Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng aminazin trong huyết tương bằng huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay, trong điều trị bệnh tâm thần ở nước ta, chỉ định liều dùng chủ yếu dựa vào sự đáp ứng của thuốc với người bệnh và các triệu chứng trên lâm sàng, kinh nghiệm điều trị của bác sỹ. Biệt dược Aminazin có hoạt chất là Clorpromazin hydroclorid là một dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngoài ra còn có tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng serotonin. Cũng như các thuốc hướng thần khác, Clorpromazin có cơ chế tác dụng phức tạp hay gặp trường hợp ngộ độc thuốc, hcfn nữa trong thực tế điều trị các thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau có đáp ứng khác nhau với thuốc. Vì vậy phải theo dõi sát sao trong quá trình điều trị. Để đạt được kết quả tốt và hạn chế những tai biến có thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho mỗi bệnh nhân một liều điều trị phù hợp, cần phải theo dõi thường xuyên nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân. Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong dịch sinh học là sắc ký lỏng hiệu năng caoHPLQ, sắc ký khí, sắc ký khí gắn vói khối phổ, điện di mao quản... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo vói detector u v là phương pháp hay được dùng hơn cả do tính ưu việc nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế. Để có một quy trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh học, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như: cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng, quy trình xử lý mẫu, khoảng nồng độ khảo sát,... Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminaùn trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Với muc tiêu:

B Ộ Y T ẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

-TRẦN THỊ MINH NGHĨA

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHOÁ 2 0 0 2 -2 0 0 6 )

Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Kiều Anh

DS Nguyễn Trung Nghĩa

Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá phân tích và độc chất

Phòng thí nghiệp Trung tâm

Thời gian thực hiện : Từ tháng 3.2006 đến tháng 5.2006

£ Ờ 3 ^ ũ J jlL Ơ n i

Çî^miq thồi gian, Utựe kiịiL OỈL hơàn tíứuth Luận o A m ữề đầ tài:

"QlạhiẰTL eứu xAụ diỷnụ phuổnạ pjtáft định lườttg amÌMoxẦM trmtq, tujujA tường, íĩằttạ sẮa UẠ lấttạ lùẲtí nÚMjạ ea&" ^ òi đă nhận ituổíi n i ạiúp, it& qẮãẠ l%án eủxL eÓA ỉhẰụ, eầ ạiáiờ^ OỈL eÓA eú tt lĩở tnjù*L hjơÁ fdtcuL tíelLf phồng, iiú, nạhiỀm trunạ lăm Irưềtvạ, ^ ạ i hjMt (Dưổe 'Jôà Qljệi,

Çîôi XÙL l%àụ ỈẢ Lànụ lù â ổn ehâtt thòutli ixà iAu iẨe tê i ÇîhS

tmng, suiết qầiá trình UuỊe hiện, đề, tài.

^ ồl xin ehân thành eảnt ổ*t eÓA thầụ eầ gẦAớ^, eáe eán í%ặ tm mỗ*L hũá fihâjt tíeh, pUồtvạ th í nạhiỀm ừ ^tạ lăm, đă tọLờ^ ntọi đtềti UiệếL thuậtL lời đì l&i hjôỉuL thành khữá luận.

Çîùi eũnự, dàn ạửi lồ i ítảm ổ^t đỂn eAe ihầụ eê^ QÌájô^f eán- eárt íỉẠ

tớỉui tễ^ttònq, đã lận tình gẦAttg tLạự,f ụiúp đễ^ tề i ÌM ^Àỳng, qxtú, trinft hờ4í tậfL

tạ i trưềnjạ

QUkùn dịfL nàụ tồi eũnạ æÙL ạửi ÍM, eám ổtt tề i tùàếL thê luỊtí lĩề,

¿tầtiạ ẽiạhiỀệi ÜÁ nhữttạ nụưồi tkảni đã giáp, đs^ đmiạ, úiỈM tồi ữế ntợi tnặl

qxiá tífinh kjỢ^ tậfL ữà Lànt khôú luận, iụ i trưèng, ^ ẹ ù kạtt nữưốíi '3ÔCL

Qlệí.

