Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan của nhân trần tía thái nguyên và tảo spirulina bình thuận

1. ĐẶT VẤN ĐỂ Việc tìm các thuốc bảo vệ gan có nguồn gốc từ dược liệu trong nước đang là vấn đề được quan tâm. Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Nhân trần và Tảo Spirulina. Kết quả cho thấy Nhân trần là vị thuốc bảo vệ gan, biểu hiện khá rõ hoạt tính chống oxy hoá invivo và in vi tro. Cũng như Nhân trần, tảo Spirulina với thành phần chủ yếu là protid, lipid, pcaroten, vitamin E cũng thể hiện rõ tác dụng bảo vệ gan. Nhữnỉỉ nguyên liệu cho các nghiên cứu này: Như Nhân trần thì thường là Nhân trần mọc hoang được thu hái về và được buôn bán ử các cơ sở kinh doanh. Với tảo Spirulina mọc hoang ở Hồ Ba Mẫu cũng đã được thu thập nghiên cứu. Hiện nay ở Thái Nuuyên có loại Nhân trần tía (Adenosmư caeruleiitn R.Br.) đã bắt đầu uieo trồng ử diện tích lớn và đang dự kiến qui hoạch thành một vùng nguyên liệu. Tảo spirulina ở Bình Thuận đã được Công ty nước khoáng Vinh Hảo nuôi trồng với sản lượng lớn và ổn định. Những yếu tố này sẽ trở nên quan trợng cho việc sản xuất một dạng thuốc bảo vệ gan sau này. Vì vậy trong khoá luận này chúng tôi có nguyện vọng thực hiện được mục tiêu: Khảo tính chất chống oxy hoá của dạng cao đặc Nhân trần tía ở Thái Nguyên, Tảo nguyên Spirulina ở Bình Thuận và dạng viên nén của 2 nguyên liệu này qua hai chỉ tiêu là HTCOH in vi vo và hàm lượng GSH gan chuột trên mô hình tiêm CCI4. Hy vọng với những kết quả thu được sẽ có một số thông tin 2 Óp phần cho các cơ sở sản xuất trong nước tham khảo, tạo ra một dạng bào chế có tác dụng bảo vệ gan, từ 2 n.suyên liêu này. 1

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Đ ược HÀ NỘI

Bộ môn Vô Cơ-Hoá lý

Thời gian thực hiện:

15/2/2000 -i 5/5/2001

ị

Ị

\

L è n e á m m

Em xin bầy tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy giáo:

TS Nguyễn Quang Thường PGS.TSKH Lé Thành Phước những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện khoá luận này Đổng thời em cũng xin chán thành biết ơn cô giáo Nguyễn Thị Thơm củng toàn th ể các thầy, cô trong bộ môn Vô cơ - Hoá lý đã giúp em hoàn thành khoá luận này.

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2001

Sinh viên

MỤC LỤC

Trang

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 TỔNG QUAN 2

2 1 Những nguyên nhân phát sinh bệnh g a n 2

2.2 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống oxy hoá (CCOH) trong cơ th ể 2

2.2.1 Sự hình thành các oxy hoạt động 2

2.2.2 Chất chống oxỵ hoá (CCOH) trong cơ t h ể — 3

2.2.3 Ảnh hưởng của các chất độc và tác nhân viêm hoại tử gan qua cơ chế gốc tự d o 4

2.3.Quá trình peroxyd hoá lipid (P O L ) 7

2.4.CƠ chế gốc tự do của các thuốc bảo vệ g a n 9

2.5.Một số nét về Tảo Spirulina, Nhân trần 11

3 THỤC NGHIỆM 14

3.1.Chọn đối tượng và phương pháp nghiên cứu 14

3.1.1 Chọn đối tượng nghiên cứu .14

3.1.2 Phương pháp, mô hình và nguyên vật liệu nghiên c ứ u 14

3 2 Kết quả thực n g h iệ m 18

3.2.1 Các kết quả khảo sát về phương pháp đ o 18

3.2.2 Kết quả nghiên cứu tính chất chống oxy hoá của cao đặc Nhân trần tía Thái N guyên 24

3.2.3 Kết quả nghiên cứu TCCOH của Tảo Spirulina ở Bình T huận 29

3.2.4 Kết quả nghiên cứu TCCOH của protecgan - một chế phẩm từ Tảo và Nhàn trầ n 31

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị 36

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

CCOH : Chất chốn2 oxy hoá

Nhữnỉỉ nguyên liệu cho các nghiên cứu này:

Như Nhân trần thì thường là Nhân trần mọc hoang được thu hái

về và được buôn bán ử các cơ sở kinh doanh

Với tảo Spirulina mọc hoang ở Hồ Ba Mẫu cũng đã được thu thậpnghiên cứu

Hiện nay ở Thái Nuuyên có loại Nhân trần tía (Adenosmư caeruleiitn

R.Br.) đã bắt đầu uieo trồng ử diện tích lớn và đang dự kiến qui hoạch thành

một vùng nguyên liệu Tảo spirulina ở Bình Thuận đã được Công ty nước khoáng Vinh Hảo nuôi trồng với sản lượng lớn và ổn định

Những yếu tố này sẽ trở nên quan trợng cho việc sản xuất một dạng thuốc bảo vệ gan sau này Vì vậy trong khoá luận này chúng tôi có nguyện

vọng thực hiện được mục tiêu: Khảo tính chất chống oxy hoá của dạng cao đặc Nhân trần tía ở Thái Nguyên, Tảo nguyên Spirulina ở Bình Thuận và dạng viên nén của 2 nguyên liệu này qua hai chỉ tiêu là HTCOH in vi vo và hàm lượng GSH gan chuột trên mô hình tiêm CCI4.

Hy vọng với những kết quả thu được sẽ có một số thông tin 2 Óp phần cho các cơ sở sản xuất trong nước tham khảo, tạo ra một dạng bào chế có tác dụng bảo vệ gan, từ 2 n.suyên liêu này

2 TỔNG QUAN

2.1 NHỬNG NGUYÊN NHÂN PHÁT SINH BỆNH GAN [9, 6]

Bệnh gan hiện nay vẫn là bệnh phổ biến trên thế giới, đặc biệt là những nước nhiệt đới như Việt Nam Bệnh san thườns bắt đầu từ viêm san cấp rồi chuyên sans viêm ean mạn, suy san, xơ oan và cuối cùng có thể dẫn tới une thư san

Các nguyên nhân phát sinh bệnh san rất phong phú như: viêm ean do virus Khi các virus vào san nó biên mội thành phần của tê' bào uan thành khánu nguyên hoặc sắn kháng nguyên lên hề mặt tế hào oan Khi đó cơ thể sản xuất ra các khánu thô’ chốns lại các khánu nguyên tạo ra phản ứns viêm.Viêm sjan hoại tử có thể do các chất độc xâm nhiễm vào cơ thể như: tetracloruacarbon(CCl4), Trinitrotoluol! (TNT: chất độc chiên tranh) và các thuốc như tetracyclin, Paracetamol INH, Rifaimycin, hoặc ethanol Khi vào

cơ thê dưực uan chuyển hoá tạo ra nhừnu chất độc, ìiày viêm hoại từ uan.Tinh trạne thiếu dinh dưỡn« kéo dài cùne dản đốn viêm £an hoại tử.Ncoài ra còn rất nhiều nguvên nhân khác có thể dẫn đến viêm gan như: viêm gan do amip, do viêm đườns mật, do tăna áp lực tĩnh mạch cửa

Quá trình viêm gan đã được nhiều tài liệu đề cập theo các cơ chế khác nhau Cơ chế sốc tự do của quá trình này được trình bày vắn tắt (V phần dưới đây

2.2 Sự HỈNH THÀNH CÁC DẠNG OXY HOẠT ĐỘNG VÀ HỆ THÔNG CÁC CHẤT CHỐNG OXY HOÁ TRONG cơ THE [1,3,10,12]

2.2.1 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động (DOHĐ)

2

Trone chuỗi hô hấp tế bào oxy nhận điện tử và kết hợp với hydro tạo thành nước,.Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế quanhiều giai đoạn và mỗi giai đoạn chỉ nhận một điện tử Oxy nhận điện tử đầutiên tạo thành sốc superoxyd (Oj~) Gốc này (0*~) bị SOD phân huỷ tạothành H202 theo phản ứng:

