Chiết tách, tinh chế concanavalin a từ hạt đậu rựa ( canavalia ensiformis l fabaceae ) ở việt nam và nghiên cứu ứng dụng

PHẦN I . ĐẶT VẤN ĐỂ Những chất có hoạt tính sinh học như enzym, hormone, vitamine, kháng sinh ... có vai trò quan trọng đối với đời sống con người trong nhiều thập kỷ qua. Lectin cũng là những chất có hoạt tính sinh học đặc biệt. Goldstein và cộng sự đã định nghĩa: “Lectin là những protein hoặc glycoprotein không có nguồn gốc miễn dịch nhưng có khả năng liên kết với đường hoặc nhiều loại hợp chất chứa đường, có khả năng ngưng kết nhiều loại tế bào”28,31. Mức độ phân bố rộng rãi trong sinh giới và khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (nông nghiệp, sinh hoá, huyết học, tế bào học, miễn dịch học, ydược học ...) là lý do để thuật ngữ lectin, sau hơn 100 năm kể từ khi ricin (lectin đầu tiên) được tìm ra( 1888)31 , trở nên quen thuộc và thu hút sự quan tâm, chú ý của các nhà khoa học trên thế giới. Trong sô các leclin thì Concanavalin A (CotiA), lectin của cày đậu rựa (Cơnavaỉia ensiformis),là lectin Ihực vật được biết đến rộng rãi nhất. Các lính chất sinh học điển hình của Con A khiến nó trở thành loại lectin thực vật được nghiên cứu nhiều và kỹ lưỡng nhất. Một khối lượng đồ sộ các công trình, các báo cáo khoa học về Con A đã ra đời cung cấp cho chúng ta những hiểu biết khá đầy đủ về cấu trúc cũng như các đặc tính lý hoá của nó . Đặc biệt, tiềm năng ứng dụng của ConA là vô cùng to lớn. Ngay lừ đẩu thế kỷ 19 ConA đã được biết đến như một công cụ hữu hiệu dùng trong nghiên cứu sinh dược học đo khả năng tương tác đặc hiệu với nhiều hợp chất sinh học chứa đường quan trọng như các ĩg, tRNAAsp, AFP ....Cấu trúc, vai trò của những hợp chất này đối với cơ thể đến ngày nay vẫn còn là một đề tài hãp dẫn và những thông tin về chúng đã giúp các nhà khoa học rất nhiều Irong chẩn đoán, theo dõi các bệnh lý liên quan . Ở nồng độ thấp Con A có khả năng gây ngưng kết tế bào ung thư do đổ kìm hãm sự phát triển của lế bào ung Ihư. ConA kích thích sự phân bào của các tế bào lympho (tế bào T), tăng cường khá năng miễn dịch 27.

BỘ Y T Ế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

BÀO THỊ MAI ANH

CHIẾT TÁCH, TINH CHÊ CON CANAVALIN A

Từ HẠT ĐẬU RỰA

VÀ NGHIÊN CỨU ÚNG DỤNGKHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1996-2001

- Người hướng dẫn: TS Đào Kim Chỉ

ThS Nguyễn Văn Lợi

- Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá sinh

LỜI CẢM ƠN

(?H/ rieìti tớ íòttự h iĩt on í ít lí iắíi tó i QỉtS JC i,n @ít i oà

£7//cV Q íạ itự ễn (Z)ản M úi, n ỉtử m / n ạ u ổ i đ ã tậ n tìn h ỉm ó tiụ đ ẫ n , L h u ụ ê ti

k h íc h ĩtẻ ịtụ aìètt etn tttìtiụ iu â t ụ itá tr ìn h etti llitic ítièit ếtề t à i này,.

S tn /tin eỉtâ n th à n h tuítn ổti f p ( ịé ỉ.íxJ& ^i)ẫ Q lạoe M iên t m ổ n ụ fí)ụ ì Tĩùtìíi X ít o a IttUi t ư a h ỉê tt thuồtt htítìti(J fi)ạ ì Tỉùtìe ÍÌỊiiếe ụ ia lỉù à QLôỉ, ttg n ò t i f ã ỉiiâii (Ịiiait tà m eíií háo oà eíitì em n h iề n lị Ui (ill quý (ĩúu.

ố m íiũnụ vin eft à ti th à n h (Ítítn đti (Ị)(Ậ<S ỶĨiS íilạ u ụ ễ tt Oốuàtt Ư h ắ ttụ

Uĩj ỉlm ã t viê n h o ta j ^iiỗ m ồ n Jôe)á sìn h ^ y ù ò iiụ ifJili h o e ^Dưđe J ô à ( íítìi (tã n ítiê t tìn h ụỉÚỊt đ ỏ oà tạ o íTiềít Uiêti th u íịn tờ i eíitì em trũ ttự iu ồ t lliằ ì t/ỉíin hoe itỉ/i i)ù h tìà n th à n h Uítoá iítíĩti tế t m jỉtìê ịi.

Tỉôà n ỗ i, ttninij 5 tiù n i 2 0 0 í

S in h oỉêtt fjẾ)àờ 07* /.///«/ c/ỉnh

MỤC LỤC

Phần I Đặt vấn đ ề 1

Phần II Tổng q u an 3

2.1 Sơ lược về lectin 3

2.1.1 Tình hình nghiên cứu leclin trên thế giới và ở Việt N am 3

2.] 2 Các tính chất của lectin 5

2.1.3 Các phương pháp tinh chế lectin 10

2.1.4 ứng dụng của lectin 12

2.2 Vài nét về Con canavalin A và cíiy đậu rựa (Canavalia ensifonnis Fabaceae) 14

2.2.1 Con canavalin A 14

2.2.2 Cây đậu rựa (Canavalia ensiformis L Fabaceae) 17

2.3 AFP 17

Phần III Thực nghiệm và kết q u ả 22

3.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiêm 22

3.1.1 Nguyên liệu 22

3.1.2 Hóa chất và thuốc thử 22

3.1.3 Thiết bị và máy móc 23

3.1.4 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xél 29

3.2.1 Nghiên cứu khả năng gây ngưng kếl hồng cầu của lectin trong dịch chiết thô 29

3.2.2 Khảo sát sự phân bô của lectin trong hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis) 30

3.2.3 Giai đoạn tách chiết C onA 31

3.2.4 Giai đoạn kết tủa protein - lectin 33

3.2.5 Giai đoạn tinh chế lectin đậu rựa bằng phương pháp sắc ký ái lực trên cột Sephađex G 7 5 37

3.2.6.Tóm tắt quá trình tách chiết và tinh chế C onA 40

3.2.7 Kết quả điện di trên gel polyacrylamid 40

3.2.8 Sử dụng lectin đã tinh sạch để tinh chê AFP huyếl thanh bệnh nhân UTBMTBG 41

3.3 Bàn luận 44

Phần IV Kết luận và đề x u ấ t 46

Tài liệu tham khảo 47

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired Immuno deficiency Syndrome

