác dung cua acid béo n-6

Các acid béo omega 6 cũng đã được chứng minh là có vai trò quan trọng đối với hệ thống tim mạch Tuy nhiên với lượng acid béo n-6 quá cao, đặc biệt là với acid arachidonic, lại có thể gây tác dụng tiêu cực Các tác dụng sinh học của acid

béo omega-6 là trung gian chủ yếu do chuyển thành n-6 eicosanoid và gắn vào thụ

thể trong các mô của cơ thể Việc chuyền déi acid arachidonic (C20:4 n-6) ở mô

thanh prostaglandin và hormon leukotriene cung cấp nhiều mục tiêu phát triển dược phẩm và thuốc điều trị để giảm sự tác động quá mức của acid béo n-6 trong xơ vữa

động mạch bệnh suyếễn viêm khớp bệnh mạch máu, quá trình viêm miễn dịch

Tác dụng của omega 6 và omega 3 có sự ảnh hưởng lẫn nhau, nhiều nghiên

cứu cho thấy tỷ lệ acid béo omega-6/omega-3 tốt phải dưới 10 và tôi ưu là dưới 4

nêu tỷ lệ này vượt quá 30 có thể gây tác dụng xấu đến hệ tim mạch như khả năng

gây ra đột quy đau tim cấp, suy mạch vành, hen suyễn Chế độ ăn phương Tây hiện đại thường có tỷ lệ của n-6/n-3 cao, đôi khi lên đến 30/1 và đã gây ảnh hưởng

đến hệ tim mạch, tăng xác suất bệnh trầm cam [36]

1.1.3.3 Acid béa omega-9 (n-9)

a Khai niém

Các acid béo omesa-9 là thành phần phổ biến của dầu mỡ động thực vật, do

đó chúng không được xếp vào nhóm acid béo thiết yêu như acid béo omega-3 và acid béo omega-6 Hai acid béo omega-9 quan trong nhất là acid oleic (C18:1, n-9),

la mot thanh phan chinh cua dau 6 liu, dau dau nanh va acid erucic (C22:1, n-9),

được tìm thay trong dau hạt cải, hạt giống và mù tạt

Bảng 1.3: Một số loại acid béo omega-9 thường gặp

Tên thường gọi Ký hiệu Tên khoa học

Acid erucic C22:1n9 13-docosenoic acid

Acid nervonic C24:1n9 ]5-tetracosenoic acid

b Tác dụng của acid béo n-9

Cac acid béo omega 9 gitp lam giảm xơ cứng động mạch tăng cường hệ miễn dịch, ôn định lượng đường trong máu, ngoài ra có thể giúp giảm ung thư tuy

nhiền tác dụng của omega-9 không rõ ràng bằng omega-3 và omega-6 Thậm chí, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy nêu dùng omega-9 quá nhiều có thể gây ung thư

và bệnh tim mạch Cơ thê người có thể tự sản sinh được omega-9 nếu được cung cấp đủ omega-3 và omega-ó do đó điều quan trọng là trong chế độ ăn cần đảm bảo

cung cấp đủ acid béo omega-3, omega-6 và omega-9 với một tỷ lệ phù hợp [39]

Các acid béo omega-9 có cấu trúc hình học dạng cis Những acid béo có

thành phần tương tự nhưng cấu trúc dạng trans là những acid béo ảnh hưởng rất xấu

đến sức khỏe gây ung thư và bệnh tim mạch

1.2 Đậu tương và sản phẩm từ đậu tương

1.2.1 Gidi thiéu chung võ cay đậu frơng

Hình 1.1: Cây đậu tương và hạt đậu tương

Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương đậu nành có tên khoa học Œjycine max

thuộc họ Đậu (Fabaceae) Đậu tương có nguồn sốc từ Trung Quốc, là một trong

những cây tròng lâu đời nhất của phương Đông Từ nhiều thế kỷ nay người Trung

Quốc và những người phương Đông khác, bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc và Đông Nam Á đã sử dụng đậu tương trong nhiều thực phẩm khác nhau như một trong những nguồn cung cấp protein hàng ngày và năng lượng quan trọng nhất Đậu tương được coi như một “kho báu lớn” “protein thần diệu của thiên nhiên” và còn được gọi là “thịt thực vật” Đậu tương có nhiều loại khác nhau thích nghỉ với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới Đậu tương là cây hàng năm, cây ngắn ngày,

nên có thé bố trí vào các mô hình luân canh xen vụ đề tăng vòng quay của đất, nâng

giá trị kinh tế cho người sử dụng đồng thời hạn chế nguồn sâu bệnh lưu tồn qua mùa

vụ canh tác

Một số giỗng đậu tương phổ biến hiện nay được trồng ở Việt Nam: M103

ĐT80 ĐT84 ĐT22 VX9-2, AK05 Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu

để, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tạo ra một sé giống đậu tương mới

với những ưu điểm vượt trội so với những giống cũ Đó là các giống DT22, ĐT26

Giống ĐT84 là giống đậu tương được trồng phô biến ở nước ta Giống này do Viện

Di truyền Nông nghiệp chọn lọc từ dòng đột biến của tô hợp lai ĐT80 x ĐH4 cây cao 50 — 60 cm, thời gian sinh trưởng từ 80 — 90 ngày hạt có mảu vàng đẹp, ron hat

màu nâu Năng suất của giỗng này đạt 12 - 27 tạ/ha ĐT84 có thê trồng cả 3 vụ

trong năm, nhưng sinh trưởng tốt nhất và đạt năng suất cao nhất trong vụ hè ĐT84

được công nhận giống quốc gia năm 1996 Giống Giống ĐT22 là giống do Trung

tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo từ dòng đột biến hạt lai (DT95 x ĐT12) Giỗng ĐT26 là giống do Trung tâm nói

trên chon tao tir t6 hợp lai gitta DT2000 va DT12 Giống có hàm lượng protein cao

(42.21%) va lipid 19.72% [8]

1.2.2 Cac san phẩm từ đâu twong

Đậu tương là loại thực phẩm được sử dụng rất đa dạng, trong đó chủ yếu là

hạt đậu tương Nhìn chung hạt đậu tương có thành phân dinh dưỡng cao hàm lượng

protein trung bình khoảng từ 35,5 - 40%, lipid tir 15 - 20 %, hydrat carbon tir 15 dén

16 %, và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng cho sự sóng Hạt đậu tương

có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung

cấp dầu thực vật quan trọng Ngoài ra trong đậu tương có nhiều loại vitamin:

vitamin Bị, B;, PP, A, E.K,D, C [3] Theo Từ Giấy và cộng sự (2000) hàm

lượng của một số acid béo không no trong đậu tương nhu acid linoleic 14 9g/100g

thực phẩm ăn được acid linolenic là 0,3g/100g thực phẩm ăn được Trong dầu đậu

nành acid linoleie chiếm tỷ lệ cao khoảng 53%, acid ø-linolenie (C18:3n3) chiếm tỷ

thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái tháo đường thấp khớp, thần kinh suy

nhược và suy dinh đưỡng Đậu tương cũng là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau, làm thức ăn cho gia súc [3]

Phổ biến nhất trong các sản phẩm từ đậu tương có thê kể đến dầu đậu nành, đậu phụ và sữa đậu nành Đây là những sản phẩm thực phẩm được sử dụng phổ biến

ở hầu hết các gia đình và có ảnh hưởng nhất định đến sức khỏe của người tiêu dùng

1.3 Các phương pháp xác định acid béo

Hiện nay trên thế giới đã có rất nhiều phương pháp có thể sử dụng để phân tích acid béo nói chung và các loại acid béo omega noi riêng Các kỹ thuật hay được

sử dụng bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sắc ký khí (GC) quang phô

hồng ngoại (FTIR), sac ky lỏng khối phố (LC-MS) và sắc ký khí khôi phố (GC-

MS)

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Kỹ thuật HPLC sử dụng các loại đetector khác nhau như UV-VIS (tử ngoại - kha kién), RID (detector chi số khúc xạ), FLD (detector huỳnh quang) ECD (detector điện hóa) hoặc ELSD (detector tán xạ bay hơi) đã được nhiều tác giả sử dụng dé nghiên cứu phương pháp xác định acid béo lIrước hết có thê kế dén

phương pháp sử dụng cột pha đảo C18 để phân tích hỗn hợp ester methvlie của acid

béo bằng RID [18] Cho đến nay cột C18 van được sử dụng phổ biến cho các

phương pháp phân tích acid béo tuy nhiên cần những chế độ chạy gradient.phức tạp khi phân tích hỗn hợp các acid béo Các acid béo có thé duoc phân tích ở đạng tự do hoặc dẫn xuất thành dạng ester nhăm tăng độ phân giải píc Pha động được sử dụng

có sự khác nhau khi phân tích acid béo tự do hay dạng ester, đối với dang ester thi

hệ dung môi nước acetonitril thường được sử dụng, trong khi đối với dạng tự do thì

cần phối hợp thêm acid acetic vào methanol và nước để tạo môi trường acid (với pH

