Xây dựng quy trình tái sinh cây hành đẻ (Allium Wakegi) từ callus và bước đầu đánh giá ảnh hưởng của colchicine đến sự cảm ứng đa bội

Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 24h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS.... Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả nă

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

PHẠM THỊ THU TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ðẺ

(ALLIUM WAKEGI) TỪ CALLUS VÀ BƯỚC ðẦU

ðÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA COLCHICINE ðẾN

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin ñược trích dẫn trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2014

Tác giả luận văn

Phạm Thị Thu Trang

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội, khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật ñã truyền ñạt kiến thức trong suốt quá trình học tập, cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã ñịnh hướng, trực tiếp hướng dẫn và ñóng góp cụ thể trong quá trình thực hiện luận văn của tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm ñề tài

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, bạn bè, người thân ñã ñộng viên cũng như quan tâm, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường và thực tập tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2014

Tác giả luận văn

Phạm Thị Thu Trang

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii

PHẦN I MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích, yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây hành ðẻ (Allium wakegi) 4

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại 4

2.1.2 ðặc ñiểm sinh học của cây hành ðẻ 5

2.1.3 Giá trị của cây hành tỏi 6

2.1.4 Tình hình sản xuất hành tỏi ở Việt Nam 8

2.2 Cơ chế tác ñộng của Colchicine lên tế bào 8

2.2.1 Bản chất của colchicine 8

2.2.2 Cơ chế tác ñộng của colchicine ñến quá trình phân bào 9

2.3 Các nghiên cứu về tạo callus và tái sinh cây trên hành tỏi 10

2.4 Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội trên thực vật 12

2.4.1 Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội 12

2.4.2 Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội hành tỏi 13

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm 17

3.1.1 ðối tượng 17

3.1.2 Vật liệu 17

3.1.3 ðịa ñiểm 17

3.2 Nội dung nghiên cứu 17

3.2.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây hành ðẻ từ callus 17

3.2.2 Xác ñịnh phương pháp xử lý colchicine in vitro thích hợp trên cây hành ðẻ 19

3.2.3.Bước ñầu ñánh giá ñộ bội của cây thu ñược sau xử lý colchicine 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Quy trình kỹ thuật tách ñỉnh chồi 20

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 21

3.3.3 Phương pháp xử lý bằng colchicine 21

3.3.4 Phương pháp ñánh giá ñộ bội của chồi tái sinh 21

3.3.5 ðiều kiện thí nghiệm 22

3.3.6 Bố trí thí nghiệm 22

3.3.7 Phương pháp theo dõi 23

3.3.8 Xử lý số liệu 23

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ðẺ (Allium wakegi) TỪ CALLUS 24

4.1.1 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự hình thành callus từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ 24

4.1.2 Ảnh hưởng của ñường và chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh chồi từ callus 27

4.1.3 Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi 31

4.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất ñến sự ra rễ của cây tái sinh 32

4.2 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ COLCICINE THÍCH HỢP ðỐI VỚI CÂY HÀNH ðẺ 37

4.2.1 Phương pháp 1: nuôi cấy ñỉnh chồi cây hành ðẻ trong môi trường có bổ sung của colchicine trong 6 tuần 37

4.2.2 Phương pháp 2: ðỉnh chồi ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung colchicine trong 2 tuần sau ñó cấy chuyển sang môi trường không có colchicine 39

4.2.3 Phương pháp 3: lắc callus trong môi trường có bổ sung colchicine 42

4.2.4 Bước ñầu ñánh giá ñộ bội của cây thu ñược sau xử lý colchicine 47

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 ðề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh

trưởng sau 6 tuần nuôi cấy 25

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của picloram ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh chồi sau 6 tuần nuôi cấy 26

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các loại ñường và chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự tạo chồi từ callus - sau 6 tuần nuôi cấy 29

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi thu ñược sau xử lý colchicine (sau 4 tuần nuôi cấy) 31

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của IAA ñến sự ra rễ của cây tái sinh 33

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến sự ra rễ của cây

tái sinh 35

Bảng 4.7 Sức sống và sự tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ (Allium wakegi) nuôi cấy theo phương pháp 1 - (sau 6 tuần nuôi cấy) 37

Bảng 4.8 Sức sống và khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ (Allium wakegi) nuôi cấy theo phương pháp 2 - (sau 6 tuần nuôi cấy) 40

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 24h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 42

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 36h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 43

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng tái

sinh chồi của callus khi lắc trong 48h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 44

Bảng 4.12 Kết quả phân nhóm cây tạo thành sau xử lý colchicine 47

Bảng 4.13 Kết quả phân nhóm cây tạo thành sau xử lý colchicine

theo số lượng và kích thước khí khổng (%) 50

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử colchicine 1

Hình 2.2 Quá trình phân bào bình thường và ảnh hưởng của colchicine 9

Hình 4.1 Callus tạo thành trên môi trường 2,4D 1

Hình 4.2 Callus hình thành trên môi trường bổ sung picloram 1

Hình 4.3 Ảnh hưởng của picloram ñến sự phát sinh callus 1

Hình 4.4 Ảnh hưởng của ñường và BA ñến sự phát sinh chồi của callus thu ñược trên môi trường bổ sung picloram 1

Hình 4.5 Ảnh hưởng của ñường và BA ñến sự phát sinh chồi của callus thu ñược trên môi trường bổ sung 2,4D 1

Hình 4.6 Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi 32

Hình 4.7 Ảnh hưởng của IAA ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra rễ của cây tái sinh 34

Hình 4.8 Ảnh hưởng của colchicine (xử lý theo phương pháp 1) ñến sự phát sinh chồi và callus của ñỉnh sinh trưởng 39

Hình 4.9 Ảnh hưởng của colchicine (xử lý theo phương pháp 2) ñến sự phát sinh chồi và callus của ñỉnh sinh trưởng 41

Hình 4.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 24h 44

Hình 4.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 36h 45

Hình 4.12 Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 48h 45

Hình 4.13 So sánh tỷ lệ mẫu sống khi lắc callus trong 24h, 36h và 48h 46

Hình 4.14 So sánh tỷ lệ mẫu phát sinh chồi khi lắc callus trong 24h,

36h và 48h 46

Hình 4.15 So sánh hình thái cây nhóm 1 và nhóm 2 1

Hình 4.16 Tế bào khí khổng cây hành ðẻ sau xử lý colchicine 48

Hình 4.17 Khí khổng ở các nhóm cây 1 – 4 49

PHẦN I

MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Hành ðẻ (Allium wakegi) là cây rau gia vị ñược trồng khá phổ biến ở

vùng ñồng bằng sông Hồng, cho thu nhập cao và ñược thị trường ưa chuộng do

có mùi vị thơm ngon khi chế biến, dễ dàng bảo quản và vận chuyển

Giống hành ðẻ Bắc Ninh ñược trồng khá phổ biến tại xã ðại Phúc, Bắc Ninh và xã Tây Tựu, Từ Liêm, Hà Nội Về mùa vụ, hành ðẻ ñược người dân trồng vào tháng 7 với mật ñộ 65 khóm/m2, sau khi trồng 20 – 30 ngày 1 cây có thể ñẻ thêm 5 – 6 nhánh, có những cây có thể ñẻ ñến 14 nhánh Các nhánh mọc thêm có thể tỉa ñể trồng sang ruộng khác hoặc thu hoạch ñể sử dụng thân lá Cây hành ðẻ có thể cho thu hoạch liên tục từ tháng 8 ñến tháng 2 với năng suất 10 tạ/sào ðến cuối tháng 2 ñầu tháng 3 cây bắt ñầu hình thành củ, người dân thường thu củ về phơi khô ñể giữ giống