HAA Haemato agglutinating activity

TBS Tris buffered saline

ưng thư biểu mô tế bào ganUTBMTBG

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỂ

Những chất có hoạt tính sinh học như enzym, hormone, vitamine, kháng sinh có vai trò quan trọng đối với đời sống con người trong nhiều thập kỷ qua Lectin cũng là những chất có hoạt tính sinh học đặc biệt Goldstein và cộng sự đã định nghĩa: “Lectin là những protein hoặc glycoprotein không có nguồn gốc miễn dịch nhưng có khả năng liên kết với đường hoặc nhiều loại hợp chất chứa đường, có khả năng ngưng kết nhiều loại tế bào”[28,31] Mức

độ phân bố rộng rãi trong sinh giới và khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (nông nghiệp, sinh hoá, huyết học, tế bào học, miễn dịch học, y-dược học .)

là lý do để thuật ngữ lectin, sau hơn 100 năm kể từ khi ricin (lectin đầu tiên) được tìm ra( 1888)[31 ], trở nên quen thuộc và thu hút sự quan tâm, chú ý của các nhà khoa học trên thế giới

Trong sô các leclin thì Concanavalin A (CotiA), lectin của cày đậu rựa

(Cơnavaỉia ensiformis), là lectin Ihực vật được biết đến rộng rãi nhất Các lính

chất sinh học điển hình của Con A khiến nó trở thành loại lectin thực vật được nghiên cứu nhiều và kỹ lưỡng nhất Một khối lượng đồ sộ các công trình, các báo cáo khoa học về Con A đã ra đời cung cấp cho chúng ta những hiểu biết khá đầy đủ về cấu trúc cũng như các đặc tính lý hoá của nó Đặc biệt, tiềm năng ứng dụng của ConA là vô cùng to lớn Ngay lừ đẩu thế kỷ 19 ConA đã được biết đến như một công cụ hữu hiệu dùng trong nghiên cứu sinh dược học

đo khả năng tương tác đặc hiệu với nhiều hợp chất sinh học chứa đường quan trọng như các ĩg, tRNAAsp, AFP Cấu trúc, vai trò của những hợp chất này đối với cơ thể đến ngày nay vẫn còn là một đề tài hãp dẫn và những thông tin

về chúng đã giúp các nhà khoa học rất nhiều Irong chẩn đoán, theo dõi các bệnh lý liên quan Ở nồng độ thấp Con A có khả năng gây ngưng kết tế bào ung thư do đổ kìm hãm sự phát triển của lế bào ung Ihư ConA kích thích sự phân bào của các tế bào lympho (tế bào T), tăng cường khá năng miễn dịch [27]

Con A cũng được sử dụng như một chất mang, dãn thuốc tới các tế bào đích Gần đây, Con A còn dược sử dụng dể phát hiện sớm, chính xác HIV, virus gây đại dịch AIDS [30] Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tiềm năng ứng dụng của Con A vẫn đang được tiếp tục khai thác để phục vụ tốt hơn cho đời sống con người.

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu lectin vãn đang còn ở nlũrng chặng đường ban đầu, tuy nhiên những kết quả thu được là rất khả quan : lectin có rất phổ biến trong các cơ thể động, thực vật Việt Nam, đặc biệt lectin thuộc họ đậu (Fabaceae) và họ đâu tằm (Moraceae) là đáng chú ý hơn cả

Để có thể cung cấp mộl lượng chế phẩm lectin có độ linh sạch cao dùng cho việc nghiên cứu ứng dụng trong y-dược, góp thêm dần liệu khoa học về tiềm năng to lớn của các lectin có nguồn gốc nội địa, chúng tôi tiến hành dề tài “ Chiết lách và tinh chế Con A từ hạt đậu rựa Canavalia ensiformis ở Việt Nam và nghiên cứu khả năng ứng đụng ” với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu áp dụng phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế Con A chiết

tách từ cây đậu rựa (Cơnavalia ensiformis ) Việt Nam.

2 Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm lectin thu được bằng phương pháp điện

di trên gel polyacrylamid (PAGE) có SDS và 2- Mercaptoethanol

3 Sử đụng chế phẩm lectin tinh sạch thu được để thử tinh chế AFP từ huyếtthanh của bệnh nhân ung Ihư biểu mô tế bào gan

có thể coi là định nghĩa đầu tiên về lectin.

Do việc lìm ra nhiều prolein có khả năng liên kết đường ở nhiều loài khác trong sinh giới (vi khuẩn, cá, ốc sên ), năm 1977, Ashwell đã mở rộng thuật ngữ lectin chỉ cả những protein liên kết đường từ các nguồn khác nhau chứ không phải chỉ từ thực vật, chúng có thể ở dạng hoà tan hoặc liên kết trên màng [28]

Năm 1980, Goldstein và cộng sự đưa ra định nghĩa:’’Lectin là những protein hoặc glycoprotein không có nguồn gốc miễn địch nhưng có khả năng liên kết với đường hoặc nhiều loại hợp chất chứa đường, có khả năng ngưng kết nhiều loại tế bào” Định nghĩa này đã được Ủy ban về danh pháp quốc tế công nhận, và có hàm ý lectin là đa hoá trị vì chúng phải có ít nhất hai vị trí liên kết đường để có thể gây ngưng kết tế bào động vật và thực vật, hoặc làm kết tủa các polysaccarid, glycoprotein, peptidoglycan, và glycolipid [28,31]

• Nghiên cứu Iectin trên thế giới

Kể tờ khi Stillmark phát hiện ra khả năng gây ngưng kết tế bào hồng c;ìu người và một số động vật của dịch chiết hạt thầu dầu (Ricinus communis) (1888) đến nay đã hơn 100 năm Lịch sử nghiên cứu lectin có thể chia làm 3 thời kỳ chính:

T ừ cuối th ế kỷ X ỈX đến đầu th ế kỷ XX: Đây là giai đoạn mang tính

điều tra cơ bản về lectin trong giới sinh vật Ngoài các công trình nghiên cứu

3

lectin có nguồn gốc thực vật cíia Slillmark (1888), Heỉlin (1891), Lansteinner (1902), Lansteinner và Raubischeck (1903), còn có các công trình của Mendel (1909), Kobert (1913) trên đối tượng là độngvật, Ludiwing và Kraus (1902), Kayser (1903), Guyot (1908) trên đối tượng là các loài vi khuẩn Điều