< 4) Một số nghiên cứu khác lại sử dụng sắc ký trao đổi ion pha đảo kết hợp

detector dién dan dé phat hién acid béo [18] Du vay, trong s6 cdc detector trên thi detector UV-VIS được sử dụng nhiều nhất, có lẽ do sự phổ biến của nó Thông

thường đetector UV-VIS được sử dụng để phát hiện các acid béo có nối đôi liên hợp

như các acid béo omega-3 và omega-6 đối với các acid béo khác cân có sự dẫn xuất

hóa dé tạo các chat dẫn xuất phù hợp So với detector UV-VIS, detector huỳnh

quang thường cho độ nhạy cao hơn, tuy nhiên cũng cần phải dẫn xuất hóa các acid

để tạo dẫn xuất phát huỳnh quang [17] Ngoài ra detector tán xạ bay hơi cũng đã

được một số tác giả nghiên cứu tuy nhiên những ứng dụng còn tương đối hạn chế

Những phương pháp này nói chung khỏ có thể phân tích được hỗn hợp thành phần

nhiều acid béo do khả năng tách hạn chế, đồng thời cần quá trình dẫn xuất hóa

tương đôi phức tạp [15] [24] [40] [41]

Kỹ thuật sac ky long hiéu nang cao str dung detector khôi pho (LC-MS) được

sử dụng phổ biến gần đây có thể khắc phục những nhược điểm nói trên Do ưu điểm

là khả năng tách vẻ khối, LC-MS có thể phân biệt được các chất đồng rửa giải qua

cột Hai chế độ ion hóa phổ biến là ion hóa phun điện (ESI) và ion hóa hóa học ở áp

suất khí quyên (APCI) déu cé thé str dụng được Phương pháp này có độ nhạy tốt và

không cần dẫn xuất các acid béo tuy nhiên lại khá phức tạp và tôn kém hơn nữa các

loại acid béo trong thực phẩm nói chung thông thường tồn tại ở mức khá lớn nên

không cân yêu câu thiết bị phân tích có độ nhạy quá cao [20] [28]

1.3.2 Quang phé hông ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

Phương pháp này cung cấp các thông tin khá hữu ích trong việc xác định

thành phần các loại acid béo đồng thời có thể định lượng một số acid béo thông qua việc so sánh chiều cao của píc ở các bước sóng khác nhau với chuẩn F Andun và các cộng sự đã xây dựng được phương pháp FTIR để phân tích các acid béo no

acid béo không no EPA và DHA trong thịt mỡ lợn cho kết quả tương đối tốt với hệ

số tương quan tuyển tính > 0,99 Một số nghiên cứu khác phân tích acid béo no và không no trong dầu ăn cho sai số đưới 2.5% Tuy nhiên, phương pháp này tương đối khó áp dụng và độ ỗn định không cao trong định lượng [12] [13] [14]

1.3.3 Sac kp khi (GC)

Sắc ký khí có nhiều ưu điểm để áp dụng phân tích các acid béo Với khả

năng có thể phân tích được tất cả các loại acid béo trong cùng một lần chạy máy,

kết quả phân tích tin cậy và chính xác phương pháp này đã và đang được áp dụng

rộng rãi [19]

Do khả năng bay hơi hạn chế của các aeid béo chuỗi dài và nhiệt độ bay hơi

của các acid béo thường khá rộng nên để đạt được độ phân giải cần thiết khi phân

tích bằng sắc ký khí cần trải qua quá trình dẫn xuất hóa để tạo các dẫn chất đễ bay

hơi Phổ biến nhất và đễ thực hiện nhất là quả trình tạo các dẫn chất ester của acid béo, trong đó ester methylic là loại dẫn xuất hay được thực hiện nhất Có nhiều

phương pháp khác nhau đã được mô tả dé tao dan xuat ester methylic, bao g6m ester hóa với methanol trong môi trường acid sulfuric hoặc acid hydrocloric, ester

hóa với methanol trong môi trường kiềm hoặc sử dụng các chất xúc tác khác như

diazomethan, bor trifloric [32] [35] Ặ

Nhiều loại pha tĩnh có bản chất phân cực khác nhau đã được sử dụng đề phát

triển các phương pháp phân tích Các loại cột không phân cực hoặc phân cực yếu cũng được một số tác giả sử dụng để tách các ester methylie của acid béo, nhưng

phỏ biến và cho hiệu quả tách tốt hơn cả là các loại cột phân cực Những loại này có

thể có độ phân cực rât cao như các loại cột có bản chat alkylpolysiloxan, độ phân

cực cao với bản chất là polyethylenglycol hoặc độ phân cực trung bình [35]

Đề phát hiện các ester methyl của acid béo có thể sử dụng đetector ion hóa

ngọn lửa (FII) FID cho độ nhạy tốt với các acid béo và có khoảng động học tuyến tính rộng, có thể phân tích được các acid béo ở các mức nồng độ khác xa nhau