Ngoài giá trị về kinh tế, hành ðẻ còn có giá trị dược lý rất cao Hành chứa rất nhiều thành phần hóa học có tác dụng phòng chữa bệnh như acid malic, phytin và alylsulfit, tinh dầu, ñặc biệt là chất kháng sinh alicine hòa tan trong nước Alicine giúp diệt khuẩn rất mạnh ñối với một số bệnh như thương hàn, lỵ,

vi trùng tả, trực khuẩn, bệnh bạch hầu Ngoài ra, hành còn có tác dụng hạ thấp

mỡ trong máu, có hiệu quả trị liệu nhất ñịnh ñối với bệnh tim mạch Nước ép hành rất tốt cho việc ñiều trị bệnh thiếu máu Hợp chất lưu huỳnh có trong gia vị này giúp ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư

Hành ðẻ là giống hành ñịa phương có hương vị thơm ngon, thích nghi với ñiều kiện khí hậu và ñất ñai của miền Bắc Việt Nam Tuy nhiên trong thực tế sản xuất do có kích thước nhỏ, năng suất thấp nên hiệu quả kinh tế là chưa cao Do

ñó việc cải tiến giống hành ðẻ nhằm duy trì ñược các ñặc tính tốt, có năng suất cao là yêu cầu cấp bách của thực tiến sản xuất

Hiện nay phương pháp cải tiến giống sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào kết hợp xử lý ñột biến invitro ñã có những thành công nhất ñịnh trên rất nhiều ñối tượng cây trồng khác nhau như dưa hấu, cam quýt, cẩm chướng, dưa chuột, ớt, … (Mercedes Soriano, 2005; Wang Feng bao, 2009; Hà Thị Thuý, 2005) ðặc biệt, trên thế giới ñã có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy tái sinh cây họ hành tỏi từ callus và xử lý tạo ñột biến bằng colchicine trên cây hành hoa, tỏi, hành tây, (Novak, 1983; Zhou Xiang-jun, 2008; Ping Song và cộng sự, 1993) nhằm tạo ra giống mới có nhiều ñặc tính tốt như năng suất cao, tăng sức chống chịu bệnh, tăng khả năng chữa bệnh, Tuy nhiên, ở Việt Nam hành tỏi vẫn chưa ñược quan tâm nghiên cứu nhiều, ñặc biệt là những nghiên cứu về xây dựng quy trình tái sinh cây từ callus và tạo cảm ứng ña bội bằng cách xử lý colchicine

Trên cơ sở những vấn ñề nêu trên, chúng tôi tiến hành ñề tài: “Xây dựng

quy trình tái sinh cây hành ðẻ (Allium wakegi) từ callus và bước ñầu ñánh giá ảnh hưởng của colchicine ñến sự cảm ứng ña bội”

1.2 Mục ñích, yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Xây dựng ñược quy trình tái sinh cây từ callus hành ðẻ và bước ñầu xác ñịnh ñược phương pháp xử lý colchicine in vitro phù hợp cho tạo ña bội hóa ở cây hành ðẻ

1.2.2 Yêu cầu

- Xác ñịnh ñược môi trường tạo callus từ ñỉnh chồi

- Xác ñịnh ñược môi trường tạo thể tiền chồi từ callus

- Xác ñịnh ñược môi trường tái sinh cây từ callus

- Xác ñịnh ñược môi trường nhân nhanh cây sau tái sinh

- Xác ñịnh ñược môi trường tạo cây hoàn chỉnh

- Bước ñầu xác ñịnh ñược phương pháp xử lý colchicine in vitro thích hợp cho tạo ña bội hóa

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

ðề xuất ñược quy trình tái sinh cây in vitro thông qua callus và bước ñầu

ñề xuất ñược phương pháp xử lý Colchicine in vitro cho khả năng tạo ña bội ñối

với cây hành ðẻ (Allium wakegi) làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống mới

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây hành đẻ (Allium wakegi)

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Chi Hành (Allium) là chi thực vật có khoảng 1.250 loài ựược phân loại trong họ Hành (Alliaceae) trong ựó có: hành tây (Allium cepa L.), hành ta (Allium

fistulosum L.), tỏi tây (A porium L.), tỏi ta (A sativum L.), hẹ (A tuberosum Rottll Et Spreng), kiệu (A chinense G Don)Ầ

Hành đẻ (Allium wakegi) là giống hành ựịa phương ựược trồng chủ yếu ở

Bắc Ninh, Tây Tựu, Vĩnh PhúcẦ Về nguồn gốc và ựặc ựiểm giống, cây hành đẻ ựược các chuyên gia ựịnh dạng thuộc:

Theo các nghiên cứu về hành tỏi, cây hành Allium wakegi ựược trồng chủ

yếu ở Nhật Bản, Trung Quốc và các quốc gia vùng đông nam châu Á Là cây

nhân giống vô tắnh ựiển hình, Allium wakegi mang nhiều ựặc ựiểm hình thái trung gian giữa hành củ (Allium ascalonicum) và hành hoa (Allium fistulonicum)

Năm 1984, Yosuke Tashiro ựã tiến hành phân tắch bộ genom của loài

Allium wakegi bằng cách lai giữa cây tứ bội Allium wakegi (2n = 32) với cây

hành củ lưỡng bội (2n = 16) và với cây hành hoa lưỡng bội (2n = 16) thu ựược 2 dạng con lai tam bội Khi quan sát hình thái và số lượng nhiễm sắc thể kỳ trung gian I ở tế bào mẹ hạt phấn của 2 dạng con lai tam bội ựều thấy xuất hiện 8 cặp

lưỡng trị và 8 nhiễm sắc thể kép, ựiều ựó cho thấy Allium wakegi là một thể

lưỡng bội khác loài có bộ genom (2n = 16) gồm 8 nhiễm sắc thể của hành củ (A

ascalonicum) và 8 nhiễm sắc thể của hành hoa (A fistulosum)

Noor Sugiharto Arifin và cộng sự, 2000 ñã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD

ñể nghiên cứu sự ña dạng di truyền giữa giống hành củ Indonesia (Allium cepa

var ascalonicum) và Allium x wakegi ñồng thời xác ñịnh nguồn gốc của giống Allium wakegi bằng cách phân tích RFLP bộ gen lạp thể Qua nghiên cứu này,

Noor Sugiharto Arifin ñã chứng minh rằng có khoảng cách di truyền lớn giữa

giống hành củ và giống hành Allium x wakegi ðồng thời ông phát hiện rằng, sự biến dị di truyền lớn giữa các giống hành wakegi ở tây Java – Indonesia chứng tỏ ñây có thể là một trong những trung tâm khởi nguyên của giống hành wakegi Từ

những phân tích RFLP khi nhân dòng gen matK của cpDNA ñã chứng minh

ñược Allium wakegi có nguồn gốc từ phép lai thuận nghịch giữa giống hành củ (A ascalonicum) và giống hành hoa (A fistulosum)

2.1.2 ðặc ñiểm sinh học của cây hành ðẻ

* Hệ rễ

Hệ rễ hành lá thuộc loại rễ chùm, phát triển kém, rễ tập trung ở lớp ñất mặt, khả năng chống chịu khô hạn kém Rễ bắt ñầu sinh trưởng ở nhiệt ñộ 2-30C Hệ rễ hành có nhiều sợi dài, phân nhánh yếu, chúng ñược bao phủ một lượng lớn lông hút Loại rễ này rất dễ khô héo khi bị nhổ lên Vì thế, ñất trồng thích hợp là ñất cát pha, ñất thịt nhẹ, khi trồng phải lên luống ñể tránh úng ngập, nhưng cũng cần tưới ẩm thường xuyên

* Thân, lá

Thân thật của hành rất ngắn, ñã thoái hóa, chúng là dạng ñế giò nằm sát ngay dưới thân giả (thân củ) Trên thân thật có mầm sinh dưỡng và sinh thực, những mầm này ñược che phủ bởi những bẹ lá dày, mọng nước (cơ quan sử dụng)

Thân củ hành bao gồm một số nhánh (ánh, tép) ñược liên kết với nhau do những màng mỏng, khi trồng cần tách rời các nhánh Mỗi củ có 7-8 nhánh, nhiều trên 10 nhánh tùy theo giống và kỹ thuật trồng trọt

Thân lá hành ðẻ có màu xanh nhạt hơn so với hành hoa, cây trưởng thành

có chiều cao từ 40 – 45 cm Củ hành ðẻ có kích thước nhỏ hơn hành củ, kích thước tối ña chỉ ñạt 1 – 2 x 2 – 3cm Củ trưởng thành có màu ñỏ tím, có mùi hăng, khả năng bảo quản tốt hơn hành củ

Lá thật ñầu tiên của hành là một lá mầm, sau khi nảy mầm 10-15 ngày tùy theo ñiều kiện thời tiết Lá hành lá hình ống, tròn, trên lá ñược phủ một lớp sáp Thời kỳ ñầu lá hành sinh trưởng rất chậm, sau khi nảy mầm chỉ sinh trưởng ñược một vài centimet (cm), ở thời kỳ này xới xáo, trừ cỏ dại là công việc hết sức quan trọng Tuổi thọ của lá phụ thuộc và sự sinh trưởng, lá sẽ chết dần, cũng là quá trình tạo củ

- Bẹ lá: Củ hành ñược tạo thành bởi số bẹ lá Số bẹ lá thay ñổi phụ thuộc vào giống và kỹ thuật trồng trọt Bẹ lá sắp xếp trên thân theo hình xoáy ốc, khoảng cách giữa các bẹ lá càng nhỏ thì củ hành càng chặt, do ñó tăng khả năng bảo quản và vận chuyển, năng suất sẽ cao Vì khối lượng củ phụ thuộc vào số lượng bẹ lá, ñộ lớn và bề dày mỗi bẹ lá (Tạ Thu Cúc và cộng sự, 2000)

Về mùa vụ, hành ðẻ ñược người dân trồng vào tháng 7 với mật ñộ 65 khóm/m2, sau khi trồng 20 – 30 ngày 1 cây có thể ñẻ thêm 5 – 6 nhánh, có những cây có thể ñẻ ñến 14 nhánh Các nhánh mọc thêm có thể tỉa ñể trồng sang ruộng khác hoặc thu hoạch ñể sử dụng thân lá Cây hành ðẻ có thể cho thu hoạch liên tục từ tháng 8 ñến tháng 2 với năng suất 10 tạ/sào ðến cuối tháng 2 ñầu tháng 3 cây bắt ñầu hình thành củ, người dân thường thu củ về phơi khô ñể giữ giống

2.1.3 Giá trị của cây hành tỏi

Hành tỏi không chỉ ñược sử dụng làm thực phẩm mà còn là nguồn dược liệu quý giá ñược nhân dân biết ñến từ lâu Theo Ivanova E.P (1980) trong hành tỏi có các thành phần hoá học như sau: protein 3%, ñường tổng số 9%, vitamin C 30 –

3mg%, các vitamin A, B1, B2, PP và các chất khoáng Na, K, Ca, Mg, P, Fe, … Ngoài ra, hành tỏi còn chứa các chất diệt khuẩn ñặc biệt là các phitotoxit nên ñược

sử dụng ñể chữa nhiều loại bệnh, kích thích hoạt ñộng của tim, thận và ñường tiêu hoá

Hành chứa rất nhiều thành phần hóa học có tác dụng phòng chữa bệnh như acid malic, phytin và alylsulfit, tinh dầu, ñặc biệt là chất kháng sinh alicine hòa tan trong nước Alicine giúp diệt khuẩn rất mạnh ñối với một số bệnh như thương hàn, lỵ, vi trùng tả, trực khuẩn, bệnh bạch hầu (Phạm Hoàng Hổ, 2006) Hành cũng chứa chất kháng khuẩn fitoncidi Khi có dịch bệnh lây nhiễm qua ñường hô hấp, nên ăn hành sống ñể dự phòng Do chứa nhiều chất kháng sinh nên tinh dầu hành có tác dụng sát khuẩn mạnh, dùng thoa bên ngoài chữa mụn nhọt mưng mủ Vì hành có thể kích thích ñược tuyến mồ hôi nên còn ñược

sử dụng như một thức ăn giải ñộc Người ta vẫn nấu cháo hành ñể chữa cảm mạo, phong hàn, nhức ñầu Ăn cháo hành nóng cũng chữa ñau lưng, kiết lỵ

Ngoài ra, hành còn có tác dụng hạ thấp mỡ trong máu, có hiệu quả trị liệu nhất ñịnh ñối với bệnh tim mạch Nước ép hành rất tốt cho việc ñiều trị bệnh thiếu máu Hợp chất lưu huỳnh có trong gia vị này giúp ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư

Thường xuyên ăn hành sẽ giúp bạn hạ thấp nồng ñộ cholesterol và huyết

áp cao, từ ñó giúp ngăn ngừa chứng sơ vữa ñộng mạch, tiểu ñường, giảm nguy cơ ñau tim hoặc ñột quỵ Tác dụng hữu ích này có ñược là nhờ hợp chất sulphua, crom và vitamin B6 trong cây hành Trong một nghiên cứu ở hơn 100.000 người, các nhà khoa học ñã phát hiện những người có chế ñộ ăn nhiều hành giúp giảm ñược 20% nguy cơ ñau tim

Trong hành có chứa rất nhiều fructo-oligosac-charides, chất này kích thích

sự phát triển của fibidobacteria khoẻ mạnh và gây ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại tiềm ẩn trong ruột kết Ngoài ra, fructo-oligosac-charides còn có thể

làm giảm sự phát triển khối u của các tế bào ung thư ruột kết (Phạm Hoàng Hổ, 2006)

2.1.4 Tình hình sản xuất hành tỏi ở Việt Nam

Ở nước ta, hành tỏi là một trong 3 loại sản phẩm (cùng với ớt và hạt tiêu) giữ vai trò chắnh trong mặt hàng gia vị xuất khẩu của Việt Nam, với sản lượng xuất khẩu hơn 2.000 tấn/năm Hành tỏi là cây vụ ựông quan trọng của vùng đồng bằng sông Hồng, trồng hành tỏi có hiệu quả kinh tế cao hơn các cây trồng khác như lúa, bắ xanh, dưa lêẦ Hành tỏi ựược trồng ở Tiên Sơn (Bắc Ninh), Mê Linh (Vĩnh Phú), Hà Nội, Hưng Yên, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận và đà Lạt (Lâm đồng)Ầ Ở miền Bắc Việt Nam, hành tỏi ựược trồng nhiều ở Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Dương Theo số liệu thống kê năm

2011 của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các tỉnh Bắc Giang, Bắc Ninh

và Hải Dương, diện tắch trồng hành tỏi vụ ựông xuân ở Bắc Ninh là 366.1 ha, sản lượng 5.407 tấn; Bắc Giang là 1.340 ha, sản lượng 19.588 tấn và Hải Dương diện tắch ựạt hơn 5 nghìn ha, với tổng sản lượng hơn 51 nghìn tấn ựem lại thu nhập khá cao cho người dân

2.2 Cơ chế tác ựộng của Colchicine lên tế bào

2.2.1 Bản chất của colchicine

Colchicine là một alkaloid có ở nhiều

loài thực vật nhưng có chủ yếu ở trong củ và

hạt loài Colchicum autumnale Colchicine có

công thức phân tử là C22H25O6N, khối lượng

phân tử là 1399.4 dvC

Colchicine khi kết tinh có dạng tinh

thể hình kim ngắn, có màu vàng nhạt Nhiệt

ựộ nóng chảy là 1550C, tan trong rượu,

cloroform, nước lạnh, hầu như không tan

trong ete (http://en.wikipedia.org/wiki/Colchicine)

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử colchicine

(Nguồn: https://www.medicalook.com)

Colchicine có cấu trúc phức tạp gồm 3 vòng: vòng 1 có 6 carbon; vòng 2

và 3 có 7 carbon Vòng 1 có 3 nhóm methyl ete; vòng 2 có 1 nhóm acetyl amino

Ở vòng 3 có một nhóm methyl ete và 1 nhóm ketone Vòng 3 có bản chất là một cấu trúc tropolone, phân tử hydro có thể di chuyển tự do giữa phân tử oxy và nhóm CH Như vậy Colchicine là một tropolone methyl ete (Stanley và cộng sự, 1965)

Colchicine có khả năng ngăn cản sự phân ly nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào và có tác dụng chống viêm trong ñiều trị bệnh gout cấp tính

2.2.2 Cơ chế tác ñộng của colchicine ñến quá trình phân bào

Colchicine có tác dụng ñến sự phân bào bằng cách ức chế sự hình thành thoi vô sắc ở kỳ giữa, ngăn cản các nhiễm sắc thể con phân ly ở hậu kì Ở pha này các nhiễm sắc thể ñược nhân lên nhưng thoi vô sắc không hình thành nên không xảy ra sự phân ñều NST về 2 cực tế bào Kết quả tạo thành tế bào có số lượng NST tăng gấp bội

Hình 2.2 Quá trình phân bào bình thường và ảnh hưởng của colchicine

(Nguồn: http://www.agron.missouri.edu)

Cơ chế phân tử của quá trình này như sau: thoi vô sắc ñược cấu tạo từ các

vi ống (microtubules) (sợi có bản chất là các nhị phân tử a,b-tubulin gắn với nhau) Trên vi ống luôn có 2 quá trình song song là polymer (gắn vào) và

Phân bào bình thường Ảnh hưởng của colchicine

depolymer hóa (tách ra) của các nhị phân tử a, b – tubulin tạo thành 2 ñầu âm (–)

và dương (+) trên vi ống Thoi vô sắc ñược hình thành trong quá trình phân bào nhờ quá trình polymer chiếm ưu thế trên vi ống Khi xử lý tế bào bằng colchicine các phân tử colchicine sẽ gắn vào các nhị phân tử a,b – tubulin làm giảm hiệu quả tập trung của chúng dẫn ñến quá trình depolymer hóa vi ống nên thoi vô sắc không hình thành ñược (Nguyễn Thị Phương Thảo, 2011)

Vai trò của thoi vô sắc trong quá trình phân bào là giúp cho các NST sau khi ñược nhân ñôi sẽ ñi về 2 cực của tế bào một cách chính xác Khi thoi vô sắc không hình thành làm cho các sợi NST không chạy về 2 cực của tế bào, cuối cùng, lượng vật chất di truyền ñã nhân ñôi tồn tại ở 1 tế bào hoặc phân chia không ñều trong 2 tế bào con, hình thành nên tế bào ñược ña bội hóa: từ 2n trở thành 3n, 4n (Stanley và cộng sự, 1965)

Theo những nghiên cứu của Trần Duy Quý và Lê Duy Thành, 1997 thì colchicine ở dạng dung dịch có khả năng khuếch tán mạnh vào mô thực vật Hiện tượng ña bội hóa chỉ xảy ra khi có tác dụng của colchicine ñến những mô ñang phân hóa mạnh

2.3 Các nghiên cứu về tạo callus và tái sinh cây trên hành tỏi

Trên ñối tượng hành tỏi, callus có thể ñược tạo thành từ rất nhiều loại mẫu khác nhau như: vảy củ, rễ, ñỉnh chồi, hoa, bầu hoa, hạt phấn… (Haim D Rabinowitch và cộng sự, 1990)

Suh và Park, 1986 ñã tạo ñược callus bằng cách nuôi cấy ñỉnh chồi tỏi trong môi trường B5 có bổ sung NAA Callus còn có thể ñược tạo thành ở cả

giống A.flavum, A fistulosum, A monanthum, A.altaicum, A.roylei và trên các con lai chéo của A cepa × A fistulosum, A cepa × A galanthum, A.cepa × A

oschanii và A fistulosum × A.cepa (Haim D Rabinowitch và cộng sự, 1990)