đổ chứng tỏ sự phân bố rất rộng rãi của lectin trong sinh giới

Từ 1950 đến 1970: Trong hai thập kỷ này bên cạnh các công trình mang

tính điều tra về sự phân bố của lectin, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung tinh chế lectin để nghiên cứu về cấu trúc, ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính của leclin, trên cơ sở đó tìm cách sử dụng lectin để phục vụ đời sống con người Có nhiều phương pháp đã được sử dụng nhưng phương pháp chủ yếu là phương pháp sắc ký như sắc ký Irao dổi ion, sắc ký lọc gel Đặc biệt, sắc ký

ái lực lần đầu tiên dược sử dụng vào năm 1965 đã lập tức chứng tỏ rằng đó là một công cụ tinh chế lectin có hiệu quả, cho chế phẩm có độ tinh sạch cao Đến nay kỹ thuật này vãn được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới

T ừ 1970 đến nay: Trong giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩy nhanh Nhiều kết quả thú vị đã được công bố: tìm thấy lectin ở nấm nhầy

(Rosie-1974, Baronđes và Haynoođ-1979), ở trong cơ thể người (Chilads Feizy-1979, Franklin-1980, Powell-1980) [31] Lectin từ các cá Ihể có quan

hệ gần gũi có cấu tạo phân tử và đặc tính sinh học khá giống nhau (Soni-1982, Willy-1984) [2] Đặc biệt ứng dụng của lectin là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Nổi bật trong số dó là: lợi dụng khả năng kích thích sự phân chia của các tế bào bạch cẩu người của led in lừ đậu thận đỏ (Phaseolus vulgaris) hay khả năng phân tách bạch cầu và tế bào ung thư máu của lectin từ huyết thanh của loài sam biển châu Mỹ (Limulus polyphemus) để phục vụ cho những nghiên cứu y học và miễn dịch học [2,27]; sử dụng kha năng tương lác đặc hiệu của lectin Con A với AFP, một dấu ấn ung thư của một sô bệnh ung thư, làm phương liộn chẩn đoán ung lliư [27]; nghiên cứu hiến các cỉạng lectin của một số loài mít có khả năng kích thích phân chia tế

bào lympho T -C D / ở người và lectin từ hạt mít mật (Arlocơvpus heterophyìỊus) có khả năng tương tác với glycoprotein CD4 ở bề mặt tế bào lympho T ở người là phân tử kết hợp đặc hiệu với virus HIV trong pha nhiễm

bệnh đầu tiên của sự suy giảm miễn địch (AIDS), thành những loại thuốc hĩru hiệu trong điều trị và chẩn đoán căn bệnh thế kỷ này [39] Chúng ta tin tưởng rằng, với sự nỗ lực của các nhà khoa học trên thế giới, trong mội tương lai khổng xa chắc chắn nhiều giá trị thực tiễn đích thực của lectin sẽ được khẳng định.

• Nghiên cứu lectỉn ở Việt Nain

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu lectin đã được triển khai và mở rộng gần 20 năm nay (từ năm 1983) và dược tiến hành theo 3 hướng cơ bản: điều tra sự phân bố của ỉectin; chiết tách, tinh chế và nghiên cứu tính chất, cấu trúc lectin; nghiên cứu ứng dụng

Tuy Ihời gian chưa dài, nhưng những công trình nghiên cứu này cũng đạt được một số kết quả nhất định:

- Điều tra và khẳng định sự có mặt khá phổ biến của lectin trong các

loài động thực vật à nước ta [2,6,15].

- Nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp chiết tách, tinh chế và nghiên cứu lính chất, cấu trúc phân tử của nhiều loại lectin có nguồn gốc nội địa [2,5,11,12],

- Bước đầu đưa một số lectin vào sử dụng trong thực tế: chẩn đoán thai sớm [2], tinh chế IgA, và nghiên cứu sự biểu hiện bệnh lý của chúng ở người [9], chẩn đoán bệnh nhiễm sán máng [10]

Triển vọng trong tương lai số lượng lectin tinh chế ở Việt Nam sẽ nhiều hơn và được sử dụng rộng rãi hơn trong các lĩnh vực khác nhau của y, sinh dược học

2.1.2 Cấc tính chất của lectin

• Tính chất hoá lý

- Khối lương phân tử

Các phương pháp sàng lọc phân tử, điện di trên gel polyacrylamicl, siêu ly tam cho thấy khối lượng phân tử của leclin rất khác nhau, dao động

từ vài nghìn Da (leclin của rễ cây gai (Urticaceơe)- 8.500 Da) đến vài trăm nghìn Da (lectin của sam biển ch Au á (Tachypleus triđentatus 700.000 Da).

5

Người ta không tìm thấy mối liên hệ nào giữa khối lượng phân tử và hoạt tính của lectin Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng cũng như không phụ Ihuộc vào mức độ tiến hoá của loài hay cá thể.

Do phân tử lectin có thể cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị nên khối lượng phân

tử của chúng phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc không gian Các yếu tố làm thay đổi cấu trúc không gian của lectin như pH, dung địch urê nồng độ cao, clorua guaniđin đều có thể ảnh hưởng đến khối krợng phân tử lcclin Con A ở pH

trung tính có cấu trúc tetramer với phân tử krợng bằng 102.000 Da, nhưng ở

pH < 6 cấu trúc tetramer bị phân ly thành các đimer có phân tử lượng bằng51.000 Da [28],

- Tính tan

Lectin có khả năng hoà tan trong nước Đặc biệt, lectin dễ tan trong môi trường muối loãng, vì vậy trong các qui trình tinh chế người ta thường sử dụng các dung dịch đệm chứa muối ở nồng độ sinh lý làm dung môi chiết rứt Do bản chất protein nên lectin dễ bị kết tủa dưới tác dụng của: aceton, alcol ở nhiệt độ thấp; một số muối trung tính nồng độ cao và muối kim loại nặng.Muốn kết tủa thuận nghịch lectin, cách tốt nhất là dùng muối amonisulfat

VI đây là muối dễ tan, không ảnh hưởng đến hoạt tính lectin và dễ loại bỏ trong quá trình tinh chế Aceton cũng được sử dụng để kết tủa lectin nhưng phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp vì dễ làm biến lính leclin

- Khả năng tươm tác với đường

Khả năng tương tác với dường là một trong những tính chất điển hình của lectin Lectin liên kết với cả phân tử đường đơn lẫn các gốc đường nằm trên bề mặt tế bào Các loại đường nliư glucose và glucosatnin, ealactose

và galactosamin, fucose, manose cổ khả năng lương lác với nhiều loại lcclin

Về bán chất của (ương tác giữa lectin với đường có lất nhiều giá thuyết, tuy nhiên các nhà khoa học đều Ihống nhất rằng: sự bền vững của phức hợp lectin-đường dược duy trì bởi cả liên kết phân cực (liên kết hydro giữa các nhóm OH của đường với các đầu phân cực của các gốc aminoacid trên phan tử lectin) lẫn liên kết không phân cực hay liên kết không gian (liên kết bằng lực Vander-Walls) [28] Liên kết không gian có thể có liên quan đến tính đặc

hiệu với đường của chúng Điều này phù hợp với phát hiện của Mankela: sự

khác biệt trong cấu trúc không gian ở vị trí C3, C4 của các loại đường trong

thành phần các loại ỉectin là nguyên nhân dẫn tới aí lực hoá học khác nhau của chúng với các loại đường [28]