'Jôà Qtội, nụăụ 15 IhÓLttg, 5 năm 200Ó

'3ôtư>, tùẾềt

^tần Q’hi /Hình OlạỉũíL

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng số liệu

Danh mục các hình

Đặt vấn đề

Phần I Tổng quan 3

1.1- Tổng quan về Clorpromazin (CPZ) 3

1.1.1- Công thức hoá học 3

1.1.2- Tên khoa học 3

1.1.3- Tính chất 3

1.1.4- Dược lý và cơ chế tác dụng 3

1.1.5- Dược động học 4

1.1.6-Chỉ định 4

1.1.7- Chống chỉ định 5

1.1.8- Thận trọng 5

1.1.9- Liều dùng và cách dùng 5

1.1.10-Các dạng bào ch ế 6

1.1.11 Các phương pháp định lượng 6

1.2- Tổng quan về HPLC 7

1.2.1- Khái niệm 7

1.2.2- Sắc ký phân bố pha đặc 7

1.2.3-Kỹ thuật HPLC 8

1.2.4- Hệ thống máy HPLC ỉ 0 1.2.5- Các phương pháp định lượng bằng HPLC 10

1.3- Một vài phương pháp nghiên cứu định lượng CPZ bằng HPLC 12

MỤC LỤC

1.4- Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học 14

1.4.1- Khái niệm 14

1.4.2- Nội dung thẩm định 14

Phần n Điều kiện thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu 17

2.1- Điều kiện thực nghiệm 17

2.2- Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1- Chuẩn bị mẫu 18

22.2- Khảo sát và tìm điều kiện chiết CPZ trong huyết tương 19

2.2.3- Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 21

2.2.4- Thẩm định phương pháp phân tích 21

Phần in Kết quả thực nghiệm và bàn luận 24

3.1- Xây dựng phương pháp định lượng 24

3.1.1- Khảo sát tìm điều kiện để chiết CPZIHT 24

3.1.2- Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc k ý 26

3.1.3- Thẩm định phương pháp phân tích 32

3.2- Bàn luận 39

Phần IV Kết luận và đề xuất 43

4.1- Kết luận 43

4.2- Đề xuất 44

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

DANH MỤC CÁC BẢNG

8 Kết quả khảo sát độ ổn định trong thời gian phân tích 38

9 Kết qủa khảo sát độ ổn định trong thòi gian bảo quản 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 2.1 Sơ đồ quy trình chiết CPZ trong huyết tương 20

2 3.1 Sắc đồ lựa chọn điều kiện chiết CPZ trong huyết

5 3.4 Phổ hấp thụ u v của CPZ trong dung môi pha động 29

7 3.6 Sắc đồ khảo sát tính chọn lọc của phương pháp 33

8 3.7 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích

CPZ/CBZ và nồng độ CPZ trong huyết tương

35

ĐẶT VẤN ĐỂ

Hiện nay, trong điều trị bệnh tâm thần ở nước ta, chỉ định liều dùng chủ yếu dựa vào sự đáp ứng của thuốc với người bệnh và các triệu chứng trên lâm sàng, kinh nghiệm điều trị của bác sỹ

Biệt dược "Aminazin" cĩ hoạt chất là Clorpromazin hydroclorid là một dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngồi ra cịn cĩ tác dụng an thần, chống nơn, kháng histamin và kháng serotonin Cũng như các thuốc hướng thần khác, Clorpromazin cĩ cơ chế tác dụng phức tạp hay gặp trường hợp ngộ độc thuốc, hcfn nữa trong thực tế điều trị các thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau cĩ đáp ứng khác nhau với thuốc Vì vậy phải theo dõi sát sao trong quá trình điều trị Để đạt được kết quả tốt và hạn chế những tai biến cĩ thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho mỗi bệnh nhân một liều điều trị phù hợp, cần phải theo dõi thường xuyên nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân

Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong dịch sinh học là sắc ký lỏng hiệu năng cao^HPLQ, sắc ký khí, sắc ký khí gắn vĩi khối phổ, điện di mao quản Trong đĩ, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo vĩi detector u v là phương pháp hay được dùng hơn cả do tính ưu việc nổi trội

về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế

Để cĩ một quy trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh học, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như: cột; dung mơi pha động; lưu lượng dịng; bước sĩng, quy trình xử lý mẫu, khoảng nồng độ khảo sát,

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminán trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao"

Với muc tiêu:

- Xây dựng điều kiện phân tích thích hợp để định lượng Aminazin trong huyết tương với quy trình chiết cho hiệu suất cao, quy trình sắc ký, khả năng tách, định tính và định lượng đồng thời loại phần lớn tạp cản trở trong mẫu phân tích.

- Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng, từ đó đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng Aminazin trong huyết tương

Chúng tôi hy vọng rằng kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở ứng dụng để xác định và đánh giá tương đưofng sinh dược học của Aminazin

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1- Tổng quan vê Clorpromazin (CPZ)

Biệt dược Aminazin có hoạt chất là Clorpromazin dùng dưói dạng muối: Clorpromazin hydroclorid

1.1.1- Công thức hoá học: [2][3][6]

- Công thức phân tử: C17H19CIN2S HCl; M = 355,5

Clorpromazin là dẫn chất của phenothiazin với tác dụng chính là hướng thần, ngoài ra thuốc có tác dụng an thần, chống nôn, kháng histamin và kháng serotonin

* Trên thẩn kinh trung ương.

- Tác dụng chính là an thần, chống rối loạn tâm thần thể hưng cảm, làm giảm hoang tưởng ảo giác thao cuồng, vật vã, làm mất các ý nghĩ kỳ lạ, tạo cảm

giác an dịu, lãnh đạm thờ ơ với ngoại cảnh và ức chế các phản xạ có điều kiện.

- Các tác dụng khác trên thần kinh trung ương:

+Gây hạ thân nhiệt do ức chế trung tâm điều nhiệt + Chống nôn

+ Gây hội chứng ngoại tháp khi dùng liều cao

*Trên Thần kinh thực vật:

- Giãn mạch ngoại vi và hạ huyết áp.

- Giãn đồng tử, táo bón, giảm tiết dịch, khô miệng, khô da, bí tiểu tiện

* Trên hệ tuần hoàn:

- Chậm nhịp tim, giãn mạch, hạ huyết áp.

* Còn có tác dụng trên hệ nội tiết, kháng hỉstamin.

Thuốc hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hoá Thuốc đạt nồng độ tối đa (Qax) trong máu sau khi uống 2-4 giờ Thuốc liên kết 95-98% với protein huyết tương Thuốc được chuyển hoá nhiều ở gan và bài tiết qua nước tiểu và mật ở dạng các chất chuyển hoá có và không có hoạt tính Thời gian bán thải (ti/2) khoảng 30 giờ Thuốc được phân bố rộng rãi trong cơ thể qua được hàng rào máu não và đạt được nồng độ trong não cao hcm trong huyết tưoỉng CPZ

và các chất chuyển hoá cũng qua hàng rào nhau thai và sữa mẹ

- Có tiền sử giảm bạch cầu hạt, rối loạn tạo máu, nhược cơ.

1.1.8- Thận trọng: [2]

- Người bệnh suy tim và suy tuần hoàn có nguy cơ đặc biệt bị các phản ứng không mong muốn của thuốc và cần hết sức thận trọng khi sử dụng thuốc CPZ cho những người có nguy cơ loạn nhịp

- Ngưòi bị sơ cứng động mạch, bệnh gan, bệnh thận, co cứng và động kinh cũng dễ bị các tác dụng có hại của thuốc

- Đối với người cao tuổi phải giảm liều do có nguy cơ cao với các tác dụng không mong muốn, thường chỉ dùng liều bằng 1/4 đến 1/2 liều người trưởng thành

- Các thuốc có tác dụng kháng cholinergic, đặc biệt có nguy cơ cao gây tác dụng có hại đối với hệ thần kinh trung ương ở ngưòi bệnh sa sút trí tuệ và người có tổn thương não

1.1.9-Liều dùng và cách dùng: [2]

- Liều lượng thuốc thay đổi tuỳ theo người bệnh và theo mục đích điều tĩỊ

- Clorpromazin không được tiêm dưói da vì gây hoại tử mô nặng

- Tiêm bắp pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,9%

- Liều lượng và hàm lượng thuốc tính theo Clorpromazin base

+ Điều trị bệnh loại tâm thần:

- Người lófn: uống 10-25mg/lần - 2-4 lần /ngày.