Cảm ứng tạo callus còn có thể tạo thành bằng cách nuôi cấy mẫu ở các công thức môi trường khác nhau Dunstan và Short, 1977 ñã tăng lượng muối amino phosphate và nitrate ở môi trường B5 tạo thành môi trường BDS rất phù

hợp ñể nuôi cấy callus từ rất nhiều nguồn mẫu và trên nhiều loại cây họ hành tỏi khác nhau

Quá trình cảm ứng và tiếp tục phát triển của callus trên môi trường phụ thuộc chặt chẽ vào các auxin ngoại sinh ñược bổ sung Các loại thuốc diệt cỏ tổng hợp như: 2,4-diclorophenoxyacetic acid (2,4D), 2,4,5-trichloro-phenoxyacetic acid (2,4,5-T), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram),

và 3,6-dichloro-2 methoxybenzoic acid (Dicamba) có tác ñộng rất hiệu quả ñến quá trình cảm ứng và phát triển của callus ở rất nhiều cây thuộc họ hành tỏi Sự

có mặt của cytokinin trong môi trường dinh dưỡng không thực sự cần thiết và chỉ khi có sự kết hợp của auxin và cytokinin thì callus mới hình thành (Haim D Rabinowitch và cộng sự, 1990)

Công thức môi trường và các chất ñiều tiết sinh trưởng thích hợp cho quá trình tăng sinh tế bào và hình thành callus thì không kích thích ñược callus phát sinh cơ quan ðể kích thích callus phân hóa hình thành các cơ quan như chồi, rễ… cần chuyển sang môi trường có nồng ñộ auxin thấp hoặc bổ sung thêm cytokinin Trên các cây thuộc họ hành tỏi (hành, tỏi, hẹ) môi trường cảm ứng tạo callus thường là môi trường có bổ sung 2,4D với nồng ñộ cao, khi cấy chuyển callus sang môi trường không có 2,4D hoặc môi trường có nồng ñộ 2,4D thấp (từ 0,2 mg/l trở xuống) kết hợp với cytokinin (kinetin, 2ip hoặc BAP) thì sẽ kích thích quá trình hình thành chồi từ callus (Novak, F.J và cộng sự, 1986)

Phillip và Luteyn (1983), ñã phát triển quy trình nuôi cấy mô tế bào cây

họ hành tỏi sử dụng picloram Picloram là một nguồn auxin rất thích hợp cho các

cây họ hành tỏi như (A fistulosum, A altaicum, A galanthum và A roylei) vì nó

vừa có thể sử dụng ñể tạo ña chồi trong nuôi cấy meristem cũng như cảm ứng tạo callus ðể cảm ứng tạo callus cần bổ sung 0,75 mg/l picloram và 2 mg/l BAP Cấy chuyển callus tạo thành sang môi trường có nồng ñộ picloram và BAP thấp (0,03 mg/l và 0,35 mg/l) callus sẽ phân hóa tạo chồi

Trên cây tỏi (A sativum), tác giả Havranek và cộng sự (1973), ñã nuôi

cấy callus ñể phát sinh ñỉnh chồi trong môi trường có nồng ñộ cytokinin cao

(kinetin 47,5 µM) và nồng ñộ IAA trung bình (11,4 µM) Các cây tạo thành khi ñược trồng ra ñất ở thế hệ ñầu không phát sinh chồi mới, tuy nhiên ở thế hệ sinh sản vô tính tiếp theo cây bắt ñầu sinh trưởng, phát triển bình thường

Môi trường không có chất ñiều tiết sinh trưởng rất thích hợp cho quá trình

phát sinh chồi từ callus trên cây tỏi tây (A ampeloprasum) (Debergh và cộng sự,

1976) Callus ñược tạo thành khi nuôi cấy ñầu hoa cây tỏi tây thì dễ vỡ và có hình thái không ñồng nhất, khi chuyển sang môi trường có 10 ñến 80 µM BAP thì chồi ñược tạo thành với tần suất cao (Novak và cộng sự, 1981)

2.4 Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội trên thực vật

2.4.1 Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội

Các nhà khoa học tại ðH Nông nghiệp Pakistan (2005) nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý colchicine trên cây lúa mỳ giai ñoạn cây 5-7 lá Kết quả ñã tạo ra giống lúa mỳ vừa có khả năng tự thụ phấn cao, vừa ñược ña bội hóa

bộ NST

Mercedes Soriano và cộng sự (2005) cũng tiến hành các thí nghiệm nghiên

cứu ảnh hưởng của colchicine ñến nuôi cấy bao phấn cây lúa mỳ Triticum

aestivum L và kết luận ở nồng ñộ 300ppm trong 48h ñã làm tăng gấp ñôi tỷ lệ

kiểu hình ñơn bội kép

Năm 2009, Wang Feng bao, Fu Jin-feng và Dong Li-feng ñã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý kết hợp colchicine 0,05% với DMSO 2% ở 24h, 48h và 72h dưới các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau trong việc gây tứ bội hóa ở cây ñậu

Hà Lan Kết quả cho thấy, sau 48h xử lý ở 15 – 160C cho tỷ lệ sống sót cao nhất, ñồng thời thu ñược các dạng con có bộ NST ñược tứ bội hóa

Tại Việt Nam, Hà Thị Thúy và cộng sự (2005) ñã tạo thành công dạng tứ bội trên cây cam Xã ðoài, cam Vân Du bằng xử lý colchicine trên chồi invitro của các giống này Ngoài ra, tác giả còn tạo thành công dòng tứ bội của cây quýt Chum, Cam và bưởi Phúc Trạch khi xử lý colchicine trên cành invitro, xử lý thành công hạt của cây cam sành, cây bưởi ñỏ

Nguyễn Thị Phương Hoa (2005) ñã thành công khi xử lý colchicine trên chồi ðồng tiền invitro ở các nồng ñộ 0,01%, 0,05%, 0,1% ở các thời gian là 24h, 36h và 72h Kết quả thu ñược ở các nồng ñộ và thời gian xử lý trên ñều cho chồi biến dị Tuy nhiên, mức thời gian cho chồi biến dị cao nhất là 48h và ở nồng ñộ 0,1%

Viện nghiên cứu rau quả năm 2010 ñã tiến hành nghiên cứu tạo dòng ñơn bội kép ớt và dưa chuột phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai bằng phương pháp xử

lý colchicine (Trần Khắc Thi, 2010)