Binh thườns do kị và k2 rất lớn, nên chủ yếu sán phẩm của quá trình hô hấp tế bào là nước Tuy nhiên trone cơ thỏ’ vẫn tổn tại một lượng rất nhỏ H20 2

và OV" Đây là 2 chất có tính chất oxy hoá mạnh, do chuyển động nhiệt hoàn toàn nsẫu nhiên mà chúno va đập phản ứnu với nhau tạo ra '(), (oxy đơn hội )và §OH í sốc hydroxyl) Đây ỉà hai tiểu phàn có khả nănu phán ứnii rất cao Chún« tấn côns vào các tổ chức của cư thê tạo ra các gốc tự do mới như LO’, LOO

Các gốc tự do của oxy và các dạng oxy có khả nănu phản ứng cao như vậy được gọi là các dạng oxy hoạt động hay các oxydant

2.2.2 Chất chống oxy hoá trong cơ thể

Trong cơ thể có một hệ thống các chất trung hoà hoặc phân huỷ các dạng oxy hoạt động trên và được gọi là các CCOH hay các antioxidant bao gồm:

- Enzym Superoxydismutase (SOD)

Có 2 loại SOD: + MnSOD có ở ty thể

+ CuZnSOD có ở bào tương

Cả hai loại này đều phân huỷ đặc hiệu 0 ‘2 theo phản ứng (1).

- B-caroten ubiquinon và các chất tươns tự tồn tại ở dạns semiquinon (sốc hền) và có tác dụns bẫy các sốc tự do

- Các tác nhàn phức hoá các kim loại chuyển tiếp như sắt và đồng Bình thườns phản ứne của Oị với H202 tạo ra ‘02 và 'OH, xảy ra rất chậm (phản ứnt> Harber-Weiss), nhưns; khi cỏ mặt các kim loại chuyên tiếp ở trạng thái tự

do (F c '\ Cu+) thì phán ứnu xảy ra rất nhanh (khi đó dưựe nại là phản ứnu Fenton), sắt và đổng trong CƯ thế luôn tổn tại dưới dạng phức như Ferritin, Ceruloplasmin, Transferin

2.2.3 Ánh hưởng của các chất độc và tác nhân gâv vièm gan hoại tử qua

cơ chế gốc tự do.

2.2.3.1 Viém hoại tử gan do thiếu dinh dưỡng [15]

Khi trons khẩu phần thức ăn không đủ chất dinh dưỡng, đặc biệt là protid, sẽ thiếu các acid amin như cystein, methionin làm cho GSH và một

số chất bảo vệ san khác không được tổng hợp Khi đó tế bào gan sẽ bị hoại tử ,do cạn kiệt GSH là một chất chốns oxy hoá mạnh có khả năne cùns với GSHPO loại bỏ các peroxyd hình thành, ức chế quá trình POL ở tế bào san

A

Hàm lượns GSH trong cơ thể được coi là một chỉ tiêu đánh giá sức đề kháng và mức độ nhiễm độc của cơ thể.

Thiếu dinh dưỡng còn thiếu cholin làm cho gan không tổng hợp được phospholipid Khi đó mỡ tích tụ lại ở gan, tạo tiền đề cho quá trình POL sinh

ra nhiều sản phẩm độc

2.23.2 Viêm hoại tử gan do các chất độc xàm nhập vào cơ th ể [11,12,19]

Các hợp chất như tetracloruacarbon (CCỊị), trinitrotoluen (TNT), hợp chất nitro thơm, rượu hoặc các thuốc như paracetamol, tetracyelin, INH, riíầmycin Khi vào cơ thể , được gan chuyên hoá tạo ra nhiều sản phẩm trung

»ian có tính oxy hoá mạnh Các dạn« trung sian này làm tăng quá trình POL, giảm CCOH ở san làm cho các tê' bào gan bị hoại tử Một số chất điển hình được trình bày dưới đây

* Viêm gan hoại tử do CCl4

Các dẫn chất halogen và điển hình là tetracloruacarbon (CC14), khi vào cơ ihe được oan chuyển hoá như sau:

CC14 - > CC1Í +

C1-+0 2

V

CClịOO - > Cl2CO (phosaen)