Khả năng tương tác đặc hiệu của iectin với đường đã được ứng dụng nhiều trong các nghiên cưú (ế bào học, huyết học và miễn dịch học Đặc biệt gđn đây khả năng này được ứng dụng để tinh chế nhiều dạng lectin Cũng từ đó sắc ký ái lực lectin được sử dụng để tinh chế nhiều glycoprotein có chức năng sinh học

• Đặc tính sinh học của lectin

- Khả n ă m m v m ưng kết t ế bào

Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của lectin Dựa vào

đó người ta phát hiện sự có mặt của lectin ở đối tượng nghiên cứu Đặc tính

này còn giúp phân biệt lectin với những hợp chất sinh học cũng có khả năng tương tác với đường như glycosiđase và glycotransfera.se

Để có thể gây ngưng kết tế bào, lectin phải tạo ra được rất nhiều cầu nối giữa các tế bào bị gắn kết Tuy nhiên khả năng ngưng kết không chỉ phụ thuộc đơn thuần vào lượng lectin mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính phân

tử của leclin (số trung tâm liên kết đường, kích Ihước phân lử ), (lặc tính màng (số lượng receptor, thể chất màng, tình trạng trao đổi chất của màng )

Bên cạnh đó các yếu tố bên ngoài như: nhiệt độ, nồng độ tê bào, mức

độ trộn lằn cũng ảnh hưởng đến khả năng ngưng kết [26]

Hồng cầu là loại tế bào đầu tiên được phát hiện có khả năng ngưng kếl với lectin (Stillmark-1888) Hầu hết lectin đều có khả năng ngưng kết hồng cẩu người, trong đó số lectin đặc hiệu nhóm máu rất ít Một số lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu của các động vật khác như: thỏ, cừu [31]

Sự khác biệt giữa khả năng liên kết của lectin với tế bào bình thường và tế bào ung thư, với tế bào non và tế bào trưởng thành, với tế bào đang phân bào

và tế bào ở giai đoạn nghỉ (Burger-1973, Nicolson-1967) đã thu hút sự đặc

biệt quan tâm của các nhà khoa học

7

Không chỉ gãy ngưng kết tế bào động vật, lectin còn gây ngưng kết tê bào

vi khuẩn, nấtn, sinh vật đơn bào và các bào quan (ty thể)

Khả năng ngưng kết tế bào của lectin có ý nghĩa lớn trong y học và miễn địch học

- Khả nâng kích thích và kìm hãm phân bào

Kích thích phân bào cũng là một clặc tính quan trọng của leclin mang lại nhiều ứng dụng thực tiên Loại tế bào mà lectin kích thích piiíìn bno mạnh nhất là tế bào lympho Leclin xâm nhập vào cơ thể có tác dụng như những kháng nguyên kích thích sự phãn chia các tế bào lympho, do vậy chúng

có ý nghĩa trong tăng cường đáp ứng miễn dịch

Ngoài tế bào lympho người, lectin còn có khả năng kích thích sự phân chia của nhiều loại tế bào khác như lế hào bình thường và tế hào phôi già

Cơ chế của sự kích thích phân bào vản chưa được làm sáng tỏ Có ý kiến cho rằng saccarid trên màng tế bào là yếu tố kìm hãm sự phân chia tế bào Khi lectin gắn vào các saccariđ này, sự kìm hãm bị phá vỡ nên khả năng phân chia

tế bào dược tăng lên Tuy nhiên luận điểm nay chưa đủ sức thuyết phục vì nhiều lectin cổ khả năng liên kết với các phân tử saccarid trên bề mặt màng

mà vẫn khổng có khả năng kích thích phân bào Những phát hiện gần đây về những glycoprotein màng tế hào chỉ liên kết chọn lọc với những lectin cổ khíĩ năng phân bào (Dillner-Centerlind và cộng sự -1980) dã gợi ý cho các nhà khoa học về khả năng tồn tại của những receptor màng dặc hiệu với led in phân bào [26]

Những phát hiện về khả năng kích thích phân bào của lectin được sử dụng

có hiệu quả trong y học và miễn dịch học để nghiên cứu: các biến đổi sinh hoá trong quá trình thúc đẩy tế bào từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động (phân chia tế bào tích cực và đáp ứng miễn dịch), sự bất thường của các nhiễm

sắc thể và các bệnh lý khác ở người [15].

Bên cạnh đặc tính trên, một số lectin lại có khả năng ức chế, kìm hãm sự phân chia tế bào Với tế bào ung thư lectin có khả năng kìm hãm sự phát triển và lây lan của chúng Brucke đã giải thích cơ chế đó như sau: các phân lử lectin xâm nhập vào tế bào chủ, tác động đến phân tử ADN, khởi động cho sự

tổng hợp Interferon Interferon từ lế bào chủ được tiết ra xâm nhập vào tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của khối u[2,l 1].

- Môt sô đăc tính sinh hoe khác

Ngoài nhũng đặc tính sinh học nêu trên, lecũn còn có một số tính chất sau [26] :

+ Sản sinh những tế bào ức chế

+ Làm trung gian trong quá trình tiêu diệt tế bào đích của lympho bào và đại thực bào

+ Thúc đẩy quá trinh thực bào nấm và vi khuẩn của đại thực bào

+ Có tác dụng tương tự insulin trên các tế bào mỡ

+ Độc đối với tế bào và động vật

+ Tham gia phản ứng giải phóng tiểu cáu

+ ức chế sự thụ tinh của trứng

+ Tương tác với hormone rau Ihai

+ ức chế giải phóng Histamin từ các tế bào Mast và tế bào ưa kiềm

PH tối thích là vùng pH mà trong đó hoạt tính lectin được thể hiện tối đa

ở môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh hoạt độ lectin giảm rõ rệt hoặc mất hoàn toàn

- Ảnh hưởng của nlĩiêt đô

Do bản chất là protein, lectin chịu ảnh hưởng của nhiệt độ Đa sô lectin bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao do bị biến tính không thuận nghịch Vì vậy nhiệt độ được coi là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu lectin, ở

9

nhiệt độ thấp hoạt tính của lectin giảm Nếu nhiệt độ lăng dẩn lên thì hoạt độ lectin cũng tăng dần và đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp.