2.4.2 Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội hành tỏi

Novak (1983) ñã nuôi cấy những ñỉnh meristem ñể cảm ứng ña bội trên tỏi Những ñỉnh chồi (0,5 - 0,7mm) tách ra ñược xử lý colchicine (3000 mg/l) ngay sau khi cắt hoặc sau khi nuôi cấy một tuần ở phương pháp ñầu tiên, mẫu ñược nuôi cấy trong môi trường chứa agar và colchicine trong 7 ngày, sau ñó ñược rửa sạch và chuyển sang môi trường không có colchicine ở phương pháp thứ hai, colchicine cũng ñược bổ xung vào môi trường và tiếp tục nuôi cấy mẫu trong 2 ngày ở cả hai phương pháp, hiệu quả ñều tăng khi bổ xung 4% DMSO vào dung dịch colchicine Phương pháp thứ hai có hiệu quả cao hơn phương pháp thứ nhất, 35% cây tái sinh có bộ nhiễm sắc thể tam bội, và 14% cây có bộ nhiễm sắc thể dị thường, chứa cả số nhiễm sắc thể lưỡng bội và tam bội ở tế bào ñầu rễ ðỉnh meristem thích hợp hơn những cây còn nguyên vẹn trong thí nghiệm ñội

biến và chọn giống ña bội ở những giống Allium nhân vô tính

Năm 2008, tác giả Zhou Xiang-jun và Cheng Zhi-hui ñã thử nghiệm với 3 nồng ñộ của colchicine trên ñỉnh chồi tỏi cho thấy ở nồng ñộ colchicine là 0.1% cho kết quả ña bội tốt nhất Thông qua quan sát kích thước khí khổng ở lớp biểu

bì dưới của lá cho thấy cùng với sự phát triển của lá thì hiệu quả xử lý colchicine giảm dần Lá ñầu tiên cho hiệu quả ña bội tốt nhất

Trên giống hành là con lai F1 giữa Allium fistulosum x A cepa, tác giả

Ping Song và cộng sự, 1993 ñã tiến hành xử lý colchicine ở các nồng ñộ và thời

gian khác nhau ñối với callus tái sinh Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ chồi tái sinh từ callus ñược xử lý colchicine giảm dần khi tăng nồng ñộ colchicine hoặc thời gian xử lý Phân tích tế bào học của tế bào ñầu rễ cây tái sinh từ callus ñược

xử lý colchicine cho thấy số NST của tế bào ñã ñược tam bội hóa Callus ñược

xử lý với 0,1 hoặc 0,2% colchicine trên môi trường BDS trong 48 ñến 72h cho kết quả ña bội cao nhất

Theo những nghiên cứu của Zhang shuxin và cộng sự về tác dụng của colchicine tạo cảm ứng ña bội trên callus của giống hành Trung Quốc cho thấy khi tăng dần nồng ñộ của colchicine và thời gian xử lý, tỷ lệ chết của mẫu tăng Nồng ñộ colchicine 0,06% trong 72h cho hiệu quả cảm ứng ña bội tốt nhất Tỷ lệ callus cảm ứng cao và callus không bị tổn hại nhiều Từ callus ñã tái sinh ñược cây ña bội hoàn chỉnh ñã có sự sai khác có ý nghĩa về hình thái so với cây nhị bội (lá dày, thô hơn, khí khổng to hơn)

Tác giả Albert Levan (1939), ñã nghiên cứu ảnh hưởng của colchicine ñến

quá trình phân bào ở tế bào rễ cây hành hoa (Allium fistulosum) và hành tây (Allium cepa) Kết quả thí nghiệm cho thấy khi xử lý chồi hành bằng 2%

colchicine ở các mốc thời gian (7 phút, 15 phút và 30 phút) thì sau 36h trồng trong nước tinh khiết quan sát thấy ở tế bào ñầu rễ thoi vô sắc xuất hiện trở lại; khi xử lý colchicine trong 72h sau 50h nuôi cấy thoi vô sắc xuất hiện Khi tế bào

bị xử lý colchicine sẽ hình thành các tế bào ña bội (3n, 4n) Sau 1 thời gian nuôi cấy số lượng các tế bào ña bội giảm, tế bào nhị bội tăng, ñây chính là cơ chế kháng colchicine của thực vật Colchicine còn có ảnh hưởng ức chế sự phát triển của chồi, chồi xử lý 0,1% colchicine sẽ phát triển chậm hơn chồi xử lý 0,01% colchicine Ở 2 công thức này sau 7 ngày nuôi cấy chiều dài lá trung bình tương ứng là 8 cm và 15 cm, ở chồi không xử lý chiều dài lá trung bình 34cm Ngưỡng

xử lý colchicine có hiệu quả nhất trên cây hành tây là 4h ở nồng ñộ 0,005 – 0,01%

Khi xử lý tế bào ñơn bội (tế bào noãn chưa thụ phấn) của cây hành tây

(A.cepa) bằng colchicine ở các nồng ñộ 10 và 100mg/l trong 24h cho tỷ lệ tế bào

ñầu rễ nhị bội cao nhất nhưng không có hiện tượng nhị bội hóa ở tế bào ñầu lá Sau 3 ngày xử lý bằng colchicine ở nồng ñộ 10mg/l cho kết quả 46% cây nhị bội

Sự hình thành các thể nhị bội này rất có ý nghĩa trong quá trình chọn tạo giống mới (B Campion và cộng sự, 1997)

Khi xử lý colchicine trên cây hành (Allium wakegi Araki), tác giả Shinichi

Adaniya và Satoshi Tamaki (1991) ñã tạo ñược các thể khảm (cytochimeras) Trong 537 mẫu ñỉnh chồi ñược nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,2% colchicine có 85 cây ở dạng khảm khi số lượng NST ở 3 lớp lá mầm (L-I, L-II, LIII) của chúng ñược phân tích ðộ bội của L-I, L-II và L-III ñược ñánh giá bằng cách ño kích thước của khí khổng, ño ñộ bội của tế bào nhu mô và ñếm số lượng NST của tế bào ñầu rễ

Trong các thể khảm, các cây 2-4-4 và 4-2-2 ñược lựa chọn ñể so sánh về các ñặc tính sinh trưởng với các cây nhị bội và tam bội tương tự Thí nghiệm ñược thực hiện trong ñiều kiện ánh sáng ngày ngắn, 13 và 14 ngày dài trong những tháng mùa ñông Kết quả cho thấy, dạng 4-2-2 cho số lượng chồi nhiều hơn, kích thước lá lớn và chồi hình thành sớm hơn so với cây nhị bội Các chỉ số sinh trưởng của cây 2–4–4 cũng tương tự như cây tam bội

Sự bền vững của các thể khảm ở cây hành Allium wakegi Araki trong

nhân giống invitro và invivo cũng ñược tác giả Shinichi Adaniyaa và cộng sự nghiên cứu (2007) Cây tam bội và dạng khảm (4-2-2, 2-4-4, 2-4-2, 4-4-2 và