Trước khi thành phosgen, CC14 được men ean (cytocrom P450)chuyển thành các dạng eốc tự do như CCI3, C1‘, CCI3OO gây huỷ hoại các tế bào gan thông qua quá trình POL

* Viêm gan hoại tử do các hợp chất nitro

Các dẫn chất nitro (R N 02) khi tới gan được chuyển hoá như sau:

Qua sơ đồ ta thấy từ R N 02 được men gan chuyển thành RN Oj , chất

này nhường điện tử cho oxy tạo gốc 0*2 và RNOÌ" lại trở về R N 0 2 Như vậy

không có sự khử thực sự nào mà các hợp chất này chỉ xúc tác cho sự hình

thành sốc 0*~ Từ gốc này sẽ hình thành '02 và 'OH làm tăng quá trình POL, gây phá vỡ màng tế bào (hoại tử tế bào gan)

* Viêm gan mạn do rượii

Khi ethanol vào gan, nó được men gan (cytocrom p450) chuyển hoá nhưsau:

hoá lipid trị vào các proteinNhư vậy sau khi được gan chuyển hoá, từ ethanol đã tạo ra các sản phẩm truns sian là các gốc tự do, làm cho quá trình POL tăng mạnh, đồng thời làm giảm lưựng GSH.VÌ các lý do này nên nếu ethanol được đưa vào cơ thể với một lượng lớn trong thời gian dài sẽ gây hoại tử các tế bào gan

* Tổn thương gan do Trìnitrotoluen (TNT)

Theo Zimmerman H.J., TNT là một chất thân mỡ và quá trình đào thải chúns ra khỏi cơ thê cần có thêm một nhóm phàn cực đê có thể hoà tan vào nước Quá trình chuyển hoá này xảy ra ở san và được hệ thốns men oxy hóa

6

đa chức năne (bao sồm: cytocrom p450, NADPH-cytocrom khử và phosphotidyl cholin), chuyển hoá tạo ra các sản phẩm trung gian và các gốc tự

do Những chất trung gian chuyển hoá tạo liên kết đồng hoá trị với các protein phân tử nhỏ của tế bào san gây tổn thương gan Những gốc tự do có hoạt tính oxy hoá rất cao, làm tăng quá trình POL trên các tổ chức màng tế bào gan Từ

đó một loạt các tổn thương gan xuất hiện như: thoái hoá hạt, thoái hoá rỗ, thoái hoá mỡ, hoại tử, u hạt, tăng sinh xơ

Ngoài ra một số thuốc như INH, Rifamycin, tetracyclin, halothan tương

tự như các hoá chất trên, khi qua gan được gan chuyển hoá tạo thành các dạng trung gian có tính oxy hoá cao, làm tăng quá trình POL sầy huỷ hoại tế bào gan Do vậy nếu duns các thuốc trên với liều cao kéo dài có thể dẫn tới nguy

cư viêm gan hoại tử •

2.3 QUÁ TRÌNH PEROXYD HOÁ LIPID (QT POL) [3,12]

Cơ thể nsoài nước ra thì phần lớn là các tổ chức màng có thành phần chủ yếu là acid béo chưa no và phospholipid Vì vậy khi các uốc tự do có khả nănu phán ứnu cao xuất hiện thì xác suất nhiều hơn chúnu sẽ tấn công vào các ihành phần lipitl của tổ chức many, gây ra quá trình peroxyd hoá lipid Đày là một phản ứng đặc trưng của iìốc tự do, xảy ra theo 3 giai đoạn sau:

2.3.1 Giai đoạn khơi mào

Khơi mào là giai đoạn tạo các peroxyd Tác nhân khơi mào thường là ‘o ,

và gốc 'OH (gốc hydroxyl) theo phản ứng:

LH + ‘02 -> LOOH

LH +- OH -» H20 + L- LOO- — > LOOH + Lị*

L: sốc acid béo; LOOH: peroxyd

Gốc Lj' lại cộna oxy và sau đó phản ứne tiếp với L2H cho ra L[OOH và

cứ như vậy các peroxvd tạo ra nhiều ở nưi có sốc ’OH và ‘0 2

2.3.2 Giai đoạn phát triển mạnh

Đây là giai đoạn chuyển tâm gốc tự do từ phân tử nàv sang phân tử khác theo cơ chế:

Gốc + Phân t ử - » Gốc mới + Phân tử mới

L2H

Lj + 0-) —^ LịOO* — -^ LịOOH + Lo*

Nhiều tâm gốc mới và mạch phản ứng mới xuất hiện do các peroxyd dễ dàng phân tách đồng ly tạo gốc mới như sau:

0- 0«

Gốc LOO* của acid arachidonic

chức màne bị ly giải tạo ra các sản phẩm aldehyd độc hại Đó là lý do giải

thích phản ứng gốc tự do xảy ra mãnh liệt ở các tổ chức viêm hoại tử

vit.E(OH)2 + 2LOO - ► vit.E(0 2) + 2LOOH

cơ chất, tức là tế bào bị phá huỷ hoàn toàn

2.4 Cơ CHẾ GỐC Tự DO CỦA CÁC THUỐC BẢO vệ GAN

2.4.1 Vitamin E (a-tocopherol) [1,12]

Cấu tạo phân tử vitamin E có mạch cacbon dài (R=C1 6H13) nên nó có thể hoà tan vào mỡ, sắn vào các tổ chức màng Vitamin E có khả năng phản ứng với các gốc tự do thứ cấp như L O O , LO' (là các gốc peroxyd) chuyển các gốc này về trạns thái không gốc, làm cho chuỗi phản ứng peroxyd hoá bị dập tắt Vitamin E còn trurm hoà ‘02 (oxy đơn bội) ngăn neừa sự khơi mào quá trình POL Mật khác vitamin E làm tăng lượnu GSH và tỷ lệ SH/S-S ở trong mans

tế bào gan, khi gây viêm san thực nghiệm bằne CC14 Do đó nhiều thuốc bảo vệ ean có chứa vitamin E.

2.4.2 Selen [2,1]

Vitamin E chuyến các gốc tự do như L O O , LO* về dạng peroxyd các peroxyd sẽ không phân huỷ đồng ly tạo gốc tự do được, bởi cơ thể có men GSHPO mà tâm hoạt động là selen cùng với GSH chuyển các peroxyd về dạng lipid theo phản ứng:

2GSH + LOOH - > 2GSSG + LOH + H20

GSHPONhư vậy Selen là một chất chống oxy hoá tham gia loại bỏ peroxyd.Nsoài ra Selen có còn tham gia xúc tác cho sự tổng hợp Co-Enzym Q Chất này có cấu tạo kiểu semiquinon có tác dụng trune hoà gốc tự do Trên thị trường cỏ nhiều thuốc chứa vitamin E và selcn như protecton, belaf, saylom được chí định cho dự phòng và điều trị các bệnh ở gan

2.4.3 Các flavonoid [16]

Các llavonoid là nhữno sắc tố phổ hiến rộnu rãi tron« thực vật chúng có mộl số tính chất sau:

+ Tham eia dẫn truyền điện tử

+ Tạo chelat với các kim loại do đó chúng khoá Fe2+, Cu2+ ở dạng phức ,làm cho những kim loại này mất khả năng xúc tác phản ứng Fenton, ngãn ngừa xúc tác cho sự đồng ly của các peroxyd; Do đó góp phần ngăn ngừa tạo gốc tự do và quá trình POL

+ Flavonoid có khả năng phản ứns với gốc tự do

Khi vào cơ thể, các flavonoid tồn tại ở dạng gốc bền Ở dạna này chúng

có tác dụng truns hoà các dạne oxy hoạt động, ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năn2 của tế bào san, Các Flavonoid còn bảo toàn hoạt độ các enzym tănọ cườns chức năne chốnc độc của ean, rmăn chặn sự phân huỷ phospholipid, nsăn chặn sự nhiễm mỡ và sự huỷ hoại nhu mô san

10

Do vậy trong các liệu pháp điều trị viêm gan cấp và mạn, xơ gan, một số Flavonoid đã được chỉ định dùng cho bệnh nhân với các biệt dược như cilymarin, carsil, cilibinin, ciliborun, fortex

2.5 VÀI NÉT VỀ NHÂN TRẦN VÀ TẢO SPIRULINA

2.5.1 Nhân trần

- Nhiều tài liệu công bố hiện nay ở Việt Nam [5,7] có ba cây m ans tên

Nhân trần thuộc chi Adenosma đang được sử dụng để điều trị bệnh ean theo

phương pháp y học cổ truyền, đó là:

+ Nhân trần: Adenosma caenileum R.Br Cầy này đã được hai danh y Việt

Nam là Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông ghi vào tác phẩm y học của mình

+ Nhân trần Bồ bổ: Adenosma indianum Lour.