- Với viên nang giải phóng chậm 30-300mg; 1-3 lần/ngày

- Tiêm bắp khi có những rối loại nặng, bắt đầu từ 25-50mg, có thể tiêm nhắc lại trong 1 giờ và sau đó cách 3-12 giờ tiêm một lần, có thể tăng liều nếu cần

- Liều tối đa: Ig/ngày (đôi khi có thể tăng dần tới 2g trên ngày hoặc hcm trong thời gian ngắn)

- Trẻ em 6 tháng tuổi trở lên: 0,55mg/kg cân nặng /llần, uống cách 4-6 giờ hoặc tiêm bắp cách 6-8 giờ

+ Điều trị buồn nôn và nôn:

Người lớn 10 - 25mg X 4 lần/ ngày nếu cần

Trẻ em: tính theo cân nặng Từ 6 tháng tuổi trở lên: 0,55mg/kg thể

trọng X 4 - 6 lẩn/ngày.

+ An thần trước phẫu thuật:

Người lớn: 25 - 50mg; 2-3 giờ trước phẫu thuật

Trẻ em: 0,55mg/kg thể trọng; 2-3 giờ trước phẫu thuật

* Đối vói nguyên liệu

+ Phương pháp acid - base trong dung môi là acid acetic khan; dung dịch

chuẩn là HCIO4 0,1M phát hiện điểm tương đương bằng đo điện thế hoặc chỉ thị màu [5] [9]

+ Phương pháp acid base trong dung môi ethanol 96%; dung dịch chuẩn NaOH 0,1M pha trong nước hoặc ethanol; phát hiện điểm tương đương, đo điện thế [5] [9]

* Đối với các chê phẩm có chứa Clorpromazỉn

+ Phương pháp quang phổ UV: [9] [11] [15]

Chế phẩm được chiết và pha loãng bằng acid clohydic 0,1M để được nồng độ 50 |ag/ml Đo độ hấp thụ ư v ở bước sóng 254nm Tính kết quả dựa vào A (l% ,lcm) ở 254 là 915

Chuẩn nội: methyl paraben, propyl paraben

* Đối vái dịch sinh học: thường dùng phương pháp HPLC, sắc ký khí, điện di mao quản

1.2- Tổng quan về HPLC:

1.2.1-Khái niệm: [4][6]

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp HPLC là

kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tích các chất trên 1 pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chất lỏng được bao trên bề mặt

1 chất mang rắn đã được liên kết hoá học với 1 chất hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp thụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử

- Tùy thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc ký khác nhau Với khuôn khổ của khoá luận này chúng tôi chỉ đề cập đến sắc ký phân bố pha đảo

Sắc ký phân bố gồm có: sắc ký lỏng - lỏng

Sắc ký pha liên kết Trong sắc ký phân bố pha đảo, pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo nên dẫn chất Siloxan

Dãn chất siloxan

- Và R là nhóm ít phân cực như:

+ Octyl (Cg), Octadecyl (Cig), phenyl Dung môi phân cực như: methanol; acetonitril thì ta có sắc ký pha đảo

Trong sắc ký pha đảo: Các chất phân cực ra trước

Các chất ít phân cực và không phân cực ra sau

- Quyết định của sự tách các chất là tổng hợp các tương tác:

Chất tan - pha tĩnh Chất tan - pha động Pha tĩnh - pha độngTổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại

Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả tách tốt nhất vói nhiều đối tượng tách

* Hệ sô dung lượng k'

Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của quá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa 2 pha Sự phân bố này được đặc trưng bằng hệ số dung lượng k k được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất tan A trong pha tĩnh và pha động theo công thức sau:

k' =

Trong đó Qa(S) và Qa(M) là lượng chất tan A phân bố trong pha tĩnh và pha động.

Các chất trong hỗn hợp được tách và được pha động đẩy đến detectơ để phát hiện, tín hiệu đo được bộ phận ghi tiếp nhận và cho kết quả dưới dạng pic sắc ký Số liệu được xử lý cho các giá trị như: Thời gian lưu, diện tích pic, chiều cao pic, độ cân xứng của pic, độ phân giải của 2 pic liền kề, số đĩa lý thuyết của cột

Tùy theo tính chất, cấu trúc của chất phân tích mà người ta sử dụng các detectơ khác nhau để phát hiện như: huỳnh quang, u v - VIS, điện hoá Trong đó u v - VIS được dùng phổ biến nhất, vì nó đơn giản, khả năng ứng dụng cao, độ nhạy đáp ứng nhu cầu phân tích và kinh tế

* Thời gian lưu (tg): Retention time.