- Ảnh hưởng của đường đơn

Các loại đường đơn có ảnh hưởng tới hoạt tính ngưng kết tế bào của lectin, đó là vì khi có mặt phân tử đường, trung tâm liên kết hydratcarbon của lectin bị phong toả làm cho nó không thực hiện được liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào đo đó tế bào không bị ngưng kết [2]

- Ảnh hưởng của enzvm

Các enzym có khả năng biến đổi tính chất của màng tế bào có thể gây ra nhũng tác động đến khả năng ngưng kết tế bào của leclin

Một số enzym có khả năng làm tăng hoạt tính lectin như Trypsin, papain Khi xử lý hồng Cíìu hằng các enzym này, một số protein trcn màng hồng cầu sẽ bị Ihuỷ phân làm bộc lộ rõ các receptor có bản chất là glycoprotein, giúp lectin gắn vào màng tế bào hồng cầu dễ dàng hơn

Trái lại, một số enzym lại làm giảm hoặc mất hoạt lính của lectin Xử lý hồng cầu người bằng galactose oxidase làm khả năng gây ngưng kêì của lectin đậu tương giảm xuống rõ rệt [26]

- Ảnh hưởns của ion kim loai

Một số ion kim loại cũng ảnh hưởng đến hoạt độ lectin Trong nhiều thí nghiệm, khi có mặt một loại ion kim loại nào đó, hoạt độ leclin sẽ giảm xuống hoặc tăng lên Ảnh liưởng của chúng khá phức tạp và hầu như không theo quy luật Có những ion kim loại ở nồng độ cao thì kìm hãm hoạt độ

lectin, nhưng ở nồng độ thấp lại tăng hoạt tính của chính lectin đó- Trong một

số trường hợp khác đối với cùng một loại ion kim loại và ở cùng mội nồng độ, với đạng lectin này thì kìm hãtn hoạt độ nhưng với dạng lectin khác lại làm tăng hoạt độ lên nhiều lẩn

2.1.3 Cắc phương pháp tinh ch ế lectin

• Sắc ký ỉọc gel

Đây là phương pháp lách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa trên kích thước phân tử Chất giá thường được sử dụng là Sephađex Mỗi hạt vSephadex

có bản chất là polysaccarid liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp Có nhiều loại Sephadex, trong đó inỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau Mức độ liên kết quyết định khả năng tách các chất Để tinh chế lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G75 và Sephadex G I 00 [17,37]

Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân

tử của chất cần tách

• Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tuỳ thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất này người ta sử dụng CỘI sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn các ion như DEAE-Sephađex, DEAE-Cellulo.se dược sử dụng làm chất trao đổi lectin-anỉon Các chất nhựa gắn các ion như CM- Sephađex, CM- Cellulose được sử dụng làm chất trao đổi lectin-cation Mỗi chất, trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi [17,24],

• Sắc ký ái lực [17; 23; 35]

Nguyên tắc của phương pháp nầy dựa trên khả năng kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand) Chất kết hợp được gắn trên một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký Chất giá hay được sử dụng là một số loại gel như Sepliadex, Sepharose, Sephacryl Quá trình sắc ký đirợc tiến hành qua ba giai đoạn:

- Gắn ỉectin lên cột: Ở giai đoạn này lectin kết hợp đặc hiệu với chất kết hợp và được giữ lại trên cột

- Rửa cột: Ở giai đoạn này các protein không có ái lực với cột và các protein thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột

- Giải hấp phụ lectin ra khỏi cột: Dùng một dung dịch đẩy có ái lực hoá học phò hợp để đẩy lectin ra khỏi cột

Sắc ký ái lực được sử dụng dể tinh chế lectin lần đầu tiên vào năm 1965[28] Cho đến nay kỹ thuật này vẫn được sử dụng có hiệu quả để tinh chê

nhiều loại lectin vì kỹ thuật tinh chế đơn gián mà lại cho chê phẩm lectin có

• Trong lố bào học: Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và màng các bào quan, sắc ký lectin (Lectin chromatography) giúp khẳng định bản chất glycoprotein của các receptor màng tế bào

• Trong lĩnh vực kế hoạch hoá gia đình: Lectin có thể dược sử dụng để ngăn chặn sự thụ thai và chẩn đoán thai sớm do khả năng ngưng kết tinh trùng

và tương tác với hormone rail thai [2],

• Trong tniễn dịch học: Do lectin lương tác với đường hoặc các chất liên kết đường tương tự như tương tác giữa kháng nguyên và kháng (hể nên dược đùng để phát hiện và tinh chế nhiều hợp chất sinh học chứa đường trong đó

có các globulin miễn dịch (Ig) Từ các chế phẩm tinh sạch thu dược, các nhà khoa học tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc, bản chất, vai trò của chúng đối với cơ thể

Lectin còn có khả năng kích thích phân chia tế bào lympho, kích thích tế bào B sản xuấl kháng thể nên cỉiúng dược sử dụng để nghicn cứu quá Irình

và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể

• Trong y học: Lectin được sử dụng như một công cụ chẩn đoán có hiệu quả Dựa vào khả năng phân biệt một số vi sinh vật, lectin được sử đụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán bệnh[28] Kỹ thuật ELLA (Enzyme - Linked - Lectino,sorbent - Assay ), được cải tiến từ kỹ thuật ELTSA, trong đó lectin được gắn với một cn/ym

khi một chất nghiên cứu nào dó, có thể là một kháng nguyên bệnh của vi khuẩn bị ngưng kết bởi lectin, enzym sẽ hoạt động biến đổi phức hợp này thành hợp chất có màu, cho phép xác định vi khuẩn một cách nhanh chóng( khoảng 2 giờ trong khi đó các phương pháp nuôi cấy thông thường

khác cần ít nhất 24 giờ ) Trực khuẩn than (Bacillus ơnthracis) có Ihể được phát hiện nhờ xét nghiệm ELLA với lectin đậu tương (Glycin max L ) Ở

nước ta, Đỗ Ngọc Liên và cs đã sử dụng lectin chay Artocơrpus tonkinensis) để chẩn đoán bệnh sán máng (Schistosoma mansoni) [10]

Dựa vào khả năng phân biệt tê bào bình thường với tê bào ung thư, lectin

có thể được sử dụng để phối hợp chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư Đồng thời, một số lectin còn có khả năng nhận biết, sự khác biệt của glycoprotein màng của tế bào ung thư có khả năng đi căn thấp và tế bào ung thư có khả năng di căn cao, do đó lectin có thể được sử dụng trong theo dõi và tiên lượng bệnh [27]