4-8-4) của A.wakegi ñược tạo thành bằng cách nuôi cấy ñỉnh chồi (3mm)

trong môi trường MS bổ sung 0,2% colchicine Cây xử lý colchicine ở thế hệ ñầu tiên ñược nhân giống invivo và là vật liệu ñể ñánh giá sự bền vững của các thể khảm Không có sự thay ñổi về ñộ bội giữa các chồi mầm sinh ra từ các thể nhị bội và tứ bội Khoảng 30% chồi từ cây 4-2-2 và 90% chồi từ cây 2-4-4 duy trì dạng khảm tự nhiên như cây mẹ Cây con tái sinh từ cây 2-4-2, 4-4-2 và 4-8-4 bị mất hoặc thay ñổi các tính trạng khảm tự nhiên và có xu hướng giống cây nhị bội, tứ bội, 4-2-2 và 2-4-4 ðỉnh chồi phân lập từ các cây nhị bội, tứ bội, 4-2-2 và 2-4-4 3 năm tuổi ñược nuôi cấy trên môi trường MS

bổ sung 0,00; 0,0625; 0,125; 0,25 và 0,5 mg/l BA hoặc bổ sung 0,5 mg/l BA

và NAA với các nồng ñộ 0,1; 0,5 và 1 mg/l Cây 4-2-2 và 2-4-4 phát triển không bền vững từ nồng ñộ 0,25mg/l BA trở lên Các dạng khảm ñều thay ñổi mạnh mẽ trong suốt quá trình nuôi cấy trên môi trường bổ sung các nồng ñộ

BA và NAA khác nhau, tuy nhiên, chúng có xu hướng bền vững ở nồng ñộ 0,125 mg/l BA trở xuống

Như vậy, hành ðẻ (Allium wakegi) là cây rau gia vị có giá trị kinh tế cao,

chúng vừa ñược sử dụng làm thực phẩm vừa là một vị thuốc dân gian rất hiệu quả Trên thế giới, hành tỏi ñược quan tâm nghiên cứu khá nhiều và ñã có những ứng dụng hiệu quả trong thực tế Trong ñó, nghiên cứu về xây dựng quy trình tái sinh cây từ callus và tạo cảm ứng ña bội bằng cách xử lý colchicine nhằm tạo ra giống mới có nhiều ñặc tính tốt như chống chịu bệnh, tăng khả năng chữa bệnh, diệt trùng… ñã ñược thực hiện và ñem lại hiệu quả nhất ñịnh

Tuy nhiên, ở Việt Nam hành tỏi vẫn chưa ñược quan tâm nghiên cứu nhiều, ñặc biệt là những nghiên cứu về xây dựng quy trình tái sinh cây và tạo cảm ứng ña bội bằng cách xử lý colchicine nhằm tạo ra giống mới Chính vì vậy,

chúng tôi tiến hành ñề tài “Xây dựng quy trình tái sinh cây hành ðẻ (Allium

wakegi) từ callus và bước ñầu ñánh giá ảnh hưởng của colchicine ñến sự cảm ứng ña bội”

Qua nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn bước ñầu tạo ra cây giống hành mới có kích thước và năng suất cao nhưng vẫn giữ ñược những giá trị về hương vị cũng như tính thích nghi như giống hành ðẻ ban ñầu

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm

- Trung tâm thực nghiệm Viện Sinh học Nông Nghiệp

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây hành ðẻ từ callus

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh trưởng

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh trưởng

Môi trường cơ bản ñược sử dụng gồm MS + 30g ñường + 5,5g agar (MS) ở

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của picloram ñến sự hình thành callus từ ñỉnh sinh trưởng

Nghiên cứu môi trường nhân nhanh chồi

Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi

Nghiên cứu môi trường ra rễ của cây tái sinh

Thí nghiệm 5 Ảnh hưởng của IAA ñến sự ra rễ

CT1(ñ/c): MS

CT1: MS0 + 0,01% colchicine

CT2: MS0 + 0,02% colchicine

CT3: MS0 + 0,03% colchicine

CT4: MS0 + 0,04% colchicine

Thí nghiêm 9 Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine và thời gian lắc callus trong colchicine ñến sức sống và sự tái sinh chồi từ callus (phương pháp 3)

Nồng ñộ colchicine Thời gian xử lý

0,1 mg/l 0,2 mg/l 0.3 mg/l 0,4 mg/l

3.2.3.Bước ñầu ñánh giá ñộ bội của cây thu ñược sau xử lý colchicine

Cây tái sinh thu ñược sau xử lý colchicine ñược ñánh giá ñộ bội bằng phương pháp quan sát hình thái cây, quan sát hình thái và xác ñịnh kích thước khí khổng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Quy trình kỹ thuật tách ñỉnh chồi

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Cắt các ñoạn thân sát gốc, tách bỏ rễ và các lá bao ở ngoài, kích thước ñoạn cắt 1 – 1,5cm Rửa mẫu nhiều lần dưới vòi nước chảy, không cần rửa bằng

xà phòng

- Bước 2: Khử trùng mẫu

Mẫu trước khi tách ñược khử trùng bằng cồn 70o trong 1 phút, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần sau ñó ñược lắc liên tục trong HgCl2 1% trong 10 phút rồi tiếp tục rửa lại bằng nước cất 3 lần

- Bước 3: Tách ñỉnh chồi

ðặt các ñoạn thân ñã khử trùng vào ñĩa petri vô trùng ñể trong tủ cấy Dùng dao mũi mác ñã khử trùng và panh tách bỏ các lá bao ngoài chỉ ñể lại từ 1 – 3 lá bao nguyên thuỷ trong cùng, sau ñó chuyển mẫu lên kính hiển vi

Dùng dao phẫu thuật ñể cắt ñỉnh chồi hình cầu với kích thước 0,8 – 1,2

mm và ñưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo ñã chuẩn bị sẵn

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sử dụng phương pháp nuôi cấy invitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige&Skoog, 1962 với 6,2 – 7g agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l inositol)

Các thí nghiệm vào mẫu, nhân nhanh, và tạo cây hoàn chỉnh ñược nuôi cấy trong bình trụ miệng hẹp 250 ml hoặc ống nghiệm Tất cả các môi trường nuôi cấy ñược ñiều chỉnh ñộ pH bằng 5,8 – 6 trước khi tiệt trùng và ñược khử trùng ở 1200C, 1.4 atm trong thời gian 20 phút

3.3.3 Phương pháp xử lý bằng colchicine

Colchicine khô ñược cân và pha bằng methanol 100% sau ñó lên thể tích bằng nước cất Dung dịch colchicine ñược khử trùng bằng màng lọc vô trùng (Millipore Sterivex GS: 0,22µm), sau ñó ñược bổ sung trực tiếp vào các bình môi trường (khi môi trường vẫn còn lỏng – khoảng 700C) ñã ñược hấp khử trùng – ñối với thí nghiệm nuôi cấy trực tiếp trên môi trường; và bổ sung vào nước cất ñã hấp khử trùng – ñối với thí nghiệm lắc callus (thể tích bổ sung tùy theo nồng ñộ)