Phương pháp này cũng đã được tổ chức AOAC chấp nhận và được sử dụng rộng rãi

trên thế giới Hạn chế của phương pháp này là khi sử dụng detector FID để phân

tích các chất mới thì không thê xác định được và yéu cau phải có chất chuân đề định

tính, đồng thời độ nhạy của deteetor FID cũng tương đối thấp [3Š]

Gần đây, với sự phát triển của kỹ thuật khối phổ thì sắc ký khí khối phổ (GC-

MS) đang là phương pháp được áp dụng nhiều nhất các acid béo trong thuốc và thực phẩm GC-MS độ nhạy tốt, độ chính xác cao và độ ôn định tương đối tốt, hơn

nữa với thư viện phô có thể xác định các chất mới dễ dàng [26] [31] [33]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp định lượng các acid béo trong dầu gắc hoặc trong một số sản phẩm dầu cá dùng làm thực phẩm chức

năng bing sic GC-FID va GC-MS [2] [6] Tac gia Nguyén Tường Vy và cộng sự đã phân tích các thành phần của acid béo dầu gác bằng cả GC-FID va GC-MS xac dinh được 18 loại acid béo trong dầu gắc [10] [11] Tác giả Phạm Thị Kim Trang đã có

nghiên cứu acid béo trong dầu thực vật, nhưng chỉ dừng lại ở mức xác dịnh thành

phần [6] Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều chọn sử dụng kỹ thuật sắc ký

khí khói phố đề phân tích acid béo

1.4 Giới thiệu về sắc ký khí khối phố

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các chất dựa vào sự phân bố của các chất giữa hai

pha, pha động là chất khí và pha tĩnh có thể là chất răn (sắc ký khí rắn) hoặc chất

lỏng (sắc ký khí lỏng) Thực ra trong sắc ký khí, pha động chỉ đóng vai trò làm chức

năng vận chuyển chứ không tương tác với chất phan tich [1]

Sắc ký khí chỉ có thể áp dụng để phân tích được các chất ở thể khí và bền với

nhiệt Đối với những chất không có tính chất phù hợp thông thường cần tạo dẫn

xuất có khả năng bay hơi tốt và có thể phân tích được băng sắc ký khí [9]

1.4.1.1 Khí mang

Các loại khí mang sử dụng trong sắc ký khí khói phổ cần phải đảm bảo độ

trơ và sạch Khí mang không được tương tác với các chất phân tích do đó yêu cầu đầu tiên là phải trơ về mặt hóa học, thông thường thì heli, hydro, argon hoac nito có

thể đáp ứng được yêu cầu này Hơn nữa, khí mang cần đảm bảo độ tinh khiết đề không đưa các chất tạp bân vào cột phân tích Hiện nay, khí mang được sử dụng phô biến nhát trong sắc ký khí khối phô là heli [1]

1.4.1.2 Buông tiêm mẫu

Trước khi đi vào cột phân tích, thông thường mẫu ở dạng lỏng được cho vào buồng bay hơi rồi cho đòng khí mang đua vào cột Có 3 cách tiêm mẫu chính: [9]

- Tiêm mẫu chia dong (split): Sau khi vao buéng bay hoi, mau duge chia

nhánh sao cho chỉ có một phần nhỏ của lượng mẫu ban dâu đi vào cột Các tỷ

lệ chia dòng phố biến nhất trong khoảng từ 1:50 đến 1:100 Cách tiêm mẫu

này có ưu điểm là giảm lượng mẫu vào cột trong trường hợp mau ban hoặc

có nồng độ cao Tuy nhiên, đo lượng mẫu vào cột nhỏ nên có thể làm giảm

độ nhạy đồng thời gây ra hiện tượng thành phân mẫu vào cột có thể không giống thành phần mẫu ban đầu do các câu tử có độ bay hơi khác nhau

- _ Tiêm mẫu không chia dòng (splitless): Mẫu sau khi vào buồng bay hơi được đưa toàn bộ vào đầu cột và được ngưng tụ lại ở đây, sau đó tăng nhiệt độ dé

làm bay hơi đần các cấu tử Phương pháp này có thể làm tăng độ nhạy và

phản ánh tương đối chính xác thành phần mẫu ban đâu tuy nhiên có thể gây

ra sự đoãng chân píc và nhanh làm hỏng cột phân tích

- _ Tiêm mẫu trực tiếp (on-column): Một số trường hợp đặc biệt, khi thành phần

mẫu chứa các chất không bên nhiệt, có nhiệt độ hóa hơi thấp nên không thẻ bơm vào buông bay hơi Khi đó có thê tiêm thắng vào đầu cột và gia nhiệt từ