• Trong dược học: lectin đùng làm thuốc tuy còn mới mẻ nhưng đã mở ra nhiều triển vọng trong lương lai Con A đã được sử dụng ỉàm chấl dẫn thuốc đưa thuốc tới tế bào đích Lectin đậu tương có khả năng ngưng kết tế bào tuỷ xương của người mắc bệnh ung thư dòng bạch cầu làm cho người bệnh không có hiện tượng thải loại mảnh ghép do đó tế bào tuỷ xương ghép phái huy được chức năng sản sinh dòng bạch cầu và hồng cẩu, kéo

dài thời gian sống cho bệnh nhân [27] Lectin từ hạt mít mật (Artocarpus heterophylìus) có khả năng tương tác đặc hiệu với phân tử glycoprotein

CD4 ở bề mặt tế bào lympho T của người, là phân tử kết hợp đặc hiệu với HIV trong pha đầu tiên của quá trình nhiễm bệnh, do đó có thể kìm hãm nhiễm HIV, hạn chế khả năng mắc bệnh Như vậy rất có thể leclin sẽ được

sử dụng làm thuốc điều trị AIDS mà loài người đang mong đợi Trong tương lai không xa hy vọng lectin sẽ trở thành một nguồn thuốodược liệu quí

13

2.2 VÀI N É T VẾ C O N C A N A V A L IN A VÀ CÂY Đ Ậ U R ỤA (C A N A V A LIA

E N S IF O R M IS 1< A B A C E A E )

2.2.1 Con canavalin A

• Về iịch sủ

Munk là người đầu liên lách lectin từ dịch chiết cua cây đậu rựa

(■Caiiavalìu ensiformis) bảng cách hấp phụ nó lên tế bao hồng cầu thỏ sau đó phán hâp phụ băng dung địch acid Ông gọi nó là phasin (1914) [31] 22 năm sau (1936), khi chấl dó được Sumner và Howell phân lập, Con A mới chính

thức trở thành tén gọi của lectin đậu rựa (Canavalia ensiformis) Con A là

lectin đầu tiên được tinh chế băng phương pháp sắc ký ái lực Con A gấn kêi với các geỉ dexlran có liên kêì chéo (Sephadex G50, G100 ) dùng làm pha tĩnh của cọt săc ký và được phán hâp phụ bằng glucose (Agrawall va Goldstein-1965,1967) hay bằng acid acetic (Olson và Liener-1967) Từ đó, bằng nhũng đặc lính sinh học điến hình của mình, Con A dã thu hút sự chú ý của nhiều,nhà khoa học, trớ thành loại leclin thực vậl nổi tiêng nhấl và được nghiên cứu nhiều nhấl ị28 ị

• Cấu trúc hoá học

- Cáu trú c bậc một: Trình tự acid amin của Con A đã được biếl khá đầy đủ Khi so sánh với trình lự acid am in của các lecún họ đậu khác (dậu

lương, đậu lens, đậu ịava ) người la đã phát hiện ra mộl điều thú vị là có

một sự giông nhau đáng kinh ngạc giữa chúng Chẳng hạn các aa từ vị uí 122 đến 137 giông các aa từ vị trí 1 đến 88 cúa lectin đậu tương, chuỗi a của đậu lens có các aa giống các aa từ vị trí 70 đến 119 và chuỗi p Ihì có các aa giông hệt các aa từ vị trí 120 của Con A Điều này phù hợp với giả thiết rằng lectin của các [oài thực vậl có họ hàng gần gũi có cấu trúc tương tự nhau Đó có thế

là dấu hiệu phân loại sinh vật ở mức độ phân tứ để nghiên cứu sự tiến hoá của chúng

- Cáu trúc không gian: Bâng phưưng pháp nhiễu xạ tia X người ta đã

xác định dược cấu trúc không gian của Con A (Eđelman và cộng sự-1972, Hardman và Ainworlh-1972) Con A là mộl protein hình câu có kích thước

42X 40 X 39 A°, được cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị không chứa các phân lử đường, giống hệt nhau, cổ khối lượng 26.000 Da Ngoài bốn tiểu đơn vị nguyên vẹn, ConA còn có 2 chuỗi polypeptid bổ sung có khối lượng 12.500 và 14.000 Da Mỗi tiểu dơn vị của Con A cuộn chặt tạo cấu trúc hình vòm Hai tiểu đơn vị kết hợp với nhau ở những đoạn gấp nếp (3 tạo thành cấu trúc đimer dạng ellipse Sau đó hai cấu trúc dimer lại liên kết sóng đôi với nhau để tạo thành cấu trúc Vclramer.

Hình 1 : Sơ đồ biểu diễn cấu trúc tetramer của Con A : Ca, Mỉ ì và s chỉ ra các vị trí của Ca ++7 Mn++ rà vị trí liên kết eỉường đặc hiệu tưong ứng

• Trung tâm hoạt động

Mỗi tiểu đơn vị của Con A có một trung tâm liên kết hydratcarbon được gọi ỉà trung tâm hoạt động VỊ trí của trung tâm liên kết này nằm từ acid amin

1 đến acid amin 45 Vị trí này được bảo tồn ở các lectin họ đậu khác [19] v ề mặt không gian các acid amin gần trung tâm hoạt động nhâì là Tyr 12 và 100, Asp 16 và 208, Asn 14, Leu 99 Ser 168 và Arg 288 Nhóm cacboxyl của những acid amin này đã được chứng minh Jà có khả năng tham gia vào cấu trúc của trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động cách vị trí gắn Ca ++ 7 A °

và cách vị trí gắn Mn++ 11 A°

15

Giữa các trung tâm hoạt động trên phân tử Con A có một khoảng cách tương đối Trong quá trình hoạt động các trung tâm này xích lại gần nhau, tương tác với nhau tạo ra điểm tiếp nhận hyđratcarbon.

• Một sô ứng dụng của ConA

ứ n g dụng đầu tiên của Con A là để khẳng định một polymer sinh học

có chứa đường trong cấu trúc phân tử hay không VD: dùng Con A để khẳng định bản chất glycoprotein của invertase nấm men, chứng minh thành phần có

hoạt tính enzym của F l- ATPase của Micrococcus lnleus không pliái là

ConA kết hợp với các chất chống ung thư như daunomycin (Kitao, Hattori-1977), chlorambucil (Lin và cộng sự-1981), methotrexate (Lin và cộng sự-1981, Tsuruo và cộng sự-1980) làm tăng độc tính của những chất này trên nhiều loại tế bào ung thư trong môi trường nuôi cấy [28]

Con A còn có khả năng ngưng kết tế bào ung thư ở nồng độ thấp Cơ chế của hiện tượng này có thể là do số lượng receptor trên màng tế bào ung thư nhiều hơn trên màng tế bào bình thường hoặc các receptor trên màng tế bào ung thư ở gần nhau hơn và bộc lộ nhiều hơn [28]

Tuy những thí nghiệm nói trên mới chỉ có kết quả ở qui mô phòng thí nghiệm, nhưng chúng cũng mở ra hy vọng trong tương ỉai không xa Con A sẽ trở thành loại thuốc hữu hiệu để điều trị căn bệnh hiểm nghèo này

2.2.2 Cây đậu rựa (Canavaliơ ensiformis L Fabaceae)

Đậu rựa (Cơnavơlia ensiformis) ở Việt Nam còn có tên khác là đậu rạ,

đậu ngựa, đậu tây Đậu rựa có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ Nó được trồng rộng rãi ở Nam Mỹ từ thời tiền sử và được phát hiện thấy trong khu khảo cổ ở Mêhicố với niên đại 3000 năm trước cổng nguyên Hiện nay nó được trổng

phổ biến ở các nước nhiệt đới.