3.3.4 Phương pháp ñánh giá ñộ bội của chồi tái sinh

1 Quan sát hình thái cây tái sinh, ño ñếm kích thước lá, chiều cao, số chồi từ ñó

bước ñầu xác ñịnh cây ña bội

2 Phương pháp quan sát khí khổng

Lấy lá của các cây thu ñược sau xử lý colchicine sau ñó tách lấy một lớp mỏng trên mặt lá ðặt lớp mỏng lên lam kính nhỏ một giọt nước, ñậy lamen, thấm hết phần nước thừa Chú ý ñậy lamen không ñể hình thành các bóng khí

ðặt lam kính lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 20 ñể tìm vị trí ñánh giá tốt nhất sau ñó chuyển sang vật kính 40 ñể ñếm số lượng khí khổng trong một

hiển vi trường và ño kích thước của khí khổng (mỗi mẫu ño, ñếm 3 lần ở các hiển

vi trường khác nhau và lấy giá trị trung bình)

Kích thước tế bào khí khổng ñược ño theo phương pháp của John William Henry Eyre (2009) như sau:

Bước 1 Xác ñịnh giá trị mỗi khoảng của

thước ño thị kính: Tháo thấu kính trên của thị kính

ra, lắp thước ño thị kính vào màn chắn của thị kính

sao cho vạch chia nằm ở phía dưới; dùng vật kính có

bội giác nhỏ lấy tiêu cự và dịch thước ño vào giữa thị

trường, thay vật kính có bội giác lớn mà ta ñịnh dùng

ñể ño kích thước tế bào; ñiều chỉnh bản kính sao cho

một vạch của 2 thước này trùng khít lên nhau và tìm chỗ trùng khít của vạch thứ

2, rồi xác ñịnh khoảng cách giữa 2 vạch của thước ño thị kính bằng µm Qua quan sát ở ñộ phóng ñại 40x cho thấy khoảng cách giữa 2 vạch của thước ño thị kính là 2,5µm

Bước 2 ðo kích thước: ðặt tiêu bản có tế bào cần ño lên bàn kính, ñiều

chỉnh bàn kính sao cho thấy rõ tế bào và thước ño thị kính; ñiều chỉnh bàn kính sao cho tế bào nằm gọn và dọc theo thước ño thị kính; ñếm số khoảng mà tế bào choán chỗ; tính kết quả

3.3.5 ðiều kiện thí nghiệm

+ Ánh sáng: các mẫu ñều ñược nuôi cấy dưới ánh ñèn neon cường ñộ chiếu sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 16h sáng/ 8h tối

+ Nhiệt ñộ: Duy trì ở nhiệt ñộ 20 – 22oC (ñêm) và 25 – 27oC (ngày) + ðộ ẩm phòng: Luôn ñược duy trì ở 70% ñộ ẩm tối ña

3.3.6 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm ñược bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn CRD, mỗi công thức lặp lại 3 lần mỗi lần 10 mẫu

3.3.7 Phương pháp theo dõi

Theo dõi thí nghiệm ñịnh kỳ 7 – 15 ngày/lần (tùy theo yêu cầu của thí nghiệm)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Quan sát sự biến ñổi hình thái màu sắc của mô nuôi cấy

- Hình thái callus (nhỏ, to, xốp, mọng nước, vàng, nâu….)

- Tỷ lệ mẫu sống (%)

- Tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi (%)

- Tỷ lệ mẫu tái sinh tạo rễ (%)

- Tỷ lệ tạo callus (%)

- Chiều cao chồi tái sinh (cm/chồi)

- Số lá trên cây (lá/cây)

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ðẺ (Allium wakegi)

tế bào soma hoặc từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987) Khi nồng ñộ auxin thấp thì sự tạo rễ bất ñịnh chiếm ưu thế, khi nồng ñộ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo (callus) (Torres, 1989)

Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989) Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác ñộng của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985) Do vậy, việc chọn lựa cơ quan ñể tiến hành xử lý tạo callus là rất quan trọng, ở thí nghiệm này mẫu cấy là những ñỉnh sinh trưởng có kích thước 0,8 – 1,2 mm ðây là phần mô non nhất của cây, có khả năng cảm ứng và phản phân hóa mạnh ñồng thời trong mô nuôi cấy cũng có thể tồn tại một lượng auxin nội sinh khá cao nên mẫu cấy có khả năng tạo mô sẹo và lên chồi Trên ñối tượng hành tỏi, 2,4D và picloram ñã ñược sử dụng ñể cảm ứng tạo callus trên rất nhiều nguồn mẫu (ñỉnh chồi, mô lá ) cũng như trên rất nhiều

cây thuộc họ hành tỏi như A sativum L, A fistulosum, A altaicum, A galanthum,

A roylei (Phillips G C., Luteyn K J (1983); Phillip G C., Hubstenberger J

F (1987); Havranek P., Novak F J (1993))

4.1.1.1 Ảnh hưởng của 2,4 D ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh trưởng

ðỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ ñược tách ở kích thước 0,8 – 1,2 mm và cấy chuyển vào môi trường MS có bổ sung 2,4 D ở các nồng ñộ 0,5 mg/l; 0,75 mg/l; 1 mg/l và 1,5 mg/l công thức ñối chứng là môi trường MS Kết quả thí nghiệm ñược thể hiện ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh trưởng

sau 6 tuần nuôi cấy

Kích thước callus (%) Công

Tỷ lệ chồi (%)

Tỷ lệ callus (%)

To

(≥ 1

cm)

Trung bình

mẫu cấy, khi tăng nồng ñộ 2,4D tỷ lệ

sống của mẫu giảm dần ðặc biệt 2,4D

ức chế hoàn toàn quá trình bật chồi của

mẫu, 100% mẫu cấy trên môi trường có

4.1.1.2 Ảnh hưởng của picloram ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh trưởng

ðỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ ñược tách ở kích thước 0,8 – 1,2 mm và cấy chuyển vào môi trường MS có bổ sung picloram ở các nồng ñộ 0,5 mg/l; 0,75 mg/l; 1 mg/l và 1,5 mg/l công thức ñối chứng là môi trường MS Kết quả thí nghiệm ñược thể hiện ở bảng 4.2

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của picloram ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh chồi

sau 6 tuần nuôi cấy

Kích thước callus (%) Công

Tỷ lệ chồi (%)

Tỷ lệ callus (%)

To

(≥ 1

cm)

Trung bình

Khác với 2,4D - ức chế hoàn toàn

quá trình hình thành chồi của mẫu cấy, trên

môi trường bổ sung picloram ở nồng ñộ

thấp 0,5 – 0,75 mg/l có một tỷ lệ nhỏ mẫu

cấy hình thành chồi

Callus hình thành trên môi trường

bổ sung picloram rắn chắc, có màu vàng sáng có khả năng phát sinh chồi cao khi

Hình 4.2 Callus hình thành trên môi trường bổ sung picloram