Sinh thái vi sinh vật ở môi trường axit khắc nghiệt tại sông Tinto

Sinh thái vi sinh vật ở môi trường axit khắc nghiệt tại sông Tinto

Sinh thái vi sinh vật ở môi trường axit khắc nghiệt

tại sông Tinto

GVHD : GS.TS Trần Linh Thước

Đặc tính sinh thái, sinh lý đặc biệt

Môi trường acid

Vi sinh vật phát triển dưới các điều

kiện

Sự trao đổi chất

Chủng vi sinh vâât và môi trường acid đều đang được quan tâm

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Dòng sông Tinto

Khu vực có điều kiện axit khắc nghiệt được biết đến

pH từ 1,5-3,1 Sắt : 0,4 – 20,2 g/l Đồng: 0,02 – 0,7 g/l Kẽm: 0,02 – 0,56 g/l

Hình 1: Vị trí sông Tinto và vị trí lấy mẫu được sử dụng trong nghiên cứu

 Một số vi sinh vâât hiêân diêân ở sông Tinto đã được nghiên cứu trước đó:

- Acidithiobacillus ferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans)

hóa Fe và S

của chúng.

- Leptospirillum spp

- Ferroplasma spp.

có thể là quan trọng hơn Acidithiobacillus ferrooxidans trong viêêc tạo ra

môi trường acid

- Lai phân tử phát huỳnh quang tại chỗ (FISH)

- Điện di gel gradient biến tính (DGGE) và tạo dòng

Đã ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái vi sinh vật

Vi khuẩn oxy hóa

Fe

Một số vấn đề được đặt ra

- Mô tả sâu đăâc điểm của tính đa dạng vi sinh vâât và thành phần của hêâ sinh thái sông Tinto.

- Cung cấp thông tin đầy đủ về vi sinh vâ ât ở sông Tinto nhằm đề xuất mô hình địa chất vi sinh đối với hê â sinh thái đôâc đáo này.

Mục tiêu

- Kiểm tra các thông số hóa lý trên sông Tinto

- Phân tích các mẫu thu từ sông Tinto bằng các phương pháp:

+ DGGE fingerprint + Giải trình tự + Xây dựng cây phát sinh loài + Kiểm tra tổng số tế bào + Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

Nội dung nghiên cứu

Thu thâp mẫu

Trích ly DNA và RNA

PCR, DGGE và giải trình tự

Phân tích phát sinh loài

2 Phương pháp

Kiểm tra các thông số hóa lý

Nhuộm DAPI đếm tế bào và lai phân tử phát huỳnh quang tại

chỗ (FISH)

Tạo mẫu dò oligonucleotide

b Kiểm tra các thông số hóa lý

Sự truyền điện, pH, tiềm năng oxy hóa khử, nồng độ oxi  Đo tại chỗ sử dụng điện cực đặc hiệu:

c Tách chiết DNA và RNA

Màng lọc Millex – GS Millipore Xử lý đệm SET và để qua đêm

Tủa Axit nucleic Ly tâm sau đó rửa bằng cồn Để khô chân không và tạo huyền phù trong nước Milli

-Q

d PCR, DGGE và giải trình tự

PCR

 Khuếch đại trình tự các gene thu được từ các mẫu trên sông Tinto

Điện di gel gradient biến tính (DGGE)

 Là kỹ thuật phân tách DNA dựa trên tính nóng chảy không hoàn toàn của phân tử DNA sợi đôi trong gel polyacrylamide chứa gradient nồng độ các chất biến tính.

+ Sự nóng chảy của những phân đoạn DNA xảy ra tại những vùng nóng chảy nhất định.

+ Khi một vùng có nhiệt độ nóng chảy thấp nhất tiến đến nhiệt độ nóng chảy của nó ở vị trí đặc biệt trong gel gradient biến tính thì xảy ra sự biến đổi của chuỗi xoắn DNA tại phân tử nóng chảy không hoàn toàn và sự di chuyển của phân tử gần như dừng lại.

+ Sự khác nhau về trình tự nucleotide trong những vùng nóng chảy của phân tử DNA sẽ tạo ra nhiệt độ nóng chảy và các phân tử có trình tự khác nhau sẽ phải ngừng di chuyển ở các vị trí khác nhau trên gel.