Đậu rựa chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, làm pỉiAn bón Hạt của nó được sử dụng làm thức ăn hoặc nghiền nhỏ để uống cùng với cà phê ở một số nước Lá non và hoa của cây được dùng làm thức ăn ở Indonesia

Đậu rựa phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới ẩm, cổ khả năng chịu hạn tốt, thích hợp với nhiều loại đất, khả năng chống chill sau bệnh cao

Thời gian từ khi gieo hạt tới lúc thu hoạch là 170 ngày Năng suất hạt trung bình từ 800 đến 1000 kg/ha, trong điều kiện trồng trọt tốt, năng suất có thể lên tới 6000 kg/ha [35]

Ở nước ta đậu rựa mọc hoang nhiều trong các khu rừng ở miền Bắc Hạt của đậu rựa được nhân dân địa phương đùng để chế biến một số loại bánh Gần đây đậu rựa đã được các nhà khoa học Việt Nam chú ý đến bởi có chứa Con A, một lectin có nhiều ứng dụng, và bước đầu đã được nghiên cứu để gieo trồng và tỏ ra phát triển tốt Có thể trong tương lai đậu rựa Việt Nam sẽ trở thành một dược liệu quí, cung cấp một nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết Con A phục vụ cho nhiều công trình nghiên cứu khoa học cũng nhu' các ứng dụng thực tế khác

2.3 AFP

• Định nghĩa về AFP đã được cơ quan nghiên cứu ung thư của tổ chức y

tế thế giới đưa ra vào năm 1969: “ Alpha Fetoprotein là Alpha Globulin dầu tiên xuấí hiện trong huyết thanh động vật có vú trong quá trình phát Iriển và là protein huyết thanh chủ yếu trong giai đoạn sớm của thời kỳ bào thai Nó xuât hiện trong huyết thanh cơ thể trưởng thành trong một số tình trạng bệnh lý, đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào gan”

AFP người là một glycoprotein có trọng lượng phân tử vào khoảng

70.000 Da, trong đó carbohydrate chiếm khoảng 4% Điểm đẳng điện của AFP là 4,5 đến 5,2 Độ hấp thụ quang của đung dịch AFP 1% với chiều đàylcm ở bước sóng 278 nm là 5,3( E lcm =5,3) hằng số kết tủa của AFP là 4,5-5,3 và thời gian bán huỷ của AFP từ 3 đến 5 ngày

Ở phụ nữ có thai, hàm lượng AFP huyết thanh tăng nhiều vào tháng thứ 2

và thứ 3 của quí đầu khi có thai Hàm lượng AFP huyết thanh ở dây rốn trẻ sơ

sinh Vào khoảng từ 10.000 đến 100.000 ng/ml và nó giảm xuống chỉ còn dưới 10ng/ml 300 ngày sau khi sinh

Hàm lượng AFP huyết thanh đã được tìm thấy ở người lớn bình thường dao động từ 0,lng/ml đến 5,8 ng/ml

AFP được tổng hợp từ nhu mô UTBMTBG và gan bào thai hoàn toàn đồng nhất về mặt hoá sinh cũng như miễn địch học Người ta không thể phAn biệt được sự phân bố của các aciđ amin và đặc tính lý học của AFP bào thai với AFP ở ƯTBMTBG

• Cấu trú c chung cho một phân tử AFP ung thư người bao gồm: một acid amin (Asparagine) liên kết chuỗi phức hợp đường đôi Oligosaccharide Cấu trúc này được thể hiện qua các hình vẽ sau:

Gaipi - > 4 G l c N A c p i - > 2M anal \ Filed

a n p i- ► 4G clN A (31-> 4 G c lN A c p i-* ‘Asn

G a i p i - * - 4 G l c N A c p l - V 2Manal

H ình 2 : Câu trúc phân tử A F P ở U TBM TBG

C r a ip i-* 4 G lc N A c P l- > 2M anal ^ Fii^l

GlcN Acp 1 - ^ r la n p 1—► 4CiclN Ap 1 ► 4GclNAcị31 ~ ► Asn

G al[31-> 4 G lc N A c p i-> 2M anal

Hình 3 : Cấu trúc phân tử AFP ở ung thư túi tinh hoàn

Neu A c a 2 - 6 G a i p 1 ► 4GlcNAcP 1 ~ ► 2Mana 1.

j^IanP 1 -► 4GclNAP 1 “ ►4GclNAcP 1 —► Asn

N e u A c a 2 -> ốGa! p 1 - > 4CtIcN Acp ỉ-► 2Mana i

Dựa trên nhũng nghiên cứu về cấu trúc pliftn tử AFP người ở những bệnh

lý khác nhau và đựa trên kết quả nghiên cứu ái lực của AFP với những lectin khác nhau, các tác giả Yoshima H và cộng sự (1980), Yamashita K và cộng sự (1983) cho biết:

- Phân tử AFP ở UTBMTBG ngoài cấu trúc chung, còn có mặt của

nhóm fucose (Fucal —>6) và nhóm này đóng vai trò quyết định ái lực

của AFP với lectin, thể hiện ở dải băng AFP-L3.

- Phân tử AFP ở ƯTTNH ngoài cấu trúc giống như phân tử AFP ở

ƯTBMTBG còn có thêm N-Acetylglucosamine (GclNAc) Nhóm này

có ái lực trung gian với lectin thể hiện bằng dải AFP-L2

- Phân tử AFP ở bệnh gan mãn tính thì không có mặt của nhóm Fucose

và nhóm N-Acetyl glucosamine, do vậy không có ái lực với lectin, í hê hiện bằng dải AFP-L1

Sự có mặt và sự thay đổi các thành phần carbohydrate, mà cụ thể là sự thay đổi các nhóm Fucose và N-Acetylglucosamine có trong chuỗi đường của AFP sẽ quyết định tới ái lực của nó với lectin Ở những tình trạng bệnh lý khác nhau, sự chuyển biến từ bệnh gan lành tính (viêm gan mạn) sang bệnh gan ác tính (UTBMTBG) có liên quan chặt chẽ tới sự biến đổi cấu trúc phân lử AFP và có ảnh hưởng tới ái lực của AFP với lectin Do vậy, sự thay đổi trong cấu trúc đường của phân tử AFP là cơ sở để chẩn đoán phân biệl giữa UTBMTBG với các bệnh gan mạn tính