+ Nhân trần Tây Ninh (chè cát, nhân trần cái ): Aclenosma bracteosum

Banati.

- Các nuhiên cứu trước đây về thành phần hoá học đều cho thấy rằng thành phẩn chính của Nhân trần cón Flavonoid: 0,1-5-0,15%,tinh dầu: 0,25-5-0,5% Neọài " 'òn có polyphenol, cumarin

- Cây Nhân trần tía Thái Nguyên (mẫu 1) với các đặc điểm như trons ảnh đã dược Hội thảo khoa học ở Thái Nguyên

và GS Vũ Văn Chuyên xác định là loại Nhân trần tía có tên khoa học

các cơ sở kinh doanh, các nghiên cứu thể hiện rõ TCCOH của dịch chiết hước Nhân trần và cũng đã chứng íỏ phần quyết định HTCOH chủ yếu là do Flavonoid [17] Theo kinh nghiệm của các lang y thì Nhân trần tía có tác dụng tốt hơn các loại Nhân trần khác 1,5 lần, mùi thơm đạc trưng hơn, có lẽ đây là điểm đáng chú ý nhất của loại Nhân trần tía.

Vitamin Bị 0,03%

Vitamin B6 0,31%

12

Với thành phần như vậy, tảo có tác dụng dinh dưỡng rất tốt cho heười và động vật.

* Gần đày, một loại tảo Spirulina mọc ở Hồ Ba Mẫu - Hà Nội cũng đã được nshiên cứu tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế gốc tự do [4, 6 , 18]

Có tác giả đã cố gắng chiết từ tảo ra các dạng khác nhau và thử tác dụng chống oxy hoá của các phân đoạn chiết Kết quả đều khảng định tác dụng tốt của Tảo Song hầu hết các dạng đều chiết bằng nước và loại tạp Vì vậy hầu như nhiều thành phần quí tan trone dầu như Vitamin E, 3-caroten không chiết được Mặt khác khi tiến hành sản xuất lớn thì việc chiết này sặp nhiều khó khăn tronẹ điều kiện nước ta hiện nay, đặc biệt trong khâu lọc loại tạp Một dạng chế phẩm của nước ngoài như "Phyto-spliat" của Nga, ở dạng viên nén cũng dùniì dạnu tảo ní>uyên.Vì vậy có ý kiến cho rằng sử dụng đạno tào nguyên thì có lựi cho sàn xuấl nhiều hơn

* N hìn chung:

/ - Môt số nnhiên cứu đều khẳng dinh Nhàn trần và Tảo có HTCOH bảo vêỊìan iron mổ hình thực ntihiệm vứi CC14

- Nguồn neuyên liệu cho các nuhiên cứu thường được cunu cấp từ các cơ

sở kinh doanh (Nhân trần) hoặc mọc tự nhiên (Tảo Spirulina)

- Đã dùns kỹ thuật phun sươns là một kỹ thuật tiên.tiến và chiết ở môi trườno acid, rồi loại tạp bằng than hoạt sau đó trung tính hoá Đây là cách tạo

ra một dạns nguyên liệu rất tốt, thể hiện rõ HTCOH Tuy nhiên nếu đưa vào sản xuất lớn thì rất tốn kém và khó thực hiện đặc biệt là khâu lọc trước khi phun sương đối với tảo Vì vậy trước mắt chúng tôi dùng dạng nguyên liệu: Dạns tảo nguyên ở Xí nehiệp nước khoáng Vĩnh Hảo Bình Thuận và dạng cao đặc của cây Nhân trần tía của Thái Neuyên cho các thí nehiệm

3.THỰC NGHIỆM

3.1 CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

3.1.1 Chọn đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi chọn hai Dược liệu là : Nhân trần tía Thái nguyên và Tảo Spirulina ở Bình thuận