từ để bay hơi mẫu Phương pháp này có ưu điểm là toàn bộ mẫu được đưa

vào cột nên phản ánh trung thành nhất thành phần ban đầu của mẫu Tuy

nhiên, đề thực hiện tiêm trực tiếp vào cột thì cần thiết kế đặc biệt của buồng

tiêm mẫu cũng như thường chỉ 4p dụng cho các loại cột có đường kính trong lớn (> 0.53mm) và phải dùng kim tiêm nhỏ nên đễ xảy ra hiện tượng gãy kim

trong đầu cột

1.4.1.3 Cột tách và lo

Cột là trung tâm của hệ thông sắc ký Trong sắc ký khí, có hai loại cột: cột

nhôi và cột mao quản Ngày nay, do có nhiêu ưu điêm nên người ta sử dụng phô biến cột mao quản Nhiệt độ cột sặc ký là một yếu tó quan trọng cần kiểm soát Lò

là bộ phận chứa cột và có chức năng điều nhiệt cho cột sắc ky [1]

Bảng 1.4: Đặc điểm hai loại cột sắc ký khí lỏng

(WCOT) hoặc chất mang

bao pha tĩnh (SCOT)

Sô dia lý thuyết | 500-1000 s WCOT: 1000-4000

Ưu nhược điềm

Hiệu suât tách kém, tôc độ

phân tích chậm kém trơ vê

mặt hóa học Hiệu suât tách cao, tăng độ

nhạy, giảm thời gian phân

tích, có thể ghép trực tiếp với

khối phỏ

Các loại pha tính: Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yếu trong

việc tách các chất khỏi nhau Tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà lựa

chọn loại pha tĩnh cho phù hợp Các loại pha tĩnh có thể được XẾp vào 5 nhóm dựa

vào tính phân cực của nó bao gồm nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm phân cực trung bình nhóm phân cực và nhóm phân cực cao [9]

Bảng 1.5 nêu bản chất các loại cột thường sử dụng hiện nay xếp theo 5 nhóm như trên Thực tế với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng xuất hiện những loại cột đặc biệt với độ chọn lọc rât cao tuy nhiên với các loại cột nêu trong

bảng này có thể đáp ứng được các yêu cầu trong phân tích sắc ký khí

Bảng 1.5: Các loại pha tĩnh chính dùng trong sắc ký khí

Tên thương | Tính phân | Nhiệt độ "

Tên pha tĩnh : Ung dụng

Polydimcthyl a Khong phan sani Hydrocarbon,

Poly(dicyano OV-257 Phân cực Tu Acid bẻo không no

1.4.2 Detector khối phổ trong sắc ký khí

1.4.2.1 Khai niém

Khối phô là thiết bị phân tích đựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của

các hợp chất hóa học băng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của

phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/Z)

Về bản chất, có thể coi khối phô là một loại detector, nhung 1a mét detector

đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện khối phô còn có khả năng tách các chất đồng rửa

giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng

1.4.2.2 Nguyên tắc hoạt động

Mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buông

ion để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyền đến bộ phận lọc và phân tích

khối đẻ tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu

nhận, tín hiệu thu được chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ

Nap mau Nguồn ion Bộ phận Bộ phận

Hình 1.3 : Sơ đồ cấu tao cua may khoi pho

a Bộ nạp mẫu : nạp mẫu gián tiếp, đâu ra của cột mao quản GC' được nói trực tiếp

với bộ nguồn ion của máy khối phô

b Nguồn ion hóa (Ion source) : ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi

Một số kĩ thuật ion hóa hay được sử dụng trong sắc ký khí khối phô :

s+* lon hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI): Mẫu sau khi qua cột sắc ký ở đạng hơi đi vào buông lon hóa, ở đây xảy ra tương tác với chùm clectron có

năng lượng thường là 70 eV tạo thành các các electron thứ cấp và một số phân mảnh của phần tử

% Jon hóa hóa học (C]): Cũng sử dụng chim electron lam nguôn ion hóa nhung chim electron ion héa cac phan tu khi va it ton hoa các phân tử mẫu (tỷ lệ phân tử khí thường cao gấp 10°, 10! lần so với phân tử mẫu) Một trong những tác nhân khí được sử dụng phổ biến nhất là khí metan

(CH,), với áp suất 1 Torr các ion chính tạo thành là CH;', CạH;”, C:H:'

c Bộ phân tích khối (Mass analyzer): Tách các ion theo tỷ sô tm/z Một số thiết bị

phân tích khôi lượng thường được dùng trong sắc ký khí:

% Thiết bị phân tích tứ cực :

Cấu tạo bới 4 thanh điện cực đặt song song tạo thành 1 khoảng trồng, trong

đó một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiêu (DC) và dién thé tan s6 radio (RF) Trường tử cực được xác định sao cho các Ion có thé đi tới detector Các tứ cực đóng vai trò như bộ lọc khối Khi một trường điện từ được

áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ đao động phụ thuộc vảo tỉ số giữa m/z và

trường RF Chỉ những ion có tỷ số m/z phù hợp mới có thé di qua bộ loc nay

+ Bay ion:

Cũng là một thiết bị tứ cực Gồm các điện cực hình trụ, điện cực hình mũ và

điện cực vòng Mỗi điện cực này có các bê mặt hình hypebol ở bên trong Các điện

cực hình mũ tạo ra một dién thé nén va áp thêm một tần số radio đề điêu,chỉnh đao

động thế, còn điện cực vòng áp thế 1 MHz và điện thế 1 chiều (DC) Cá ion được

tạo ra băng cách đưa vào các electron phát ra từ một dây dẫn hoặc các ion có thể được đưa vào bẫy từ một nguôn bên ngoài Trên cơ sở tăng biên độ của thé RF, chuyển động của các ion tăng dần lên đến khi đường đi của chúng không ồn định dọc theo trục hình học của bẫy Kết quả là các ion này bị phóng ra khỏi các khe hở của điện cực hình mũ bên trái và được thu thập lại ở bộ khuếch đại electron Quá trình phóng các ion nay theo trình tự tăng giá trị m/z và tín hiệu thu được phản anh

phô khối của các ion bị bẫy

s* Phân tích thoi gian bay:

Dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Các ion

có cùng năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thời gian các ion đi tới

detector sẽ khác nhau Do có năng lượng động học hay vận tốc, các ion này sẽ bay

với khoảng cách xác định là d trong một khoảng thời gian t, trong đó t phụ thuộc vào tỉ số m/z Hiện nay có loại thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ electron giúp

giảm sự phân bố năng lượng động học của các ion đi tới detector và do đó sẽ làm

tăng độ phân giải của thiết bị

d Bộ phận phát hiện (Mass detection) : Thường có hai loại nhân electron và nhân

quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện và khuếch đại để đo

** Nhán electron (electroninultiplier) : Tác động của mot ion lên bề mặt của bán dẫn sẽ tạo ra electron Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của

các bán dẫn khác để tạo ra các electron khác Quá trình cứ thế tiếp diễn

để tạo ra nhiều electron Các electron được thu nhận và SỐ lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu - tức là SỐ lượng 1on đến detector

“+ Nhan quang (photomultiplier) : Cac electron tao ra theo cách trên va

chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon Các photon này được

thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu

1.4.2.4 Một số kỹ thuật MS :

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN): Hỗn hợp các chất phân tích

sau khi được tách và đưa vào detector khói phỏ, khối phỏ ghi nhận tổng cường độ

các ion sinh ra từ mỗi chất Chế độ Full scan cho đây đủ thông tin về chất phân tích hơn tuy nhiên độ nhạy không cao nhiễu đường nên có thê lớn

- Kỹ thuật phán tích chọn lọc ton (SIM):

Khối phô kế chỉ nhận diện một số ion và chỉ sắc đỗ theo ion lựa chọn Kỹ

thuật này làm giảm bớt nhiễu đường nèn và do đó tăng độ nhạy tức tăng tỷ lệ tín

hiệu (S) trên nhiễu đường nên (N)

Kỹ thuật SIM nhạy hon FULL SCAN từ 10 đến 100 lân

1.4.3 Ứng dụng của sắc ký khí khôi phô

1.4.3.1 Phan tich dinh tinh :

+ So sánh thời gian lưu tạ của chất phân tích với tạ của chất chuẩn đói chiếu trong cùng điều kiện sắc ký

+ So sánh sắc ký đô của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu

+ So sánh phổ khối của chất phân tích với chất chuẩn đối chiều trong cùng điều kiện sắc ký và so sánh phố khối của chất phân tích với phổ khối các chất có

trong thư viện phô ~ phương pháp này cho kết quả tin cậy nhất

1.4.3.2 Phán tích định lượng :

Một số phương pháp định lượng:

- Phuong phap chuẩn hóa diện tích : Hàm lượng phần trăm của một thành phan trong mau phân tích được xác định bằng tỷ số (tính theo phân trăm) giữa điện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các

thành phần có mặt trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và của các

thành phần có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện của chúng) Phương pháp này thường cho kết quả không tin cậy nếu không dùng hệ số đáp ứng f,