Thời gian lưu của 1 chất tính bằng (phút, giây) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc đồ

So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó

Trong đó: - W: chiều rộng của pic đo ở đáy pic

- Wi/2: chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.Yêu cầu cụ thể về số đĩa lý thuyết sẽ được quy định trong từng phép phân tích

Thông thường 1 cột sác ký dùng để phân tích thường có N > 1000 đĩa lý thuyết

Trong đó: - Ira ; írb là thời gia lưu của 2 pic liền kề của chất A và B

- ; Wß là độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B

■ W i /2( a ) i W j /2(B) là độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic cuả

chất A và B

Để tách riêng 2 chất, ít nhất Rs > 1,5 (khi 2 pic có độ lớn cùng cỡ)

Đáp ứng phân tích: chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất phân tích

Khi so sánh chiều cao hay diện tích pic trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử

Tất cả các phép định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất phân tích tỷ lệ với diện tích hoặc chiều cao của chất phân tích

Có 3 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký

* Phương pháp chuẩn ngoại:

10

Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó

cả 2 mẫu thử và chuẩn đều được sắc ký trong cùng điều kiện So sánh diện tích

pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử với mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các

chất trong mẫu Có thể sử dụng phưoỉng pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều

- Sx : diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử

- Sg: diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu chuẩn

- Chuẩn hoá nhiều điểm: tiến hành qua các bước sau:

Chuẩn bị 1 dẫy chuẩn vói nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các

đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn.

Vẽ đồ thị đưòfng chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích hoặc

chiều cao pic vói nồng độ của chất chuẩn, sử dụng đoạn tuyến tính của đường

chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định

Chú ý: độ lớn của diện tích pic mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính

của đường chuẩn

* Phương pháp chuẩn nội:

- Nguyên tắc: Thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn nội vào

mẫu thử và mẫu chuẩn có chứa chất phân tích rồi tiến hành sắc ký

11

- Chuẩn hoá 1 điểm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính bằng cách so sách tỷ số giữa chiều cao hay diện tích pic của chất phân tích với chuẩn nội trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

- Qiuẩn hoá nhiều điểm: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa tỷ lệ chiều cao hoặc diện tích của chất phân tích với chuẩn nội và nồng độ chất phân tích

* Phương pháp chuẩn hoá diện tích:

Hàm lượng % của 1 chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ % diện tích pic của nó so với tổng diện tích pic của các pic thành phần trên sắc đồ

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện và các thành phần đều có đáp ứng detertơ như nhau

Trong phân tích sinh dược học người ta hay sử dụng các tính kết quả theo phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm có dùng chất chuẩn nội

1.3 Một vài phương pháp nghiên cứu định lượng CPZ trong huyết tương.

Clorpromazin trong dịch sinh học có thể định lượng bằng nhiều phương pháp Nhưng phương pháp HPLC được dùng nhiều hơn cả,

Sau đây là một số phưoỉng pháp định lượng CPZ trong huyết tương

12

Bảng 1: Một sô nghiên cứu định lượng CPZ trong huyết tưoìig

Tài

Chất chuẩn nội

Isopropanol; n- pentan: dicloromethan (5 : 49 : 46)

Teit - butyl methyl ether

Zusuquidar.HCl 0,2ml/phút Detector huỳnh quang

bước sóng kích thích

và phát xạ là 260 và 460nm

Promazin l,5ml/phút Detector điên hoá ở

1.4- Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học: [1]

1.4.1- Khái niệm:

Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) là quá trình xác định bằng thực nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế

Mục đích của thẩm định phương pháp là xác nhận độ tin cậy của phép

đo trên mẫu thử cụ thể trong điều kiện đã xác định

1.4.2- Nội dung thẩm định:

* Tính chọn lọc - đặc hiệu:

Tính chọn lọc của phương pháp là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thử dùng khi tách và định lượng 2 hoặc nhiều thành phần trong 1 hỗn hợp của phương pháp đó

- Yêu cầu: + Mẫu trắng không được có đáp ứng của chất phân tíchhoặc chất chuẩn

+ Các chất khác nhau phải cho đáp ứng khác nhau và tách biệt

* Độ chính xác:

Độ chính xác của 1 phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quả riêng biệt khi phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu phân tích Độ chmh xác biểu thị bằng độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối

Độ chính xác gồm có:

- Độ lặp lại: Độ lặp lại được tính khi phép phân tích được lặp lại trong cùng một phòng thí nghiệm trong khoảng thòi gian ngắn và cùng một người phân tích