• ứng dụng của AFP ái lực lectin trong UTBMTBG [7]

Để nghiên cứu ái lực của AFP à các bệnh lý khíìc nhau với những lcclin

khác nhau người (a sử dụng kỹ thuật: Điện di ái lực lectin và thấm ái lực

kháng thể (Lectin affinity electrophoresis and blotting affinity antibody) Khi

chẩn đoán ƯTBMTBG người ta cũng sử dụng kỹ thuật này

Trong 8 loại ỉectin được ứng dụng trong điện di ái lực lectin thì Lens culinaris agglutinin (LCA) và Erylhroaggliitinaling phytohemagghĩlinin A (R- PHA) là hai lectin hay dược dùng hơn cả

19

AFP ái lực mạnh với Lens culinaris agglutinin (LCA) là AFP-L3 còn AFP

ái lực mạnh với Erythroagglutinating phytohemagglutinin A (E-PHA) là AFP- P4

Với tỷ !ệ AFP-L3 >15% được coi là dương tính thì độ nhạy, độ đặc hiệu

và tỷ lệ dự báo của test dương tính tương ứng là 76%,99%, 84,6%.VI vậy AFP-L3 là marker có độ đặc hiệu cao với ƯTBMTBG Với tỷ lệ ÁFP-P4

>14% được coi là đương tính thì độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dự báo của tesí dương tính tương ứng là 82%, 99,9%, 88,9% Như thế AFP-P4 cũng là một marker có độ đặc hiệu cao với UTBMTBG Khi sử dụng hai marker này cùng một lúc độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dự báo của test dương tính tăng lên rất cao: 95%, 99,7%, 99,6%

Việc xác định những marker đặc hiệu với ƯTBMTBG như AFP-L3 hoặc

AFP-P4 càng trở nên có ý nghĩa khi bệnh nhân UTBMTBG có AFP ở mức

bình thường, mức tăng nhẹ, hoặc mức tăng của AFP ở ƯTBMTBG tương đương với hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mãn tính Vì trong những trường hợp này mức AFP-L3 hay AFP-P4 vãn tăng có ý nghĩa

Do đó trong chẩn đoán UTBMTBG nếu chỉ đơn thuần dựa vào AFP huyết thanh, khả năng chẩn đoán sẽ bị hạn chế Nhưng nếu ta sử dụng kỹ thuật điện

di ái lực lectin và thấm ái lực kháng thể dể xác định tỷ lệ AFP-L3 và AFP-P4 thì độ nhạy, độ đặc hiệu sẽ tăng lên nhiều lần

Nhiều nghiên cứu đi sâu tìm hiểu vai trò của các marker AFP-L3 và AFP- P4 trong việc giám sát và phát hiện sớm ƯTBMTBG ở những đối tượng có nguy cơ cao như viêm gan mạn và xơ gan Người ta thấy rằng AFP-L3 và AFP-P4 thường dương tính 10 tháng trước khi u gan xuất hiện ở bệnh nhân viêm gan mạn và dương tính từ 3 đến 10 tháng trước khi 11 gan xuất hiện ở bệnh nhân xơ gan Như vậy AFP-L3 và AFP-P4 là những marker hữu ích đế phát hiện sớm ung thư gan từ những đối tượng có nguy cơ cao

Mối liên quan của AFP-L3 và AFP-P4 với đặc điểm ở ƯTBMTBG cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Tỷ lệ AFP-L3 và AFP-P4 thường tăng

cao ở ƯTBMTBG có độ biệt hoá thấp hoặc vừa so với tỷ lệ AFP-L3 và AFP- P4 ở UTBMTBƠ có độ biệt hoá cao Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ AFP-L3

và AFP-P4 không có mối liên quan với hàm lượng AFP huyết thanh, nhưng lại

có mối liên quan nhẹ đến kích thước khối u gan

Các marker AFP-L3 và AFP-P4 đã được dùng trong theo dõi và đánh giá kết quả điều trị ở bệnh nhân ƯTBMTBG Kết quả đã cho thấy có mối liên quan chặt chẽ giữa tỷ lệ AFP-L3 và AFP-P4 trước và sau điều trị với thời gian sống sau điều trị, thời gian tái phát ung thư và tiên lượng bệnh ở ƯTBMTBG Những bệnh nhân có AFP-L3 và AFP-P4 âm tính sau điều trị thường có tiên lượng tốt hơn so với bệnh nhAn có AFP-L3 và AFP-P4 dương tính sail điều trị

Cụ thể thời gian để tái phát ung thư dài hơn và thời gian sống sau điều trị dài hơn Tóm lại, AFP-L3 và AFP-P4 là những marker tốt để theo dõi tiên lượng bệnh ở bệnh nhân UTBMTBG sau điều trị

21

PHẨN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

3.L I Nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu là hạt của cây đậu rựa

(Canavalia ensiformis L Fabaceae) được thu hái tại vườn quốc gia Ba Vì -

Hà Tây, theo sự phân loại của GS Vũ Văn Chuyên, GS.TS Trần Công Khánh

và TS Nguyễn Đăng Khôi Sau khi thu hái, hạt đậu được rửa sạch, sấy khô ở

50°c, bóc vỏ cứng, nghiền thành bột, rãy qua rây 315 Bột hạt đậu được đựng trong lọ nút kín

Ảnh 1 í Hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L Fabaceae).

• Amoni sulfate (Trung Quốc)

• Coomassie Brillant Blue R250, Coomassie Brillant Blue G250 (Hãng Recinal - Hungari)

• Glucose monohydrat; Glycin (Hãng BDH Chemical Lid Poole - Anil)

• Sephadex G75 (Hãng Pharmacia Fine Chemical - Thụy Điển)

• Sepharose 4B; Tris - hydroxymethylaminoethan (Hãng Pharmacia Biotech

AB - Thụy Điển)

• Hồng cầu người thuộc các nhóm máu A, B, o lấy tại viện Huyết học và truyền máu Trung ương được chống đông bằng dung dịch ACD, rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý NaCl 9%0

Huyết thanh người bình thường và huyết thanh bệnh nhân UTBMTBG được lấy tại Khoa tiêu hoá, bệnh viện Hĩm nghị, được bảo quản bằng NaN^

• Máy ly tâm lạnh Biofuge 15R

• Máy ly tâm thường

• Máy đo quang phổ ƯV - VIS

• Máy điện di Hoffoe Small II (Mỹ)

• Máy đo pH 3305 Jenway (Anh)

• Máy đông khô Jouan LP 3

• Máy khuấy từ

• Cột sắc ký 2 X 10cm

23