Quy trình điện di gel gradient biến tính (DGGE)

Điều kiện chạy gel:

Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

- Giải trình tự bằng máy giải trình tự Applied Biosystems 373S DNA

- Xây dựng xây phát sinh loài bằng công cụ ARB package và công cụ

Pasimony ARB

 Nghiên cứu đa dạng di truyền của các tập đoàn vi sinh vật trong các môi trường sinh thái khác nhau

 Đánh giá mức độ đa dạng của hệ thống sinh thái sông Tinto

Ứng dụng của kỹ thuật điện di gel gradient biến tính (DGGE)

Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật DGGE

Ưu điểm:

+ Cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu trên cùng một gel

+ Có thể nhận biết đến loài sau khi đọc trình tự các băng cắt từ gel hoặc lai với các mẫu dò đặc hiệu

Hạn chế:

+ Chỉ thực hiện được với đoạn DNA có kích thước nhỏ <= 500bp

+ Không phân tách được tất cả đoạn 16S rRNA thu từ mọi cá thể VSV

e Đếm tế bào và lai phân tử phát huỳnh quang tại chỗ - FISH

Nguyên tắc : Sự bắt cặp bổ sung của mẫu dò với trình tự mục tiêu.

Chuẩn bị mẫu, mẫu dò

2 3

1 Các thông số hóa lý

g/l g/l

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

100

% m

ẫu th

u đ ược sả

n p hẩ

8, R T9, R T10 (T 10 /19 99) th

u đ ược sp P CR

Vi khuẩn cổ (Archaea)

•

RT

1, RT

4, R T5, R T9 (T6 /19 99) th

u đ ược sả

n p hẩ

m PC R

Quang dưỡng oxy (oxygenic

DGGE Fingerprint của rRNA 16S và RT rRNA 16S sử dụng mồi cho giới vi khuẩn (Bacteria)

Bands lặ p lại

Tổng cộng các band thu được (khoảng 80)  được cắt ra PCR lại  tinh

sạch và giải trình tự

Thu được tổng cộng 57 band có thể

Nitrospira phylum

Các liên kết phát sinh loài của trình tự DGGE có độ tương đồng mạnh với Leptospirillum spp.

Mẫu dò đặc hiệu cho các nhóm

Ảnh hiển vi huỳnh quang của vi khuẩn từ sông Tinto

TB nhuộm DAPI TB lai với mẫu dò đặc

EUB338 ALF968 ADC638 BET42a GAM42a THIO1 ACT465a ACT465b ACT465

• Sông Tinto là môi trường khắc nghiệt có độ pH có tính axit cao không liên tục dọc theo sông và nồng độ kim loại nặng cao.

• Việc sử dụng các kỹ thuật phân tử sinh thái (DGGE, FISH) cho phép lượng hóa tốt hơn các quần thể vi sinh vật khác nhau và cung cấp sự mô tả chính xác về tính đa dạng của prokaryote tại dòng sông này.

• Có sự xuất hiện mối tương quan tốt giữa hai phương pháp tiếp cận sử dụng:

- Phân tích trình tự các bands DGGE có sự hiện diện của các chủng liên quan đến: Leptospirillum spp., Acidithiobacillus ferrooxidans,

Acidiphilium spp., "Ferrimicrobium acidiphilum," Ferroplasma acidiphilum, và Thermoplasma acidophilum

- Kết quả FISH của các nhóm phát sinh loài khác nhau với các mẫu dò oligonucleotide rRNA cho thấy hơn 80% tế bào liên kết với vi

khuẩn, chỉ một phần nhỏ tương ứng với cổ khuẩn Các thành viên của Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, và Acidiphilium spp., tất cả đều liên quan đến chu kỳ sắt, chiếm hầu hết các vi sinh vật prokaryote được phát hiện

VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

• Hiểu được kỹ thuật điện di DGGE và FISH đồng thời thấy được ứng dụng ưu việt của các kỹ thuật này trong nghiên cứu sự đa dạng sinh thái vi sinh vật

axit và kim loại)

V THU HOẠCH

Cảm ơn thầy và các bạn đã quan tâm theo

dõi