- _ Phương pháp ngoại chuẩn : Đường chuẩn được lập dựa trên mỗi tương quan giữa các lượng chât chuẩn đói chiêu khác nhau và diện tích pic tuong tng cua chung Nồng độ các chất phân tích trong mẫu thử được định lượng dựa trên đường chuân này Trong trường hợp này các thông số làm việc của máy

như nhiệt độ, tốc độ dòng phải rất ôn định và lượng bơm phải có độ lặp

lại cao Phương pháp ngoại chuân có ưu điềm là có thê phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng nhanh đơn giản dễ làm Tuy nhiên khi thành

phần mẫu phân tích phức tạp việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu

phân tích về thành phần nên mẫu, thành phần hóa học và vật lý dễ mắc sai số

lớn Trong trường hợp này đề loại trừ ảnh hưởng của nên, người ta dùng

phương pháp thêm chuân

- _ Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều

kiện như phân tích mẫu bình thường Dựa trên lượng chuẩn thêm và tín hiệu các mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính được nồng độ chất

có trong mẫu Phương pháp này có ưu điểm là loại trừ được phan nao anh hưởng của yếu tố nền tuy nhiên quá trình thực hiện tương đối mắt thời gian, khó cỏ thể áp dụng khi phân tích hàng loạt mẫu, hơn nữa không phải lúc nào chuẩn thêm vào và chất có sẵn trong mẫu có khả năng thu được giống nhau

- - Phương pháp nội chuẩn : Trong phương pháp này, người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu

Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông SỐ phân tích được dùng đề xây dựng đường chuẩn Phương pháp này có độ chính xác cao

vì nó có thể loại bỏ được các yếu tô gây ảnh hưởng đến tín hiệu chất phân tích Hơn nữa phương pháp này còn có ưu điểm là do dựa trên hệ số tương

quan về tín hiệu giữa chất cần phân tích và một chất nội chuẩn nên đây là phương pháp rất thích hợp khi nền mẫu quá phức tạp Song trong nhiều trường hợp rất khó có thể tìm được chất nội chuẩn thích hợp để có thể xác

định chất cần tách đo nó phải thỏa mãn các yêu cầu như thời gian lưu gần sát với thời gian của chất phân tích, sự có mặt của chất nội chuẩn không ảnh

hưởng lên tín hiệu của chất cần phân tích thu nhận được

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dùng để nghiên cứu là hạt đậu tương và các sản phẩm chính chế bién từ

đậu tương bao gom dầu đậu nành, đậu phụ nước đậu nành

Tiến hành lựa chọn một số loại acid béo omega 3, 6, 9 điển hình thường có trong đậu tương dé phan tich nhu trong bang 2.1:

Bang 2.1: Cac acid béo omega 3, 6, 9 ma đề tài nghiên cứu

2.2 Hóa chất, thiết bị

“2v 2n - Thiết bị

May sac ky khi khdi phé (GC-MS) (Thermo Finnigan, USA) Cột sắc ký khí SP 2380 (30m x 0,25mm x 0,20 um)

Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ (Shel Lab)

Máy ly tâm (Mikko)

Cân phân tích độ chính xác 0.1mg (XT220A, Thụy S1)

Bếp cách thủy (GFL, Đức)

Máy lắc Vortex Genie 2 (Mỹ)

Bếp cách thủy nỗi với sinh han (Eyela, Nhat)

Máy rung siêu âm (Elma Đức)

Natri methylat (Merck)

Dung dich bor triflorid 50%/ methanol (Sigma)

a Chuan gốc hỗn hợp acid béo (hãng Sigma) có nồng độ tổng 10 mg/ml Thanh

phần hỗn hợp chuẩn như ở bảng 2.2 Các thành phần in đậm là các acid béo mà đề tài nghiên cứu

Bang 2.2: Thành phần của dung dịch chuẩn 37 acid béo

Pha loãng hỗn hợp chuân băng n-hexan đề thu được các dung dịch loãng 10

lần (có nông độ các acid béo tương ứng 20-40-60 Iig/m]) và loãng 100 lần (có nồng

độ các acid béo tương ứng 2-4-6 g/ml)

b Chuân đơn các acid béo sau:

Methy] linolenat

- Methyl y-linolenat

- Methyl cis-5,8,11,14,17-eicosapentanoat (EPA)

- Methyl] cis-4,7,10,16,19-docosahexaenoat (DHA)

Pha các đung địch chuân đơn trong n-hexan để thu được các dung dịch chuẩn

có nồng độ 5 ng/mI

2242 Nói chuẩn

Chất nội chuẩn methyl nonadecanoat C19:0 (Sigma)

Cân chính xác khoảng 0.2ø nội chuẩn C19:0 hòa tan trong n-hexan và định

mức đến 100ml băng n-hexan, thu được dung dịch nội chuan 2000 pg/ml

Pha dung dịch nội chuân có nòng độ 30 pg/ml trong n-hexan

2.2.4.3 Pha dung địch chuẩn

Chuẩn bị các đãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt từ 0,1 đến 10 ng/ml

có nồng độ chất nội chuẩn cỗ định là 5ug/ml như mô tả ở bảng 2.3:

Bảng 2.3: Cách pha các dung dịch chuẩn FAME lam việc

hôn hợp 20 hon hop 2 pg/ml | chuan nông độ (uty _acid béo

pg/ml (pl) (I) 50 pg/ml (yl) (ug/ml)

2.3 Phương pháp nghiền cứu

2.3.I Piurơng pháp lấy mẫu và vử lý mẫu sơ bộ

2.3.1.1 Mẫu đậu tương

- _ Mẫu giống đậu tương lấy ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ Viện

Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Mỗi mẫu lấy 200g cho vao tui polyethylen

khô, sạch, đóng kín, điền đầy đủ thông tin chuyển về phòng thí nghiệm phân

tích

- - Mẫu được nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ mịn.đồng đều Đồng nhất xong cho vào túi kín, tránh ẩm

2.3.1.2 Mẫu dâu đậu nành

- Lay mẫu ở các chợ ở khu vực nội thành Hà Nội, các mẫu dầu đậu nành là

những dầu được công bồ trên nhãn chai 100% đậu nành hoặc có thành phần pha trộn là đầu đậu nành Mỗi mẫu lấy tối thiểu 500ml

- - Mẫu được lắc kỹ trước khi đem phân tích

2.3.1.3 Mẫu nước đậu nành

- Lấy mẫu ở chợ Nguyễn Cao thuộc quận Hai Bà Trưng Mỗi mẫu lấy tối thiểu

500ml

- _ Mẫu được lắc kỹ trước khi đem phân tích

2.3.1.4 Mau dau phu

- Lấy mẫu ở chợ Nguyễn Cao thuộc quận Hai Bà Trưng Mỗi mẫu lấy tối thiểu

500g

- Mẫu được nghiền mịn đến đồng nhất trên máy nghiền mẫu, và cho vào túi

kín tránh âm

2.3.2 Phuong pháp xúc định làm lượng acid béo

s%* Nguyên [ý : Mẫu được thuỷ phân đề tách chất béo trong khỏi nền mẫu chất béo sau đó được chiết băng ether và tạo dẫn xuất ester methylic (FAME) với chất

xúc tác bor triflorid FAME được chiết băng n-hexan và được phân tích bằng sắc ký

khí khối phố

2.3.2.1 Chiết chất béo khỏi nên mẫu

Các chất béo (lipid) tồn tại trong mẫu thườn g ở đạng kết hợp với các thành

phần khác do đó cần thủy phân để tách riêng chất béo khỏi nền mẫu [7] Sử đụng HCI đề thủy phân tách chất béo khỏi nền mẫu

Dung môi hữu cơ không phân cực sẽ hoà tan chất béo có trong nền mẫu, dựa

vao su phan bồ lỏng - long Trong dé tai này chúng tôi thực hiện chiết acid béo khỏi

nên mẫu bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ Mẫu đậu tương sau khi được thuỷ phân băng HCI, sẽ được chiết bảng hỗn hợp dung méi hitu co ether ethyli¢ và ether

petrol Dịch chiết hỗn hợp được loại ether băng máy cô quay chân không rồi đem dẫn xuất hoá tạo dẫn xuất ester methylic

2.3.2.2 Dân xuất hóa tao FAME

Có nhiều phương pháp đẻ tạo dẫn xuất ester methylic của acid béo, trong đề tài này chúng tôi đã khảo sát 3 phương pháp khác nhau để dẫn xuất acid béo về

dạng FAME như sau:

- Su dung dung dich natri methylat trong methanol

- Su dung dung dich bor florid trong methanol

- Sử dụng dung dịch natri hydroxid trong methanol phéi hep boron florua trong methanol

2.3.2.3 Phan tich bang GC-MS

Sử dụng cột phân cực SP 2380 (30m x 0,25 mm x 0,2 um) có ban chất là

poly(dicyano dimethyl) siloxan

Tính chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các

tạp chất hoặc các chất khác Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu

trắng mẫu trăng có thêm chất chuẩn

Trong sắc ký khí khối phổ có thể xác định tính chọn lọc, đặc hiệu thông qua

thư viện phổ chuẩn các acid béo Dựa vào các mảnh phô có thẻ xác định sự có mặt

của các acid béo

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính

Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến

tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn với nồng độ của chất đó

Phương trình hồi quy tuyến tính y=axx+b

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn

x là nông độ chất khảo sát

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOO)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) 1a néng độ thấp nhất của chất

phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong

điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của

chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nên bằng 3

(S/N =3)

Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất của

chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