- Cây Nhân trần tía ở Thái Nguyên trồng tới khi ra hoa, thu hoạch về nấu

thành cao đặc có hàm ẩm từ 15-20%, độ tro dưới 9°/(, hàm lượng flavonoid

có phiêu kiêm níìhiệm số: 991019

Đó là hai nguyên liệu được chọn đế đánh giá tác dụng chốns oxy hoá riêns biệt và chê thành viên nén protecsan theo công thức:

đánh giá sơ bộ TCCOH qua 2 chỉ tiêu MDA và GSH

3.1.2 Phương pháp, mỏ hình và nguyên vật liệu nghiên cứu

3.1.2.1 Mô hình nghiên cứu

Chuột thí nshiệm loài Swiss trọng lượns 18-ỉ-22o, ứns với 40-45 ngày tuổi được nuôi trons cùns điều kiện, lô chứns cho uốns nước cất, lò thử cho

Hảo:

0,15g 0,15g

14

uống chất thử là cao đặc Nhân trần tía Thái Nguyên hoặc tảo Spirulin Bình Thuận Tất cả các con chuột đều được tiêm dung dịch CCỊị 10% pha trone dầu thực vật và cách ly Hoàn toàn với thức ăn(Mh)Sau đó giết chuột thật nhanh lấy gan làm homogenat xác định MDA và GSH.

3.1.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá

3.1.2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp

Tiến hành peroxyd hoá acid béo chưa no ở một nhiệt độ và thời gian nhất định Phản ứn° này tạo ra sản phẩm là malonyl dialdehyd (MDA) Chất này phản ứng với acid thiobarbituric tạo ra phức màu hồng bền Đo mật độ quang của phức này ta biết được lượng MDA trong mẫu nhiều hay ít Mầu thử có chất chống oxv hoá (CCOH) thì lượng MDA thấp hơn so với mẫu chứng không có CCOH

HTCOH được biểu thị thành oiá trị phần trăm lượno MDA bị ức chế ở mẫu thừ so với mẫu chứng

Phản ứrm iiiừa M D A và acid thiobarbituric:

thuỷ ở t° = 100°c/15’ Để nguội đến nhiệt độ phòng, đo quang ử bước sóns A.max = 532nm Từ đó tính ra hàm lượng MDA với hệ số tắt mol

8= 1,5 6 x 1 0 5iM' 1 em'1

3.1.2.3 Phương pháp đo GSH [20]

Trons điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phươne pháp đo quane dựa trên nguyên tắc cho GSH trong dịch chiết tổ chức phản ứng với thuốc thử Ellman (5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic)) tạo phức màu vàng theo phản ứng:

Đo mật độ quang ở hước sóniỉ Ằ=412nm ta xác định được lượn 1 2 GSH tronti duno dịch

* Tiến hành xác định GSH

Tiến hành theo mổ hình nghiên cứu, sau khi giết chuột, lấy gan rửa sạch máu bằng nước muối sinh lýlạnh, cân một khối lượns gan trên cân chính xác

Tạo dịch đồns thể 9% với acid metaphosphorie 5%, thêm 0,4ml dung dịch

acid tricloacetic 20%, lắc đều, ly tâm 4000V/phút Lấy dịch sau ly tâm thêm 0,4ml NaOH 2,5% được dung dịch A(ddA), tất cả các thao tác đều tiến hành ở nhiệt độ 0-4°C sau đó hút chính xác 0,5ml ddA, thêm 4,5ml dune dịch gồm thuốc thử Ellman 0,lnm ol/lm l trone hỗn hợp đệm Na3PO_i 0,1M và EDTA

0.05M, để 2 phút ở nhiện độ phòns, tiến hành đo quans ở bước sóng X =

v _ C.õxKtlOOO , , ,

x = ~ nV O.Sxm (-L[g/g)

Trong đó -C : là hàm lượns GSH (uơ/ml) trong V mlddA

-m : khối lượng gan (mg)-V : thể tích dung dịch A (ml)

4.Ong nghiệm, dao, kéo, kẹp, bơm tiêm

5.Máy đo quang Trung Quốc 752

ó.Máy tạo dịch đổng thể Homogenize!' của Mỹ

* Động vật thí nghiệm : Chuột nhắt trắng loài Swiss