- Độ tái lặp: Độ tái lặp được xác định bằng cách lặp lại phép phân tích đó ở

cùng một phòng thí nghiêm, vói cùng một người phân tích, nhưng trong ngày phân tích khác

14

Là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được y và nồng độ đã biết

X của chất phân tích trong 1 khoảng nồng độ xác định

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi qui: y = ax + b

và hệ số tương quan tuyến tính r Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số r phải không nhỏ hơn 0,99

* Độ ổn định của chất phân tích:

Độ ổn định của chất phân tích trong mẫu sinh học, bảo quản trong điều kiện nhất định được theo dõi trong thời gian dài, cũng như trong quá trình phân tích Để đánh giá độ ổn định, người ta so sánh kết quả phân tích của mẫu bảo quản với mẫu mới chuẩn bị Kết quả phải sai khác không quá 5%

* Giói hạn định lượng: (LOQ)

- LOQ là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với

tính đúng và tính chính xác chấp nhận được

- LOQ được xem là nồng độ tại đó:

+ Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng.+ Pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20%

Ngoài ra còn có các những yêu cầu khác tuỳ theo loại phương pháp và đối tượng nghiên cứu

15

PHẦN II ĐIỂU KIỆN THỰC NGHIỆM• • •

+ Phần mềm điều khiển chromquest

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Máy li tâm điện Jouan (Pháp)

- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh)

- Tủ lạnh sâu Frigo (Đan Mạch)

- Máy siêu âm Bransonic (Mỹ)

- Máy lắc Labinco (Hà lan)

- Máy đo pH Metrohm (Thuỵ sĩ)

- Máy khuấy từ Ikamag

- Máy quang phổ Beckman DU - 640 (Mỹ)

- Bộ màng lọc, đầu lọc đường kính lỗ lọc 0,45|j,m; 0,2|im

- Các pipet tự động l-lOp-l; 10-100 ịủ; 100-1000|al.

- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, cốc đong, ống đong, pipet, đũa thủy tinh, ống nghiệm

2.1.2 Hoá chất - thuốc thử - chất chuẩn:

- Hoá chất, thuốc thử, chất chuẩn được trình bày ở bảng 2

Bảng 2: Danh mục hoá chất - chất chuẩn - thuốc thử

lượng

Hàmlượng

Hoá

chất

thuốc

thứ

Acetonitril Merck - Đức HPLC nhà sản xuất

Dicloromethan Merck - Đức HPLC nhà sản xuất

Isopropanol Merck - Đức HPLC nhà sản xuất

Natri carbonat Vel - Bỉ PA - Nhà sản xuất

18

độ CPZ từ 50|ag đến lOOO|0,g/ml pha động, cho 10 1^1 dung dịch ở mỗi nồng độ vào từng 500|iil huyết tương trắng để khảo sát và thẩm định phương pháp.

- Pha dung dịch chuẩn nội gốc CBZ (IS): cân chính xác một lượng chất chuẩn nội, hoà tan bằng MeOH sau đó pha loãng bằng pha động để được dung dịch chuẩn nội có nồng độ 2000|o,g/ml Cho 10|J,1 dung dịch gốc vào từng 500|li1 huyết tưcmg

2.2.2 Khảo sát và tìm điều kiện để chiết Clorpromazin từ huyết tương:

- Qua tham khảo các tài liệu đã công bố chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện để chiết CPZ từ huyết tương như;

+ pH huyết tương: Kiềm hoá bằng NaOH 2M

Kiểm hoá bằng hệ đệm carbonat 0,2M pH = 10,6.+ Thòi gian lắc xoáy: 5 - 1 0 phút

+ Loại dung môi chiết: cloroform, dicloromethan, và hỗn hợp hệ dung môi ( isopropanol: n-pentan-dicloromethan) tỉ lệ 5:49:46

Thể tích dung môi chiết 5ml, 7ml

+ Cách bay hơi dung môi: 40-50°C; 80°C; 100°c

Qua kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng được quy trình chiết CPZ trong huyết tương và được trình bày ở hình 2.1

CPZ trong huyết tương được chiết theo sơ đồ sau:

19

Lắc xoáy 30 giây

Huyết tương đã kiềm hoá

Hỗn hợp dung môi chiết (5ml)

A - Lắc xoáy 5 phút

Ly tâm 15 phút (3500 vòng/phút) Hút 4ml dung môi

Dịch chiết dung môi